專(zhuān)利名稱(chēng)：擬南芥絲氨酸羧肽酶類(lèi)蛋白基因scpl41及其突變體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種擬南芥絲氨酸羧肽酶類(lèi)蛋白基因SCPL41及其T-DNA插入突變體在培育耐受正丁醇脅迫、對(duì)脫落酸不敏感、對(duì)鹽脅迫敏感、而且種子個(gè)體顯著小于野生型擬南芥的種子的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中往往會(huì)受到各種生物或非生物因子的脅迫。植物在接收到外界脅迫信號(hào)之后，會(huì)及時(shí)調(diào)整自身的代謝或物質(zhì)含量來(lái)響應(yīng)外界信號(hào)。膜脂是生物膜的骨架成分，而且能在磷脂酶的催化作用下水解后產(chǎn)生的產(chǎn)物來(lái)參與多種生理過(guò)程以及環(huán)境刺激引起的細(xì)胞反應(yīng)。轉(zhuǎn)移磷脂?；磻?yīng)(transphosphatidylation)是指,在磷脂酶 D (phospholipaseD, PLD)的催化作用下,甘油磷脂的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂，并把磷脂的磷脂?；D(zhuǎn)移到伯位醇上或者水上，從而生成磷脂酰醇或者磷脂酸的反應(yīng)。磷脂酶D (phospholipase D，PLD)廣泛存在于哺乳動(dòng)物的組織與細(xì)胞中，催化其主要底物磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC),所生成的直接和間接產(chǎn)物磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和二脂酰甘油(diacylglycerol, DAG)與溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)均是重要的第二信使物質(zhì)。這條生化通路被認(rèn)為是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一。但是在短鏈伯位醇(從甲醇到正庚醇)存在的情況下，PLD優(yōu)先催化PC與短鏈伯位醇發(fā)生轉(zhuǎn)磷脂酰基反應(yīng)(transphosphatidylation)產(chǎn)生穩(wěn)定的磷脂酰醇(phosphatidyl alcohol)和水,從而抑制了 PA的生成，也就阻止了 PA的進(jìn)一步代謝以及響應(yīng)信號(hào)的進(jìn)一步向下傳遞。由于PLD的轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)這一特性，研究者們通常使用醇類(lèi)物質(zhì)作為PA經(jīng)PLD途徑生成的抑制劑來(lái)探究PLD的功能，而且此反應(yīng)體現(xiàn)出許多生物學(xué)作用。轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)在動(dòng)物中的生物學(xué)作用主要體現(xiàn)于利用轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)探究乙醇對(duì)動(dòng)物組織或器官的傷害機(jī)制和PLD在傷害過(guò)程中的作用，以及對(duì)轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)異常引起的疾病的致病機(jī)理研究。在乙醇的浸入下，動(dòng)物細(xì)胞中大量的磷脂發(fā)生轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)，形成磷脂酰乙醇(phosphatidylethanol, PtdEt), PtdEt被認(rèn)為是造成磷脂代謝混亂的原因之一。PtdEt可通過(guò)增加膜流動(dòng)性而改變膜的物理化學(xué)特性，它對(duì)與膜相連的兩種酶有相反的作用，削弱NaVK+-ATP酶的活性，而增強(qiáng)5核苷酸酶的活性。PtdEt還可作為磷脂酰絲氨酸的取代物激活大腦PKC Y，從而改變?cè)械募せ钅Ｊ健6tter等(2000)發(fā)現(xiàn)乙醇和正丁醇抑制了 PKC活性、阻斷了 PLD信號(hào)通路，造成大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖受阻。這一發(fā)現(xiàn)將有助于揭示酗酒引起的胚胎發(fā)育不良的原因。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果及推測(cè)暗示著由PLD介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)可能是導(dǎo)致由乙醇引發(fā)的疾病的起因。另外，PLD催化PC與甘油二酯發(fā)生轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)生成的bis-PA與激活人類(lèi)纖維原細(xì)胞血管緩激肽有關(guān)；山梨醇的不正常積累引發(fā)了轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)，生成磷脂酰-山梨醇，而這種異常的磷脂的產(chǎn)生改變了膜脂質(zhì)體的代謝，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生；而轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)異常還可能是導(dǎo)致的糖尿病心肌癥及心肌缺血再灌注損傷的原因。盡管在植物和微生物中，轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)的生物學(xué)作用仍沒(méi)有得到具體的體現(xiàn)，但隨著研究工作的深入和一些有意義的現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)的生物學(xué)作用正漸漸的得到挖掘。Waltonand Goldfine (1987)發(fā)現(xiàn)梭菌屬PLD催化的轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)與膜磷脂重建有關(guān)。Dhonukshe等(2003)用正丁醇處理煙草BY-2細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)導(dǎo)致了細(xì)胞骨架重組，且不同來(lái)源的PLD具有不同的轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)的潛能，PLD同功酶對(duì)底物具有立體選擇性。這些都暗示著以犧牲重要信號(hào)物質(zhì)-磷脂酸(PA)為代價(jià)，而發(fā)生轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)，這一機(jī)制必定具有重要的生理作用。在植物中，一般認(rèn)為水的含量比羥基化合物高50倍時(shí)，轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)仍然存在很高的活性。PLD在一些微生物中表現(xiàn)出更高比例的轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)活性。來(lái)自甘藍(lán)中的PLD2和來(lái)自鏈霉菌(Sti^ptomyces sp.)的PLD表現(xiàn)出相似的水解能力，但在同樣的處理下，鏈霉菌PLD催化磷脂酰膽堿(PC)轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺(PE)的能力比甘藍(lán)PLD2高出24倍，而鏈霉菌PLD幾乎沒(méi)有水解產(chǎn)物磷脂酸(PA)生成。盡管如此，研究者還是在一些微生物和動(dòng)物PLD上發(fā)現(xiàn)了有意義的現(xiàn)象。色褐鏈霉菌(Streptomyceschromo-fuscus) PLD是一種|丐離子依賴(lài)型酶,且轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)能力較弱。但以天然存在的羥基化合物甘油二酯作為受體底物時(shí)，在色褐鏈霉菌PLD的催化下發(fā)生了·轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)，反應(yīng)形成的新磷脂(磷脂酰-醇)可以直接被PLD再水解而生成PA。而鈣離子能夠引起含PA、磷脂酰絲氨酸及心磷脂等帶負(fù)電荷磷脂脂質(zhì)體膜問(wèn)的融合。因此，由于轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)的發(fā)生使PA的量相對(duì)減少，進(jìn)而促進(jìn)了水解反應(yīng)的發(fā)生，而水解反應(yīng)產(chǎn)物的PA在鈣離子的作用下與寄主細(xì)胞的脂質(zhì)體問(wèn)發(fā)生膜融合，所以由色褐鏈霉菌PLD催化的這一系列反應(yīng)促進(jìn)了細(xì)菌和寄主細(xì)胞之間的膜融合，可以看出，磷脂酰-醇的生成有助于細(xì)菌侵染真核細(xì)胞。另外，微生物和植物PLD作為生物催化劑在磷脂合成工藝中廣泛應(yīng)用。這類(lèi)研究主要集中在PLD的催化反應(yīng)效率，底物結(jié)構(gòu)和反應(yīng)體系的影響，轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)和水解反應(yīng)比，以及PLD在細(xì)胞外的穩(wěn)定性等。微生物PLD的發(fā)現(xiàn)使轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)用于規(guī)模化合成磷脂成為了現(xiàn)實(shí)。80年代起，國(guó)外的學(xué)者紛紛報(bào)道了利用PLD的轉(zhuǎn)移磷脂酰反應(yīng)制備和合成高純度的多功能特性的單一磷脂及稀少磷脂，如肌醇磷脂、卵磷脂、絲氨酸磷脂、甘油酰磷脂、心磷脂、磷脂酰葡萄糖、磷脂酰-D-絲氨酸。在醫(yī)藥工業(yè)中，利用PLD的堿基轉(zhuǎn)移活性可將一些多肽、核苷和多糖類(lèi)藥物通過(guò)配位鍵連接在磷脂載體上，制成具有特殊療效的脂質(zhì)體。利用PLD還可合成一些抗腫瘤試劑，從而為抗腫瘤藥物的酶法合成開(kāi)辟了新的方向。通過(guò)篩選抗正丁醇的突變體可以更直接有效的找到正丁醇脅迫的作用靶點(diǎn)，對(duì)進(jìn)一步解析轉(zhuǎn)移磷脂酰基反應(yīng)發(fā)生機(jī)制以及生物學(xué)意義提供更為直接的證據(jù)。而bis4突變體就是在正丁醇脅迫下而得到的正丁醇不敏感突變體，通過(guò)TAIR-PCR鑒定和測(cè)序分析，得到突變體 bis4 屬于 SCPL41 (serine carhoxypeptidase-like 41, SCPL41)基因功能缺失型突變體。目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明絲氨酸羧肽酶蛋白以及絲氨酸羧肽酶類(lèi)蛋白在許多逆境響應(yīng)過(guò)程中都起到調(diào)控作用。絲氨酸羧肽酶(seine carboxypeptidases, SCP)是一類(lèi)真核生物蛋白水解酶,亞基分子量40000 75000Da，主要存在于動(dòng)物的溶酶體和植物或真菌的液泡中。在酸性pH環(huán)境下，它們同時(shí)具有C末端蛋白水解酶、酯酶和脫酰胺酶的活性，參與多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾與降解等多個(gè)重要環(huán)節(jié)。植物絲氨酸羧肽酶功能的研究主要集中種子萌發(fā)過(guò)程中的儲(chǔ)藏蛋白的轉(zhuǎn)換和動(dòng)員、細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中細(xì)胞成分的自溶、油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、種子發(fā)育、植物次級(jí)代謝的?；D(zhuǎn)移等。絲氨酸羧肽酶類(lèi)蛋白是與SCP氨基酸非常相似且與SCP蛋白同屬Sc族羧肽酶中的SlO家族。SCPL氨基酸序列在中部區(qū)域的保守型較高，N-末端與C-末端的保守型較差。SCPL蛋白均具有I個(gè)細(xì)胞內(nèi)分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)肽，多個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)以及4個(gè)底物結(jié)合和催化作用的進(jìn)化保守區(qū)域等SCP典型結(jié)構(gòu)特征。SCPL基因在參與種子萌發(fā)中儲(chǔ)藏蛋白的水解、細(xì)胞程序性死亡中細(xì)胞成分的自溶、種子發(fā)育、抗逆境等諸多過(guò)程中起作用。在擬南芥54個(gè)SCPL基因中有4個(gè)家族成員BRS1/SNG1/SNG2及CBPX已被克隆，基因表達(dá)分析結(jié)果暗示它們屬于擬南芥正常發(fā)育所必須的功能基因。Fraser等人發(fā)現(xiàn)擬南芥SCPL中的3個(gè)基因SNGl、At2g23000和At2g23010分別編碼芥子?；咸烟堑拿?。這些酶的?；荏w底物是一些變化相對(duì)較小的氨基酸殘基，它與羥基肉桂酸的酯代謝有關(guān)。Lehfeldt等人也發(fā)現(xiàn)擬南芥SCPL的SNGl與芥子蘋(píng)果酸的合成苯丙次生代謝產(chǎn)物有關(guān)。同時(shí)，Weier等人最近發(fā)現(xiàn)，絲氨酸羧肽類(lèi)蛋白是一個(gè)可修飾植物天然產(chǎn)物的新?；D(zhuǎn)移酶團(tuán)體，并且SCPL?；D(zhuǎn)移酶主要使用O-葡萄糖酯作為?；w。目前已從雙子葉植物中鑒定了幾種SCPL ?；D(zhuǎn)移酶，包括可能與野生型番茄抗蟲(chóng)性有關(guān)的葡萄糖聚酯合成所需的酶及擬南芥紫外線保護(hù)有關(guān)的芥子酯合成所需的酶。另外，Stehle等對(duì)植物代謝中的絲氨酸羧肽酶類(lèi)蛋白酶的結(jié)構(gòu)和底物識(shí)別的研究表明，絲氨酸羧肽酶酰基轉(zhuǎn)移酶SCT不一定需要結(jié)合帶電荷的底物，可以使用多種醇作為底物，形成的芥子堿在苗期發(fā)育過(guò)程合成卵磷脂，并促進(jìn)種子成熟過(guò)程中膽堿的形成。據(jù)報(bào)道，SCPL41基因在擬南芥中的所有器官中都有表達(dá)，而在花器官和種子中的表達(dá)量最聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供擬南芥絲氨酸羧肽酶類(lèi)蛋白SCPL41基因及其T-DNA插入突變體bis4在抗正丁醇脅迫、響應(yīng)鹽脅迫、調(diào)控種子大小以及響應(yīng)脫落酸等方面的應(yīng)用，為利用轉(zhuǎn)移磷脂?；磻?yīng)合成新磷脂、研發(fā)脂質(zhì)體藥物、研究與脂類(lèi)代謝相關(guān)疾病等提供了新的方向。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施擬南芥基因SCPL41在培育抵抗醇類(lèi)物質(zhì)脅迫以及改變轉(zhuǎn)移磷脂酰基反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥基因SCPL41在培育響應(yīng)脫落酸的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥基因SCPL41在培育耐受鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥基因SCPL41在培育以收獲種子為主的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥基因SCPL41在制備和合成高純度多功能特性的單一磷脂或稀少磷脂中的應(yīng)用。擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在培育抵抗醇類(lèi)物質(zhì)脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在培育響應(yīng)脫落酸的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在培育耐受鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在培育以收獲種子為主的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在制備和合成高純度多功能特性的單一磷脂及稀少磷脂中的應(yīng)用。上述的應(yīng)用是基于bis4突變體可以提高植物對(duì)醇類(lèi)物質(zhì)的耐受性；SCPL41基因參與ABA的響應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，SCPL41基因缺失型突變體bis4對(duì)O. 1-10 μ M的ABA不敏感；突變體bis4對(duì)鹽脅迫敏感；突變體擬南芥bis4的種子顯著小于哥倫比亞野生型擬南芥的種子。擬南芥基因SCPL41及其突變體bis4在抗醇類(lèi)脅迫、響應(yīng)脫落酸、響應(yīng)鹽脅迫以及調(diào)控種子大小方面的應(yīng)用，可通過(guò)轉(zhuǎn)基因等分子遺傳技術(shù)來(lái)獲得具有不同抗性的轉(zhuǎn)基因 植物，在上述應(yīng)用中，不限于應(yīng)用于植物中，還包括應(yīng)用于動(dòng)物和微生物中。擬南芥SCPL41基因在GenBank中的編號(hào)是AT5G42230，CDS序列長(zhǎng)為1410bp，編碼469個(gè)氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列如表I SEQ ID No I和表2 SEQ ID No 2所示。所述的突變體bis4由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所免費(fèi)提供，是由一段XVE誘導(dǎo)性標(biāo)記激活的擬南芥T-DNA插入在五號(hào)染色體的1688323bp處，是SCPL41基因的編碼區(qū)，因此而導(dǎo)致基因功能缺失，插入位點(diǎn)處的側(cè)翼序列如SEQ ID No 3所示。本發(fā)明首次提供擬南芥SCPL41基因的一種T-DNA插入突變體bis4對(duì)正丁醇脅迫有顯著耐受作用、對(duì)ABA不敏感、種子明顯變小。由此看出，SCPL41基因在眾多生理過(guò)程中的作用，表明其可能參與許多植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及響應(yīng)逆境脅迫，參與調(diào)控PLD介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移磷脂?；磻?yīng)、調(diào)控種子的發(fā)育及大小、參與ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。研究該基因功能對(duì)揭示植物的抗逆機(jī)制具有實(shí)質(zhì)性的價(jià)值，對(duì)轉(zhuǎn)移磷脂酰基反應(yīng)的生物學(xué)意義及應(yīng)用提供更為廣闊的思路，對(duì)改善農(nóng)作物性狀及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。


圖I為突變體bis4卡那霉素抗性鑒定；圖2為T(mén)AIL-PCR擴(kuò)增突變體的T-DNA側(cè)翼序列；圖3為bis4突變體對(duì)正丁醇不敏感與雌二醇存在無(wú)關(guān)；圖4為不同正丁醇濃度下bis4突變體的綠苗率顯著高于野生型擬南芥；圖5為FDA染色檢測(cè)在正丁醇脅迫5天后bis4突變體根尖的細(xì)胞活力顯著高于野生型；圖6為在正丁醇脅迫下野生型擬南芥根尖細(xì)胞明顯變形而bis4突變體根尖細(xì)胞正常；圖7為正丁醇脅迫5天后野生型擬南芥和bis4突變體根尖周質(zhì)微管結(jié)構(gòu)；圖8A、圖8B為bis4突變體對(duì)ABA不敏感；圖9為bis4突變體對(duì)鹽脅迫敏感；圖10A、圖IOB為bis4突變體的種子顯著小于野生型擬南芥種子。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但并不以此來(lái)限定本發(fā)明。實(shí)施例I :突變株的獲得本發(fā)明所述擬南芥絲氨酸羧肽酶類(lèi)蛋白41 (serine carboxypeptidase-like 41)在GenBank中的編號(hào)是AT5G42230，該基因的CDS長(zhǎng)1410bp，核苷酸序列如表I SEQ ID NoI所示，編碼469個(gè)氨基酸，氨基酸序列如表2 SEQ ID No 2所示。此基因的XVE誘導(dǎo)性標(biāo)記激活的擬南芥T-DNA插入株系種子，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所免費(fèi)提供。把從中科院遺傳所獲得的一批XVE誘導(dǎo)性標(biāo)記激活的T-DNA插入突變體的種子隨機(jī)點(diǎn)在含有O. 04%濃度的正丁醇的培養(yǎng)基上，并篩選得到可以在含有正丁醇培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)的幼苗，并收集種子，再用同樣的辦法進(jìn)行第二代的篩選，如此反復(fù)三次，得到正丁醇·抗性可以穩(wěn)定遺傳的株系，命名為bis4(butanol insensitive mutant 4)。表I擬南芥絲氨酸羧肽酶基因SCPL41核苷酸SEQ ID NO : I⑶S序列表I ATGGCTATTG TGTCGTTGCG CGATGTGGCC ATGGTGATGG TGACAGTGCA51 GGTGTTTGCA CGAGGGTATC CGGAAACAGA TTTGGTTGTG AGGCTTCCTG101 GTCAACCAAA GGTTGTATTC AGACAGTACG CAGGGTATGT TGATCTCGAC151 TTGAATGCTG GCCGTAGCCT TTTCTACTAC TTCGTGGAAG CTGAAAAACA201 CCCTGACACA AAACCGTTAA CCTTGTGGCT CAATGGAGGT CCAGGTTGTT251 CTTCTGTTGG TGGAGGAGCT TTCACTGAGC TAGGTCCATT TTACCCCACA301 GGATATGGGC GTGGTCTTCG CATTAACTCC ATGTCGTGGA ACAAAGCCTC351 AAACCTGCTA TTTGTGGACT CACCGGCTGG AGTTGGTTGG TCTTACTCCA401 ACCGAAGCTC TGATTACAAC GCTGGGGACA AGTCTGCGGC CAGCGATATG451 CTCGTGTTCT TGTTGAGATG GTTCGATAAG TTCCCGGAGT TGAAGTCTCA501 CGATCTCTTT CTCACTGGCG AAAGCTATGC AGGACATTAC ATACCTCAAC551 TGGCTGATGC GATTCTCAGC TATAACTCAC GCTCAAGTGG GTTCAAATTC601 AACATCAAAG GCATTGCAAT AGGGAATCCA CTTCTGAAGC TTGACAGGGA651 CATTCCAGCT GTATACGAGT TCTTCTGGTC GCATGGCATG ATCTCTGAGG701 TAGTGGGACG TACAATCAAG ATTCAATGTG ACTTCTCACA TTACACATAT751 GCATACCCCC ATAACGTAAG TGATGCCTGC AACGATGCTA TCCGTGAAGC801 CGGAGACATC ACCACTGAGT ATGTCAATAC CTTTGATGTT CTCCCTGACC851 TATGCTACCC ATCTATTGCC CTGCAAGAGC TAAGGCTTAA ACAAATGGCT901 ACTAAGATGA GCATGGGAGT GGATGTGTGT ATGAACTACG AAAGACAGTT951 CTACCTAAAT ATCCCAGAGG TACAGATGGC TCTTCACGCA AACCGCACAA1001 ACCTGCCTTA TTCATGGTCT TTGTGCAGCA ACCTGTTAAA CTACTCTGCC1051 ATCGATGTAA ACACCAACAT GCTTCCGACT CTGAAGAGAA TTATACAGAA1101 CAAAATTCCT GTTAGGATCT TCAGTGGAGA TCAAGATTCT GTAGTTCCAT1151 TTCTGGGAAC ACGAACTATC GTAGGAGAAC TCGCCAACGA TCTCAATTTC1201 AAGACGACAG TTCCATATGG AGTGTGGTTC CACAAAAGAC AGGTTGGAGG1251 CTGGGCCATC GAGTATGGAA ACCTACTAAC TTTTGCAACA GTGAGAGGAG
1301 CGGCTCATGC GGTGGCGTAC ACGCAGCCCT CACGAGCTCT GCATCTATTC1351 AGCACCTTTC TTCGTGGGCA GAGATTGCCC AACAAGACAG ATATTGCTAT1401 GCATGACTGA表2擬南芥絲氨酸羧肽酶基因SCPL41氨基酸SEQ ID NO 2⑶S序列表I MAIVSLRDVA MVMVTVQVFA RGYPETDLVV RLPGQPKVVF RQYAGYVDLD51 LNAGRSLFYY FVEAEKHPDT KPLTLffLNGG PGCSSVGGGA FTELGPFYPT101 GYGRGLRINS MSffNKASNLL FVDSPAGVGff SYSNRSSDYN AGDKSAASDM
151 LVFLLRffFDK FPELKSHDLF LTGESYAGHY IPQLADAILS YNSRSSGFKF201 NIKGIAIGNP LLKLDRDIPA VYEFFffSHGM ISEVVGRTIK IQCDFSHYTY251 AYPHNVSDAC NDAIREAGDI TTEYVNTFDV LPDLCYPSIA LQELRLKQMA301 TKMSMGVDVC MNYERQFYLN IPEVQMALHA NRTNLPYSffS LCSNLLNYSA351 IDVNTNMLPT LKRIIQNKIP VRIFS⑶QDS VVPFLGTRTI VGELANDLNF401 KTTVPYGVffF HKRQVGGffAI EYGNLLTFAT VRGAAHAVAY TQPSRALHLF451 STFLRGQRLP NKTDIAMHD實(shí)施例2 突變株的鑒定I、卡那霉素抗性鑒定將通過(guò)復(fù)篩獲得的正丁醇突變體種子bis4播種于含有20mg/L卡那霉素和10μπιο1/117-β-雌二醇的MS培養(yǎng)基上。經(jīng)2天春化處理后，在培養(yǎng)室萌發(fā)。5_7天后進(jìn)行表型觀察(圖I)，同時(shí)挑選抗性植株轉(zhuǎn)移到常規(guī)MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)10天左右，再轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)土中擴(kuò)繁種子。2 =T-DNA插入位點(diǎn)的鑒定用簡(jiǎn)易微量的DNA提取法提取正丁醇不敏感突變體bis4Tl代DNA，T-DNA插入位點(diǎn)的鑒定利用 TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced-POlymerase Chain Reaction)方法進(jìn)行。⑴引物根據(jù)pER16表達(dá)載體T-DNA插入片段的左邊界設(shè)計(jì)巢式PCR引物為巢式引物L(fēng)exA2 5/ -CTAATCGCATTATCATCCCCTCG-3'；LexA4 5/ -CTGGTTTTATATACAGCAGTCGACG-3'；LexA5 5/ -AGTCGAGGTAAGATTAGATATGG-3'；四個(gè)隨機(jī)引物ADI (AGCT) TCGA (G/C) T (A/T) T (G/C) G (A/T) GTTAD2 :NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAAAD3 (A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGAAD4 AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG⑵反應(yīng)組分
權(quán)利要求
1.擬南芥基因SCPL41在培育抵抗醇類(lèi)物質(zhì)脅迫以及改變轉(zhuǎn)移磷脂酰基反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
2.擬南芥基因SCPL41在培育響應(yīng)脫落酸的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
3.擬南芥基因SCPL41在培育耐受鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
4.擬南芥基因SCPL41在培育以收獲種子為主的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
5.擬南芥基因SCPL41在制備和合成高純度多功能特性的單一磷脂或稀少磷脂中的應(yīng)用。
6.擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在培育抵抗醇類(lèi)物質(zhì)脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在培育響應(yīng)脫落酸的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
8.擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在培育耐受鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
9.擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在培育以收獲種子為主的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.擬南芥基因SCPL41的T-DNA插入突變體bis4在制備和合成高純度多功能特性的單一磷脂及稀少磷脂中的應(yīng)用。
全文摘要
擬南芥絲氨酸羧肽酶類(lèi)蛋白基因SCPL41及其T-DNA突變體在提高植物抗醇類(lèi)脅迫、對(duì)鹽脅迫敏感、對(duì)脫落酸不敏感、調(diào)控種子大小中的應(yīng)用。借助模式植物擬南芥，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)證實(shí)SCPL41基因的缺失表達(dá)使得擬南芥可以耐受一定濃度正丁醇脅迫，并且對(duì)脫落酸(abscisic acid，ABA)不敏感、對(duì)鹽脅迫敏感、種子個(gè)體顯著小于野生型擬南芥的種子。SCPL41基因在眾多生理過(guò)程中的作用，表明其參與許多植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及響應(yīng)逆境脅迫參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，為利用轉(zhuǎn)移磷脂?；磻?yīng)來(lái)合成新的磷脂提供新的技術(shù)方法，而且這些功能在農(nóng)作物生產(chǎn)中有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/57GK102911954SQ20121001319
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者李唯奇, 賈艷霞, 蘇一蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所