專利名稱：小金海棠MxHA5蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種小金海棠MxHA5蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鐵是人體所必需的礦質(zhì)元素。因?yàn)橹参锸鞘澜缛衰碇饕氖秤描F來源，所以植物含鐵量低了直接會影響人類的身體健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，近20億人口遭受著貧血的折磨。早產(chǎn)、先天性缺陷病、智力發(fā)育遲緩和健康指數(shù)下降主要是由貧血引起的。研究表明，植物只能吸收土壤中的可溶性鐵-Fe (II)，但在堿性土壤(pH7. 4 8.5)中，可溶性鐵的濃度不到I(TltW)I *L-1，導(dǎo)致許多植物表現(xiàn)出缺鐵脅迫癥狀。植物輕度缺鐵會導(dǎo)致葉綠素合成減少和光合速率降低，嚴(yán)重缺鐵導(dǎo)致葉綠素合成停止，新葉變黃， 生物量大幅度下降。弄清鐵吸收和自動調(diào)節(jié)機(jī)能的分子機(jī)理，對改善植物和人類的營養(yǎng)失衡具有重大意義。為了有效地吸收和利用土壌中的鐵，植物在長期的進(jìn)化過程中對缺鐵形成了廣泛的適應(yīng)性。Romheld和Marschner教授在總結(jié)前人研究工作的基礎(chǔ)上首先提出了高等植物在長期適應(yīng)缺鐵脅迫過程中所形成的兩種適應(yīng)性機(jī)理——機(jī)制I和機(jī)制II。機(jī)理I植物指雙子葉植物和非禾本科單子葉植物。它們對缺鐵的適應(yīng)性反應(yīng)分為形態(tài)學(xué)變化和生理學(xué)變化。形態(tài)學(xué)上的變化包括形成大量的側(cè)根和特異的轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞， 這兩種變化都可以增加植株發(fā)生氧化還原反應(yīng)的表面積，并提高植株對鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。 生理學(xué)上的變化由三個(gè)部分組成一個(gè)狗(111)還原酶系統(tǒng)、一個(gè)強(qiáng)有力的質(zhì)子外泌泵 (H+-ATPase)和有機(jī)物質(zhì)的分泌系統(tǒng)。這三個(gè)部分都位于形態(tài)上特化的根尖表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜上，并有效地對缺鐵脅迫發(fā)生反應(yīng)。機(jī)理I植物必須先將狗(III)還原為!^e(II) 才能被吸收利用。在供鐵充足的條件下，植物的根部先將狗(III)-螯合物還原，把還原得到的 ^(ΙΙ)通過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)；在缺鐵脅迫條件下，機(jī)理I植物通過激活一種特異的 H+-ATPase使土壌酸化，從而增加鐵的可溶性；同時(shí)分泌一些有機(jī)酸(鐵的鰲合劑)，將土壤中的!7e(III)以狗(111)-螯合物的形式溶解；然后通過細(xì)胞質(zhì)膜上一種特異的根部還原酶將!^e(III)-螯合物還原。這種還原酶催化電子從胞質(zhì)中還原態(tài)的吡啶核苷酸(NADH)跨膜傳遞給胞外作為電子受體的狗(III)-螯合物，使其還原成為狗(II)，然后再由質(zhì)膜上的 Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入根細(xì)胞。機(jī)理II植物僅指禾本科植物。禾本科植物在堿性土壤中生長時(shí)與雙子葉植物和非禾本科植物相比發(fā)生的缺鐵失綠癥狀很少，原因是禾本科植物分泌和釋放高鐵載體，高鐵載體與鐵結(jié)合形成載體復(fù)合物，并在質(zhì)膜上產(chǎn)生ー種對植物鐵載體復(fù)合物具有高度親和力的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，從而使禾本科植物可以有效地吸收和利用三價(jià)鐵來對抗環(huán)境中的鐵脅迫。高鐵載體為麥根酸類(MAs或!^)，這是ー類低分子量的非蛋白質(zhì)氨基酸，對狗(111)有著強(qiáng)烈的親和能力井能形成穩(wěn)定的、八面體的三價(jià)鐵鰲合物，并在質(zhì)膜上產(chǎn)生ー種對む或 MAs具有高度親和カ的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YSL，由YSL將狗(III) -Ps轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)中，從而使禾本科植物可以有效地吸收和利用三價(jià)鐵來對抗環(huán)境中的鐵脅迫。
植物細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATPase屬P型ATPase，是質(zhì)膜上的插入蛋白，具有利用水解ATP 產(chǎn)生的能量，將細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的H+泵到質(zhì)膜外側(cè)的特征，簡稱為質(zhì)子泵。它對植物細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、細(xì)胞內(nèi)的PH的調(diào)節(jié)、氣孔運(yùn)動的調(diào)節(jié)、細(xì)胞伸長生長的調(diào)節(jié)和環(huán)境脅迫的調(diào)節(jié)等生理過程有重要的調(diào)節(jié)作用。此外，植物質(zhì)膜H+-ATPase還參與種子萌發(fā)、細(xì)胞極性生長等生理過程的調(diào)節(jié)。植物細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATPaSe是植物生命活動的“主宰酶”。自從Hodges 等在離體質(zhì)膜中證實(shí)AIPase活性以來，質(zhì)膜H+-ATPase的研究受到了廣泛的重視。有研究表明，缺鐵條件下，黃瓜根系H+-AIPase活性升高，也會誘導(dǎo)黃瓜根系頂端細(xì)胞H+-AIPase蛋白和H+-ATPase的mRNA的增加。并且研究得出在缺鐵黃瓜的根部CsHAl 基因的轉(zhuǎn)錄水平提高了，而給缺鐵植株在重新供鐵以后CsHAl基因的轉(zhuǎn)錄水平會下降。目前，已經(jīng)從擬南芥中發(fā)現(xiàn)了 12個(gè)H+-AIPase基因家族(AHA1 AHA12)。研究發(fā)現(xiàn)其中有5 個(gè)基因的表達(dá)受缺鐵脅迫的影響。在缺鐵脅迫下，其中AHA2和AHA7的表達(dá)量上調(diào)分別為 3. 3和4. O倍，AHA3和AHA4的表達(dá)量上調(diào)約2倍，AHAll的表達(dá)量下調(diào)約2倍。小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)是ー個(gè)蘋果鐵高效基因型，屬于機(jī)理I植物。雖然已經(jīng)有很多研究證明H+-AIPase基因?qū)μ岣咧参锏哪托杂泻艽笞饔茫?但還未見關(guān)于小金海棠中質(zhì)膜H+-ATPase基因的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種小金海棠MxHA5蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自小金海棠，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物中P型H+-ATPase酶活性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.ー種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物中P型H+-ATPase酶活性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的DNA 分子1)序列表中序列2自5’末端第1至觀62位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2、所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在干所述重組表達(dá)載體是如下(I) 或(II)(I)在PEZS-NL載體的多克隆位點(diǎn)間插入權(quán)利要求2或3所述基因得到的重組表達(dá)載體；(II)在PYES2.0質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)間插入權(quán)利要求2或3所述基因得到的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權(quán)利要求5的(II)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入酵母中得到的重組菌。
7.ー種獲得轉(zhuǎn)基因生物的方法，為如下①或②或③①將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)氤霭l(fā)生物中，得到P型H+-AIPase酶活性増加的轉(zhuǎn)基因生物；②將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)氤霭l(fā)生物中，得到對金屬離子脅迫的耐逆性増加的轉(zhuǎn)基因生物；③將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)氤霭l(fā)生物中，得到對金屬離子缺乏的耐逆性増加的轉(zhuǎn)基因生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述生物為酵母，權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求5的(II)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)生物。
9.權(quán)利要求1所述蛋白，或權(quán)利要求2或3所述基因在培育轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用；所述轉(zhuǎn)基因生物的P型H+-ATPase酶活性和/或?qū)饘匐x子脅迫的耐逆性和/或?qū)饘匐x子缺乏的耐逆性高于出發(fā)生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小金海棠MxHA5蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自小金海棠，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物中P型H+-ATPase酶活性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的MxHA5基因?qū)τ谌辫F脅迫的植株具有很重要的調(diào)節(jié)作用，本發(fā)明為進(jìn)一步研究小金海棠的耐缺鐵性提供了很好的理論依據(jù)。本發(fā)明對于培育耐逆植物具有重大價(jià)值。
文檔編號C12N9/14GK102559631SQ201210012499
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者張倩, 張新忠, 槐心體, 王憶, 許雪峰, 韓振海 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)