專利名稱：一種甄別霍亂毒素的細胞學(xué)檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甄別霍亂毒素的細胞學(xué)檢測試劑盒，以及利用該試劑盒檢測霍亂毒素的方法。
背景技術(shù)：
在霍亂弧菌疫情的防控工作中，菌體是否產(chǎn)生CT是一個極為重要的檢測指標(biāo)?；魜y弧菌流行株幾乎均為產(chǎn)CT的菌株，而非流行株均不產(chǎn)生CT。CT由CtxAB基因編碼，是霍亂弧菌分泌的一種具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的毒蛋白，該基因位于染色體CTX遺傳單元上，其415kb的核心區(qū)域包含至少5個基因(c印，orfU，ace, zot，ctxAB)，是由溶原性噬菌體 CTXΦ攜帶，可在霍亂弧菌間水平轉(zhuǎn)移。CT毒素由5個B亞單位和1個A亞單位組成，B亞單位作用于腸黏膜上皮細胞特異性受體GMl (Gangliosidoses，神經(jīng)節(jié)苷脂類分子)，使得A 亞單位能夠進入腸細胞，A亞基作用于腺苷酸環(huán)化酶，使其活化，從而使環(huán)磷酸腺苷(cAMP) 含量增高，cAMP在小腸上皮細胞內(nèi)起水、電解質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用，其濃度的增高導(dǎo)致腸液分泌功能增強，打開細胞膜離子通道，引起大量的水和電解質(zhì)流入腸腔，進而導(dǎo)致細胞大量失水引起腹瀉。因此，有效地將產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株進行甄別，加強產(chǎn)毒株的監(jiān)測和控制，可極大地提高防治的效果和效益，對于霍亂的預(yù)防控制具有重要的意義。目前，傳統(tǒng)的CT檢測方法主要依靠動物實驗，傳統(tǒng)細胞學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和生物傳感器等技術(shù)，但是這些方法檢測周期長，靈敏度低，而且無法針對霍亂毒素的活性進行有效甄別。因此，有必要建立一種能夠?qū)崟r動態(tài)、高靈敏度的霍亂毒素檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是一種能夠高特異性、快速、準(zhǔn)確地鑒定霍亂毒素的細胞學(xué)檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種甄別霍亂毒素的細胞學(xué)檢測試劑盒，主要包括Y1腎上腺皮質(zhì)細胞(本發(fā)明中為市購，ATCC:CCL-79)，抗霍亂毒素中和抗體，多聚賴氨酸，96-E-plate，以及用于Yl腎上腺皮質(zhì)細胞的細胞培養(yǎng)基。所述細胞培養(yǎng)基可為常規(guī)適用于Yl腎上腺皮質(zhì)細胞的培養(yǎng)基，本發(fā)明中所述細胞培養(yǎng)基組成如下馬血清15% (ν/ν)，胎牛血清2. 5% (ν/ν)，溶劑為F-I^(培養(yǎng)基。本試劑盒也可含有霍亂毒素標(biāo)準(zhǔn)品，檢測時同時以梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品于同等條件下進行檢測，以加入已知霍亂毒素的時間點至達到20%細胞病變的時間點所需時間與霍亂毒素的濃度關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測陽性樣本加入的時間點至達到20%病變時間點所需的時間，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可獲知待測樣本中的霍亂毒素濃度。本發(fā)明還涉及一種利用所述試劑盒檢測霍亂毒素的方法，所述方法包括(1)多聚賴氨酸用磷酸鹽緩沖液稀釋后包被96-E-plate ；具體方法如下將多聚賴氨酸(0.1g/L)用磷酸鹽緩沖液(PBQ按照1 4(體積比)稀釋后，每孔100μ1體積包被96-E-plate，室溫10分鐘，除去后用磷酸鹽緩沖液清洗2次，待用；多聚賴氨酸由25 30賴氨酸殘基聚合而成，具有強烈的抑菌能力和增強細胞黏附性，用于孔板的包被，可使細胞保持良好的生長狀態(tài)； (2)將Yl腎上腺皮質(zhì)細胞以1 2 X IO4細胞/孔的密度鋪板，細胞培養(yǎng)基體積為 100 200 μ 1/孔，在實時細胞分析系統(tǒng)上于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)；(3)細胞培養(yǎng)18 20小時后，取待測樣本(菌體培養(yǎng)上清液或者糞便等樣本上清液)，加入細胞生長孔中，同時另取一份待測樣本和抗霍亂毒素中和抗體混合、孵育后，加入細胞生長孔中，在實時細胞分析系統(tǒng)上于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)；(4)以不加樣品的細胞生長孔作為陰性對照，觀察加入待測樣本后的細胞生長曲線，若加入待檢樣本后細胞生長曲線值出現(xiàn)20%細胞病變、同時與抗霍亂毒素中和抗體混合后無細胞病變，則判斷為陽性(一般來說，如果是陽性，在加入樣本后2小時內(nèi)會達到 20%病變)。所述細胞培養(yǎng)基組成如下馬血清15%，胎牛血清2. 5%，溶劑為F-I^(培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種甄別霍亂毒素的細胞學(xué)檢測試劑盒及其檢測方法，針對霍亂毒素的特異性細胞學(xué)反應(yīng)，建立了一種能夠?qū)崟r動態(tài)、高靈敏度的霍亂毒素檢測體系，可高特異性、快速、準(zhǔn)確地鑒定霍亂毒素，能有效地將產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株進行甄別，加強了產(chǎn)毒株的監(jiān)測和控制，可極大地提高防治的效果和效益，對于霍亂的預(yù)防控制具有重要的意義。


圖1 為標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果；1 8 分別為0. 9ng/ml、0. 45ng/ml、0. 22ng/ml、0. llng/ ml、55pg/ml、27. 5pg/ml、14pg/ml 和陰性對照；圖2為非線形標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為17例陽性模擬樣本檢測結(jié)果；圖4為例陰性樣本檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1 1、材料Yl腎上腺皮質(zhì)細胞(ATCC :CCL-79) ,F-12K培養(yǎng)基、馬血清購自ATCC公司；胎牛血清購自Hyclone公司；霍亂毒素購自List biological laboratories公司；多聚賴氨酸、牛血清白蛋白和抗霍亂毒素中和抗體購自Sigma公司；96-E-plate購自瑞士 Roche公司。實時細胞分析系統(tǒng)購自瑞士 Roche公司。2、檢測方法2. 1 96-E-plate的包被和細胞鋪板將多聚賴氨酸用磷酸鹽緩沖液(pH7. 2)按照1 4 (ν/ν)稀釋配成包被液，每孔加 100 μ 1體積包被液包被96-E-plate，室溫靜置10分鐘，除去包被液后用磷酸鹽緩沖液清洗2次，待用。將F-I^(培養(yǎng)基按照15%和2. 5%分別加入馬血清和胎牛血清，混合均勻。將試劑盒中的Yl腎上腺皮質(zhì)細胞按照終濃度1. 5 X IO4細胞/孔鋪板，細胞培養(yǎng)基體積為150 μ 1/ 孔，在實時細胞分析系統(tǒng)上37°C、5% CO2 (另95%為空氣)條件下培養(yǎng)，細胞的生長曲線值隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷地增加。2. 2霍亂毒素檢測待細胞培養(yǎng)至18 20小時，加入毒素或菌體培養(yǎng)上清液。針對每一個產(chǎn)霍亂毒素的菌株和非產(chǎn)霍亂毒素的菌株培養(yǎng)上清液，分別取兩份15 μ 1，一份直接加入到有細胞生長孔，一份與等體積的抗霍亂毒素中和抗體混合，37°C孵育30分鐘，然后加入細胞生長孔， 用的霍亂純毒素作為陽性對照。觀察細胞生長曲線的變化情況。2. 3定量檢測方法的建立陰性糞便樣本上清液(將固體糞便樣本按照1 5(g mL)稀釋后，800 IOOg離心5 10分鐘，取上清待用；如為腹瀉樣本，則800 IOOg離心5 10分鐘，取上清待用)， 采用含有0.1% (w/w)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液按照1 10體積比稀釋，取15μ1，一份直接加入到細胞生長孔，一份先與等體積的抗霍亂毒素中和抗體混合，37°C孵育30分鐘后再加入至不同的細胞生長孔。將霍亂毒素標(biāo)準(zhǔn)品用上述溶液以2倍體積系列梯度稀釋成0. 9ng/ml 14pg/ml， 共7個梯度，結(jié)果見圖1。3、結(jié)論陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為加入待檢樣本后細胞生長曲線值出現(xiàn)20%細胞病變， 同時與抗霍亂毒素中和抗體混合后無細胞病變；并以加入已知霍亂毒素的時間點至達到 20%細胞病變的時間點所需時間與霍亂毒素的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，(見圖2，標(biāo)準(zhǔn)方程為y =0. 8387χ-°·3045)。( 一般來說，如果是陽性，在加入樣本后2小時內(nèi)會達到20%病變)。以陽性模擬樣本(霍亂毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液摻入陰性樣本中制備)進行檢測，結(jié)果見圖3，均呈陽性結(jié)果。以非產(chǎn)毒性霍亂弧菌、副溶血性弧菌、志賀菌、艱難梭菌、沙門菌等進行檢測，結(jié)果見圖4，均無陽性結(jié)果出現(xiàn)。由以上實驗可知，本發(fā)明試劑盒可實時動態(tài)、高靈敏度地對霍亂毒素進行甄別，能有效地將產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株進行甄別，對于霍亂的預(yù)防控制具有重要的意義。
權(quán)利要求
1.一種甄別霍亂毒素的細胞學(xué)檢測試劑盒，主要包括Yi腎上腺皮質(zhì)細胞，抗霍亂毒素中和抗體，多聚賴氨酸，96-E-plate，以及用于Yl腎上腺皮質(zhì)細胞的細胞培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述細胞培養(yǎng)基組成如下馬血清15%，胎牛血清2. 5%，溶劑為F-II培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還含有霍亂毒素標(biāo)準(zhǔn)品。
4.一種利用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測霍亂毒素的方法，所述方法包括(1)多聚賴氨酸用磷酸鹽緩沖液稀釋后包被96-E-plate；(2)將Yl腎上腺皮質(zhì)細胞以1 2XIO4細胞/孔的密度鋪板，細胞培養(yǎng)基體積為100 200 μ 1/孔，在實時細胞分析系統(tǒng)上于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)；(3)細胞培養(yǎng)18 20小時后，取待測樣本，加入細胞生長孔中，同時另取一份待測樣本和抗霍亂毒素中和抗體混合、37°C孵育30分鐘后，加入細胞生長孔中，在實時細胞分析系統(tǒng)上于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)；(4)以不加樣品的細胞生長孔作為陰性對照，觀察加入待測樣本后的細胞生長曲線，若加入待檢樣本后細胞生長曲線值出現(xiàn)20%細胞病變、同時與抗霍亂毒素中和抗體混合后無細胞病變，則判斷為陽性。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述細胞培養(yǎng)基組成如下馬血清15%，胎牛血清2. 5 %，溶劑為F-II培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種甄別霍亂毒素的細胞學(xué)檢測試劑盒及檢測方法。所述試劑盒主要包括Y1腎上腺皮質(zhì)細胞，抗霍亂毒素中和抗體，多聚賴氨酸，96-E-plate，以及用于Y1腎上腺皮質(zhì)細胞的細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明提供了一種甄別霍亂毒素的細胞學(xué)檢測試劑盒及其檢測方法，針對霍亂毒素的特異性細胞學(xué)反應(yīng)，建立了一種能夠?qū)崟r動態(tài)、高靈敏度的霍亂毒素檢測體系，可高特異性、快速、準(zhǔn)確地鑒定霍亂毒素，能有效地將產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株進行甄別，加強了產(chǎn)毒株的監(jiān)測和控制，可極大地提高防治的效果和效益，對于霍亂的預(yù)防控制具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/02GK102533926SQ20121001424
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者張政, 羅蕓, 金大智 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心