專利名稱：高產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株的構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，特別涉及一種高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株的構建方法，并對該菌株發(fā)酵生產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的過程進行了優(yōu)化，S-腺苷蛋氨酸的產(chǎn)量可達4.37 g/L，達到工業(yè)化生產(chǎn)水平。
背景技術：
S-腺苷蛋氨酸英文名為S-adenosy Imethionine,簡稱SAM,化學名稱為5’ -[[(3S) -3-氨基-丙基]甲基-(S)-砜]-5’ -脫氧腺苷，分子式C15H22N6O5S,分子量為399。S-腺苷蛋氨酸是廣泛存在于生物體內的一種重要生理活性物質，具有轉甲基、轉硫基、轉氨丙基等作用，參與了體內40多種生化反應，與蛋白質、核酸、神經(jīng)遞質、磷脂質和維生素的合成密切相關，并連接多胺和谷胱甘肽的轉化。近年來的研究表明，S-腺苷蛋氨酸對肝病、抑郁癥、關節(jié)炎、纖維性肌痛、偏頭痛等疾病具有治療作用。(I)治療肝病。大量臨床研究證明，SAM對各種原因引起的肝功能異常有良好療效，包括各種原因引起的慢性肝炎、原發(fā)膽汁性肝硬化、藥物性膽汁淤積、妊娠性膽汁淤積等。(2)治療抑郁癥。與其他抗抑郁藥不同，SAM抗抑郁作用無計量相關性，起效快，幾乎無不良反應，耐受性好。(3)治療關節(jié)炎。與非類固醇類抗炎藥性比，SAM既不抑制前列腺素合成，也不會損傷胃腸道。(4)治療纖維性肌痛、偏頭痛。SAM可以使止痛藥用量降低，改善患者情緒。此外，SAM還可以治療阿爾茨海默氏癥、癲癇、帕金森氏病、亞急性脊髓變性以及HIV引起的神經(jīng)性并發(fā)癥等。目前，SAM主要從大腸桿菌、酵母、鏈霉菌中分離純化制得。但是由于SAM的表達量小，純化蛋白步驟煩瑣，SAM穩(wěn)定性差、易發(fā)生失活反應，產(chǎn)物得率低。尤其在國內，盡管很早就開始研究，雖然近幾年取得一定進步，但因技術水平較低、成本過高仍未能夠產(chǎn)業(yè)化，相關產(chǎn)品長期依賴進口，價格昂 貴，遠遠不能被普遍使用，嚴重阻礙了市場拓展，研究和開發(fā)新的制備方法已成為當務之急。采用基因工程和發(fā)酵工程相結合的方法將有望降低成本且能大規(guī)模生產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸。隨著基因工程技術的完善和發(fā)展，不斷地有新的基因工程產(chǎn)品面市，目前至少有50%以上的重組蛋白藥物是用基因工程技術生產(chǎn)的，如人胰島素、干擾素、白細胞介素-2、生長激素、粒細胞集落刺激因子、干細胞因子、表皮生長因子等。表達系統(tǒng)是基因工程及生物制藥研究和應用的重要內容，也是生命科學研究領域的熱點。畢赤酵母是單細胞低等真核生物，它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性，同時又具有適于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細胞內環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng)，有多種受體菌和表達載體可供選擇，可進行胞內表達或分泌表達，是良好的表達系統(tǒng)。SAM有著巨大的國際市場需求，據(jù)國際衛(wèi)生組織有關的報告:目前，全球每年用在治療肝病和帕金森氏病等疾病的SAM大約需要450-500t左右。SAM在國內的市場也非常廣闊。我國是肝炎流行的大國，而我國目前尚無一種真正改善肝細胞代謝的生物藥物。同時，隨著社會物質生活水平的不斷提高和社會競爭的持續(xù)加劇，患有脂肪肝等肝病患者的人數(shù)越來越多，抑郁癥人數(shù)也與日俱增，S-腺苷蛋氨酸的需求量將會日益增加。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株的構建方法。高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟:
(O從釀酒酵母基因組中PCR擴增出S-腺苷蛋氨酸合成酶基因sam2，連接至質粒PPIC9K中，得到真核表達載體pPIC9K-sam2，然后將其轉化到巴斯德畢赤酵母；
(2)從畢赤酵母基因組中PCR擴增出胱硫醚β合成酶基因cbs，將其亞克隆至載體PMD19T中，得到重組載體T-cbs ;將博萊霉素抗性基因zeocin導入重組載體T_cbs的胱硫醚β合成酶基因，得到cbs基因敲除質粒T-C-Z，酶切后獲得cbs基因敲除片段C-Z ；
(3)將片段C-Z轉化至步驟I所得的包含pPIC9K-sam2的巴斯德畢赤酵母，得到敲除cbs基因又強化sam2基因 的高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株。進一步地，步驟I中S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的擴增引物序列為:
SanfZ-Y:5’ -CAGGATCCACCATGACCAAGAGCAAAACT-3，
Sam2~R:5， -GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA-3，。步驟2中胱硫醚β合成酶基因的擴增引物序列為:
Cbs-F:5’ -TTCTGGAGCACATTGGAA-3’
Cbs-R:5’ -AGTGTATGCCTAGATGG-3’。步驟2中所述博萊霉素抗性基因從pPICZa-A中擴增得到，其擴增引物序列為: Zeocin-F:5’ -GGACTAGTAGACCTTCGTTTGTGC-3’
Zeocin-R:5’ -GGACTAGTCGGTTCCTGGCCTTTTG-3’。本發(fā)明的另一個目的在于提供通過上述方法所構建的高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株。本發(fā)明采用現(xiàn)代生物技術，構建了能夠高效表達釀酒酵母S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的重組載體以及敲除巴斯德畢赤酵母基因組中的胱硫醚β合成酶基因，再將該重組載體轉至表達量高，易于純化以及容易適應大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的巴斯德畢赤酵母中，構建高表達的SAM工程菌，并對該菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。為了提高S-腺苷蛋氨酸的產(chǎn)量，本發(fā)明首先將來自釀酒酵母的S-腺苷蛋氨酸合成酶基因(sam2)連接到表達載體pPIC9K中，再將該重組載體轉至表達量高、易于純化及放大的巴斯德畢赤酵母中，構建sam2基因強化菌株；同時，本發(fā)明將畢赤酵母中的胱硫醚β合成酶基因(cbs)連接至載體pMD19T中，構建重組載體T-cbs，再將博萊霉素抗性基因zeocin導入重組載體T-cbs的cbs基因，酶切后獲得cbs基因敲除片段C_Z，再將該片段轉至上述巴斯德畢赤酵母菌中，構建既強化sam2基因又敲除cbs基因的工程菌，以實現(xiàn)高效廉價SAM的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。在本發(fā)明優(yōu)化的條件下，S-腺苷蛋氨酸的產(chǎn)量可達4.37 g/L，達到工業(yè)化生產(chǎn)水平。


圖1表示包含sam2基因序列的的真核表達載體的構建。
圖2表示包含被敲斷cbs基因序列的的重組載體的構建。圖3表不發(fā)酵過程中菌株生物量和S-腺苷蛋氨酸產(chǎn)量的變化。圖4表示發(fā)酵罐中S-腺苷蛋氨酸的液相色譜圖。
具體實施例方式實施例1.重組表達載體pPIC9K_sam2的構建
利用引物 sam2-F:5’ -CAGGATCCACCATGACCAAGAGCAAAACT-3’ ；sam2-R:5’ -GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA-3 ’從釀酒酵母基因組中擴增出基因sam2，用EcoRl和BamHl分別雙酶切PCR擴增產(chǎn)物和PPIC9K質粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，用T4DNA連接酶連接回收的目的條帶，得到真核表達載體pPIC9K-sam2，用CaCl2法42°C熱激90秒將其轉化到大腸桿菌DH5a。利用Kana抗性篩選單菌落。所選轉化克隆經(jīng)PCR、酶切鑒定證明克隆正確后送大連寶生物公司測序。具體操作見圖1。實施例2.cbs基因敲除質粒T-C-Z及片段C-Z的獲得
利用引物 cbs-F:5，-TTCTGGAGCACATTGGAA-3，；cbs-R:5，-AGTGTATGCCTAGATGG-3’從畢赤酵母基因組中擴增出cbs基因，將其亞克隆至載體pMD19T中，得到重組載體 T-cbsο 利用引物 zeocin-F:5’ -GGACTAGTAGACCTTCGTTTGTGC-3，；zeocin-R:5’ -GGACTAGTCGGTTCCTGGCCTTTTG-3’ 從 pPICZ a -A 中擴增出 zeocin 基因，用分el 分別酶切PCR產(chǎn)物zeocin基因和重組質粒T-cbs，割膠回收后用T4DNA連接酶連接回收片段，得到cbs基因敲除質粒T-C-Z。經(jīng)PCR鑒定及酶切鑒定成功后，送大連寶生物公司測序。測序成功后，用fe7I和汝"/11雙酶切重組質粒T-C-Z，割膠回收2100bp大小的片段，命名為C-Z。具體操作流程見圖2。`實施例3.重組巴斯德畢赤酵母的轉化和篩選
將鑒定正確的重組表達載體pPIC9K-sam2質粒DNA經(jīng)內切酶極^/11021線性化處理，電擊轉化畢赤酵母GS115。電擊結束后，立即加入Iml預冷的lmol/1山梨醇，3000rpm離心5min，菌體重懸于400 μ I預冷的lmol/1山梨醇中，取200 μ I涂布于MD平板(1.34%ΥΝΒ, 4Χ10_5%生物素，2%葡萄糖，2%瓊脂糖)上，30°C培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。隨機挑取菌落點種到含不同濃度 G 418 (0，0.50mg/ml, 1.00mg/ml, 2.00mg/ml, 3.00mg/ml, 4.0Omg/ml)的YH)平板上，30°C培養(yǎng)2 5d，每天檢查菌落生長情況。根據(jù)生長情況快速篩選出G 418抗性較高的陽性克隆轉化子ZJGSU01。將C-Z片段分別電擊轉化畢赤酵母GS115和ZJGSU1，電擊轉化步驟同上，取200 μ I涂布含有zeocin、組氨酸和谷胱甘肽的MD平板，30°C培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，根據(jù)生長情況分別篩選出cbs基因敲除菌ZJGSU02和既敲除cbs基因又強化sam2基因的工程菌ZJGSU03。實施例4.重組菌株ZJGSU03發(fā)酵生產(chǎn)SAM的過程優(yōu)化
將菌株ZJGSU03接種于5 mL YH)液體培養(yǎng)基中，30°C，220 rpm振蕩培養(yǎng)16 h后，轉接于含100 mL YI3D液體培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中。以此作為發(fā)酵種子。將種子接種于2 L BMGY培養(yǎng)基中，在線滅菌并冷卻后，加入1.34% ΥΝΒ、4Χ1(Γ5%生物素和8 mL PTM1，用25%_28%的氨水調節(jié)PH至5.0，將種子液以5 %的接種量接種于5 L發(fā)酵罐中，溫度30°C，攪拌速度600印111，通氣量2.0 vvm。此階段流加氨水控制ρΗ5.0，溶氧20%左右。培養(yǎng)約18 h后，甘油耗盡，溶氧急劇上升，以100 mL/h的速度開始流加甘油(50%，含L-met 10 g/L, PTMl 12mL/L),約10 h后，菌體濕重大約達到200g/L時，停止流加。此階段控制pH5.0，溶氧20%左右。甘油停止流加后，碳源饑餓I h，以便酵母更好地利用甲醇。底物L-met的補加:根據(jù)響應面優(yōu)化的結果，L-met的補加量為1.0%，5 L罐補加的質量應為50 g，甘油流加階段已補充了 10 g左右，而誘導階段共持續(xù)96個小時，故剩下的40 g L-met每24 h加入一次，每次10 g，共4次。當碳源饑餓階段結束后，開始慢慢增加甲醇的補加量，直至溶氧量降到30%，固定此時的甲醇流加速度，一直以此速度流加至發(fā)酵結束。上述發(fā)酵過程菌株生物量的變化和S-腺苷蛋氨酸產(chǎn)量的變化如圖3所示，在上述條件下，S-腺苷蛋氨酸產(chǎn)量最高大
4.37g/L。發(fā)酵罐中S-腺苷蛋氨酸的液相色譜圖如圖4所示。 本技術領域中的普通技術人員應當認識到，以上的實施例僅是用來說明本發(fā)明，而并非作為對本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實質范圍內，對以上所述實施例的變化、變型都將落在本發(fā)明權利要求書的范圍內。
權利要求
1.產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟: (O從釀酒酵母基因組中PCR擴增出S-腺苷蛋氨酸合成酶基因sam2，連接至質粒PPIC9K中，得到真核表達載體pPIC9K-sam2，然后將其轉化到巴斯德畢赤酵母； (2)從畢赤酵母基因組中PCR擴增出胱硫醚β合成酶基因cbs，將其亞克隆至載體PMD19T中，得到重組載體T-cbs ;將博萊霉素抗性基因zeocin導入重組載體T_cbs的胱硫醚β合成酶基因，得到cbs基因敲除質粒T-C-Z，酶切后獲得cbs基因敲除片段C-Z ； (3)將片段C-Z 轉化至步驟I所得的包含pPIC9K-sam2的巴斯德畢赤酵母，得到敲除cbs基因又強化sam2基因的高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株。
2.按權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟I中S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的擴增引物序列為:SanfZ-Y:5’ -CAGGATCCACCATGACCAAGAGCAAAACT-3，Sam2~R:5， -GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA-3，。
3.按權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟2中胱硫醚β合成酶基因的擴增引物序列為:Cbs-F:5’ -TTCTGGAGCACATTGGAA-3’Cbs-R:5’ -AGTGTATGCCTAGATGG-3’。
4.按權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟2中所述博萊霉素抗性基因從PPICZa-A中擴增得到，其擴增引物序列為:Zeocin-F:5’ -GGACTAGTAGACCTTCGTTTGTGC-3’Zeocin-R:5’ -GGACTAGTCGGTTCCTGGCCTTTTG-3’。
5.權利要求1-4任一構建方法所構建的高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟從釀酒酵母基因組中PCR擴增出S-腺苷蛋氨酸合成酶基因sam2，連接至質粒pPIC9K中，得到真核表達載體pPIC9K-sam2，然后將其轉化到巴斯德畢赤酵母；從畢赤酵母基因組中PCR擴增出胱硫醚β合成酶基因cbs，將其亞克隆至載體pMD19T中，得到重組載體T-cbs；將博萊霉素抗性基因zeocin導入重組載體T-cbs的胱硫醚β合成酶基因，得到cbs基因敲除質粒T-C-Z，酶切后獲得cbs基因敲除片段C-Z；將片段C-Z轉化至步驟1所得的包含pPIC9K-sam2的巴斯德畢赤酵母，得到敲除cbs基因又強化sam2基因的高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的巴斯德畢赤酵母菌株。
文檔編號C12N15/09GK103087934SQ20121001218
公開日2013年5月8日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權日2012年1月16日
發(fā)明者于平 申請人:浙江工商大學