專利名稱：：一個類受體蛋白激酶基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了ー個類受體蛋白激酶基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：小麥白粉病是由小麥白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)引起的真菌性病害。小麥白粉病過去主要發(fā)生在冷涼、潮濕、多雨地區(qū)，近年來出現(xiàn)由南向北逐漸加重之勢，給小麥生產(chǎn)帶來了越來越嚴(yán)重的危害，在白粉病大發(fā)生的年份可使小麥嚴(yán)重減產(chǎn)。防治白粉病最經(jīng)濟(jì)有效的方法是使用抗病品種，但由于病原菌小種變化快，我國現(xiàn)有的部分品種已逐漸失去對白粉病的抗性。分離和鑒定新的抗白粉病基因，利用基因工程手段轉(zhuǎn)入感病品種，開展小麥抗病分子育種，可以提高小麥的抗病性。近年來抗白粉病基因研究工作進(jìn)展迅速，陸續(xù)有新基因被發(fā)現(xiàn)的報道。迄今己在小麥基因組的44個位點鑒定了60個主效的抗白粉病基因，并且大多數(shù)基因已經(jīng)被定位到具體的染色體或者染色體特定區(qū)段上(McintoshR，YamazakiY，DubcovskyJ，eta丄しatalogueoigenesymbolsforwneat[A」·In:AppelsR,EastwoodR,LagudahE,etaleds.ProceedingsofIlthinternationalwheatgenetsymposium.[C].Sydney,Australia=SydneyUniversityPress,2008)小麥抗白粉病基因共有兩類來源一類來源于普通小麥，包括Pmla、Pmle、Pm3、Pm5b_5e、Pm9、PmlO、Pml1、Pml4、Pml5、Pm23、Pm24、Pm28、Pm38和Pm39；第二類來源于小麥近緣種屬，包括Pmlb、Pmlc,Pmld,Pm2,Pm4a、Pm4b、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pml2>Pml3>Pml6、Pml7>Pml9、Pm20、Pm21、Pm25、Pm26、Pm27、Pm29、Pm30、Pm31、Pm32、Pm33、Pm34、Pm35、Pm36禾PPm37。來自四倍體提莫菲維小麥(Triticumtimopheevii,2n=4X=AAGG)2G染色體上的抗白粉病基因Pm6，在我國大部分地區(qū)仍表現(xiàn)為高效抗性，尤其是成株抗性強。以含有白粉病抗性基因Pm6的小麥材料做供體，與小麥品種Prins連續(xù)回交、自交，結(jié)合抗病性鑒定，培育出以“Prins”為背景的Pm6漸滲系IGVI465(紀(jì)劍輝，曹愛忠，王海燕，覃碧，王蘇玲，孔芳，陳佩度，劉大鈞，王秀娥。利用基于PCR的分子標(biāo)記區(qū)分普通小麥-提莫菲維小麥漸滲系。遺傳，2007，四(10)=1256-1262)ο本實驗室前期利用IGVI465和!3rins為親本，配制了遺傳作圖群體，利用該群體對Pm6進(jìn)行了精細(xì)定位。在遺傳作圖的基礎(chǔ)上，對Pm6所在區(qū)域與短柄草和水稻進(jìn)行了比較基因組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Pm6所在區(qū)域小麥、水稻和短柄卓具有民好的共線性(BiQin,AizhongCaoetal.Collinearity-basedmarkerminingiorthelinemappingofPm6,apowderymildewresistancegeneinwheat.TheorApplGenet.2011，123:201-218.)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種類受體蛋白激酶基因I^aLRR-RLK〗。本發(fā)明的另ー目的是提供該基因的表達(dá)載體。本發(fā)明的又一目的是提供該基因和表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2，來自普通小麥I^rins-提莫菲維漸滲系IGVI465，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。該類受體蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)TaLRR-RLK2，其氨基酸序列為SEQIDNO.2。含有所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2的表達(dá)載體。所述的含有權(quán)利要求1所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2的表達(dá)載體優(yōu)選以pBI220為出發(fā)載體，將權(quán)利要求1所述的iTaLRR-RLI^基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位點間所得。所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。所述的含類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2的表達(dá)載體在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明首次從小麥種克隆得到了一個類受體蛋白激酶基因TaLRR_RLK2及其所編碼的蛋白質(zhì)TaLRR-RLK2，為小麥中首次報道。將其插入表達(dá)載體pBI220，得到的該基因的過量表達(dá)載體導(dǎo)入感病小麥品種中，可以提高感白粉病小麥品種對白粉病的抗性。TaLRR-RLK2用于基因工程育種，將其導(dǎo)入易感白粉病小麥品種中，能夠獲得具備白粉病抗性的小麥種質(zhì)。圖lpBI220:TaLRR_RLK2超量表達(dá)載體圖譜圖2與白粉菌互作的表達(dá)⑶S基因的表皮細(xì)胞a白粉菌侵入⑶S表達(dá)的表皮細(xì)胞后未形成吸器；d白粉菌侵入⑶S表達(dá)的表皮細(xì)胞后形成吸器CO分生孢子；pp侵入釘；ha吸器；hy菌絲圖3利用瞬間表達(dá)研究Ta-LRR_RLK2基因?qū)ξ餍纬傻挠绊懞涂拱追鄄⌒?yīng)具體實施例方式實施例1含有Pm6的小麥IGVI465中ー個受白粉菌誘導(dǎo)的類受體蛋白激酶基因的克隆本研究的前期已完成了對Pm6的精細(xì)定位。在精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，對Pm6所在區(qū)域與短柄草和水稻進(jìn)行了比較基因組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Pm6所在區(qū)域小麥和水稻、短柄卓具有才民好的共線性(BiQin,AizhongCaoetal.Co丄丄inearity-basedmarkermimngiortnelinemappingofPm6,apowderymildewresistancegeneinwheat.TheorApplGenet.2011，123:201-218)。本研究在與Pm6所在區(qū)域具共線性的短柄草和水稻基因組序列中預(yù)測了一個富含亮氨酸的類受體蛋白激酶基因(LRR-RLK)，預(yù)測在小麥IGVI465的Pm6所在區(qū)域也存在一個與模式物種中的類受體蛋白激酶基因同源的基因，這個基因可能是Pm6基因的候選基因。根據(jù)水稻、短柄草的LRR-RLK基因，在外顯子區(qū)域上設(shè)計引物RLK-FTTCACGCCAATTTGAAAACA(SEQIDNO.幻和RLK-R:CGATATTGCAGGCCCATAGT(SEQIDNO.4)。因IGVI465在四葉期開始對白粉菌具有抗病性，推測其抗病基因的表達(dá)在四葉期才開始表達(dá)，所以為了從IGVI465中分離到抗病基因，對四葉期的IGVI465進(jìn)行了白粉菌誘導(dǎo)，即將感病材料上繁殖的白粉菌孢子直接從葉片上抖落到IGVI465的葉片上，并于白粉菌接種后M小時取葉片供RNA提取。以IGVI465在四葉期受白粉菌誘導(dǎo)的葉片所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以RLK-F和RLK-R為引物，進(jìn)行RT-PCR，獲得了ー個3000bp左右的基因片段。該基因片段與水稻和短柄草的LRR-RLK同源，預(yù)測為小麥IGVI465中的LRR-RLK基因，命名為I^aLRR-RLK〗。進(jìn)ー步根據(jù)TaLRR-RLK2的基因片段為模板，分別設(shè)計5’RACE和3’RACE引物，利用快速擴(kuò)增cDNA末端技術(shù)(RACE)，從IGVI465中克隆TaLRR-RLK2的5，端和3，端序列，進(jìn)而獲得iTaLRR-RLK的全長序列。5，RACE程序如下5，RACEouterprimer序列為"CCAGAAGAGATGAATCTCAAGAAAG，，(SEQIDNO.5),5'RACEinnerprimer序列為‘‘CCTTTCTTATGTCAAAGTTCTGCTC”(SEQIDNO.6)。以四葉期受白粉菌誘導(dǎo)的IGVI465的cDNA為模板，用5，RACEouterprimer和接頭外引物(CCAGAAGAGATGAATCTCAAGAAAG，SEQIDN0.13)進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，取1μ1第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR模板，用5’RACEinnerprimer和接頭內(nèi)引物(CCTTTCTTATGTCAAAGTTCTGCTC，SEQIDΝ0·14)進(jìn)行第二輪PCR，第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收產(chǎn)物并克隆測序，分離到5’端片段。3，RACE程序如下3，RACEprimer序列為“ATATATATGTCCAGGGTGAGCGTAA”(SEQIDΝ0·7)，通用引物AP序列為“GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTT”(SEQIDΝ0·8)。以IGVI465的cDNA為模板，以3，RACEprimer和AP為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收產(chǎn)物并克隆測序，分離到了3’端片段。分別根據(jù)上述5’和3’端片段設(shè)計全長擴(kuò)增弓I物TaLRR-RLK2-F(TAGAGCACCAGGCAGATAGCCA,SEQIDNO.鍆及iTaLRR-RLI^-R(ACTGCAMTCGTACGCGCGTCCAA，SEQIDN0.10)，以四葉期IGVI465受白粉菌誘導(dǎo)后的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收并克隆，獲得大小為3310bp的序列。序列分析顯示該序列包含ー個0RF，其中5，-肌1(非翻譯區(qū))4仙？、3'-UTR221bp、ORF(開放閱讀框)3045bp(SEQIDNO.1)，編碼1014個氨基酸(SEQIDNO.2)。經(jīng)SMART軟件(http://smart,embl-heidelberg.de/)分析，該基因編碼ー個跨膜蛋白，在N端具有M個氨基酸組成的信號肽，ー個由23個氨基酸組成的疏水跨膜域，胞內(nèi)含有ー個由268個氨基酸組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(S/TPK)。水稻基因注釋數(shù)據(jù)庫GAAS(http/Vricegaas·dna.affrc.go.jp/)分析發(fā)現(xiàn)該基因在胞外有11個富含亮氨酸重復(fù)(LRR)，具有這種蛋白結(jié)構(gòu)的基因為富亮氨酸重復(fù)的類受體蛋白激酶(LeucineRich-RepeatReceptor-LikeKinases,LRR-RLKs)，將該基因命名為TaLRR-RLK2。實施例2TaLRR_RLK2基因瞬間表達(dá)載體的構(gòu)建以經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)的IGVI465中克隆的I~aLRR-RLK2基因cDNA為模板，使用引物對RLK-ATG-BamHI-F(CGGGATCCATGGGGCGGAGGAGGCA,SEQIDN0.11)和RLK-TGA_KpnI-R(GGGGTACCTCAACGGCCTTCGTCCA,SEQIDNO.12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段。用BamHI和KpnI對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物插入到BamHI和KpnI雙酶切后的載體pBI220((JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.LrJSfusions:beta_glucuronidaseasasensitiveanaversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907.))TaLRR-RLK2置于35S啟動子后面的多克隆位點處。由此將目標(biāo)基因TaLRR-RLK2克隆到強啟動子35S的下游，獲得表達(dá)載體pBI220:Ta-LRR-RLK2(圖1)。經(jīng)測序驗證，表明載體構(gòu)建成功。實施例3利用瞬間表達(dá)方法將TaLRR_RLK2基因轉(zhuǎn)入小麥葉片瞬間表達(dá)方法是ー種可靠且快速鑒定基因功能的方法(ktiweizer，Pokornyetai.ATransientAssaysystemfortheFunctionalAssessmentofDeiense-RelateaGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999，12:647_654.)。*石if究利用瞬間表達(dá)方法，將質(zhì)粒DNA包裹到金屬微粒外層，借助基因槍將金屬微粒和基因轟擊到小麥葉片的表皮細(xì)胞，然后統(tǒng)計轟擊TaLRR-RLK2細(xì)胞的白粉菌吸器指數(shù)與未轟擊TaLRR-RLK2細(xì)胞的白粉菌吸器指數(shù)，明確目標(biāo)基因是否具有白粉病抗病功能。載體DNA與金屬微粒包裹的程序如下制備鎢粉稱取30mg的鎢粉于1.5mleppendorf管中，加入Iml70%酒精，渦旋3-5min后靜置15min，使鎢粉完全沉淀。12000rpm離心Imin后棄上清。加入ImlddH20水，渦旋混勻后，離心棄上清(重復(fù)三次)。最后加入500μ150%甘油渦旋混勻，以備用。包裹子彈吸取5μ1渦旋均勻的鎢粉于1.5ml的印pendorf管中，加入5μ1質(zhì)粒DNA(總量應(yīng)為lyg)。邊渦旋邊向印pendorf管內(nèi)滴加50μ12.5ΜCaCl2，然后加入20μ10.IM亞精氨(現(xiàn)配先用)，渦旋;3min。靜置Imin后離心2s，棄上清。加入140μ170%酒精，充分渦旋，離心ム，棄上清。然后加入140μ1100%酒精，充分渦旋，離心2s，棄上清。最后加入15μ1100%酒精，充分渦旋，以備使用。實施⑶S基因單轉(zhuǎn)化時，將含有⑶S基因表達(dá)載體pAHC25(ChristensenAH，QuailPH.Ubiquitmpromoter-basedvectorsfornigh—levelexpressionοιselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)的質(zhì)粒DNA與鎢粉包裹；當(dāng)實施TaLRR-RLK2與GUS基因共轉(zhuǎn)化時，將含有TaLRR-RLK2基因表達(dá)載體pBI220:TaLRR-RLK2的質(zhì)粒DNA與含有GUS基因表達(dá)載體PAHC25的質(zhì)粒DNA按摩爾濃度11的比例混合，包裹鎢粉。當(dāng)⑶S基因與TaLRR-RLK2基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)化時，Marker基因⑶S轉(zhuǎn)入的細(xì)胞也是iTaLRR-RLI^轉(zhuǎn)入的細(xì)胞。因⑶S基因表達(dá)的細(xì)胞經(jīng)染色整個細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，所以本研究以藍(lán)色細(xì)胞作為TaLRR-RLK2的表達(dá)細(xì)胞?；驑屴Z擊程序如下剪下長約6cm的小麥幼苗葉片端部，平行貼在載玻片上，每張玻片貼6片葉片左右?；驑屖褂肞DSIOOO/He系統(tǒng)，采用1350psi的可裂膜片，真空度為^inHg。轟擊后將葉片置于墊有潤濕濾紙的瓷盤內(nèi)，罩以打有小孔的保鮮膜，保濕并透氣，18-20°C恢復(fù)培養(yǎng)4h后，高密度接種白粉菌分生抱子。接種4后用GUS染液(配方為0.lmol/LN￡i2HP04z/NaH2zP04緩沖液(ρΗ7·0)，含10mmol/LEDTA，5mmol/L鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀，0.lmg/mlX-Gluc,0.1%TritonX_100，20%甲醇，)真空滲透10min，37°C染色12h,然后用70%酒精脫色2天直至葉片變成白色為止，最后利用濃度為0.6%的考馬斯亮藍(lán)對白粉菌孢子染色。實施例4TaLRR_RLK2抗病功能的分析白粉菌侵入小麥葉片表皮細(xì)胞后，在表皮細(xì)胞中產(chǎn)生的指狀物稱為吸器。吸器不能正常產(chǎn)生是葉片細(xì)胞對白粉菌具有抗性的重要指標(biāo)。在⑶S表達(dá)的細(xì)胞中，吸器會被⑶S染色液染成藍(lán)色，在顯微鏡下容易辨認(rèn)(圖幻。在GUS基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，通過統(tǒng)計與白粉菌互作的⑶S表達(dá)細(xì)胞中，吸器形成的細(xì)胞所占的比例(％)，即為“吸器指數(shù)”(khweizer，Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentoiDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999，12:647-654.)。吸器指數(shù)越小，表明抗病性越強。本研究利用“吸器指數(shù)”作為抗病強弱的衡mfefeo權(quán)利要求1.類受體蛋白激酶基因iTaLRR-RLI^,其特征在于核苷酸序列為SEQIDNO.1。2.權(quán)利要求1所述類受體蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)TaLRR-RLK2，其特征在于氨基酸序列為SEQIDNO.2。3.含有權(quán)利要求1所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的表達(dá)載體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的含有權(quán)利要求1所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的表達(dá)載體是以PBI220為出發(fā)載體，將權(quán)利要求1所述的TaLRR-RLK2基因插入PBI220的BamHI和KpnI酶切位點間所得。5.權(quán)利要求1所述的類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求3或4所述的含類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的表達(dá)載體在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一個類受體蛋白激酶基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用。類受體蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的cDNA序列為SEQIDNO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO.2。該基因來自普通小麥Prins-提莫菲維漸滲系IGVI465，為在小麥中首次報道。通過瞬間表達(dá)將該基因轉(zhuǎn)化感病小麥品種Prins，結(jié)果表明TaLRR-RLK2的過量表達(dá)可以降低Prins的吸器指數(shù)。因此，TaLRR-RLK2可望用于基因工程育種，將其導(dǎo)入易感白粉病小麥品種中，有望提高小麥的白粉病抗性。文檔編號C12N15/54GK102533812SQ20121001242公開日2012年7月4日申請日期2012年1月16日優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日發(fā)明者劉洋洋,曹愛忠,王海燕,王秀娥,肖進(jìn),覃碧,邢莉萍,陳婷婷申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)