專利名稱：全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明全封閉靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測裝置，更具體地說，涉及利用熒光探針技術(shù)在全封閉檢測裝置中快速檢測靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，本發(fā)明還涉及了利用該全封閉的快速檢測裝置快速檢測靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑盒及其在檢測傳染病病原體中的用途。
現(xiàn)有技術(shù)核酸研究已有100多年的歷史，20世紀(jì)60年代末、70年代初，人們致カ于研究基因的體外分離技木，1983年美國科學(xué)家Kary Mullis驅(qū)車在蜿蜒的州際高速公路上行駛， 孕育出了 PCR的雛形。經(jīng)過兩年的努力，在實(shí)驗(yàn)上證實(shí)了 PCR的構(gòu)想，并于1985年申請了有關(guān)PCR的第一個(gè)專利，在science雜志上發(fā)表了第一篇PCR學(xué)術(shù)論文。從此PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同。Kary Mullis也因此獲得了諾貝爾化學(xué)獎。PCR技木本身非常簡單，且能最大限度地滿足生物學(xué)家操作DNA的不同要求。PCR 技術(shù)又以驚人的速度發(fā)展，并滲透到各生物學(xué)分支科學(xué)和臨床各科的速度也令其它生物技術(shù)望而生嘆。PCR在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、生命科學(xué)、生物工程、遺傳工程、疾病診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等許多科學(xué)領(lǐng)域中都具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并對已建立的基因克隆、DNA序列分析等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展起到巨大的推動作用。PCR能提供基因物質(zhì)的十分可信的精確分析，比任何現(xiàn)有技術(shù)敏感1萬到100萬倍。有人預(yù)測，21世紀(jì)為生物世紀(jì)，那么 PCR便是生物世紀(jì)最重要的技術(shù)。PCR具體應(yīng)用有以下幾個(gè)大的方面1、PCR可用于腫瘤的早期診斷和腫瘤治療效果的測定2、PCR可用于病源微生物的測定，如HAV、HBV、HCV、HIV、致病菌、病毒等。3、遺傳性疾病的診斷。4、早老性癡呆的診斷和治療及巴金森氏病的診斷。5、法醫(yī)鑒定分析，如親子鑒定、犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析。PCR產(chǎn)物一般為IO13拷貝/ml，取0. Iml即為IO9拷貝，而Img人基因組DNA才含 1.4X IO6拷貝的單拷貝基因片段，因此使得PCR擴(kuò)增反應(yīng)具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力，提高了檢測的敏感性。正是由于PCR反應(yīng)具有強(qiáng)大的擴(kuò)增效率，也導(dǎo)致其易污染的缺點(diǎn)，極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性結(jié)果。PCR反應(yīng)中，主要存在三個(gè)污染源1.標(biāo)本間的交叉污染；2.實(shí)驗(yàn)室克隆質(zhì)粒的污染；3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。其中以第三個(gè)污染源最主要，通過下面一個(gè)例子便可認(rèn)識到PCR產(chǎn)物污染的嚴(yán)重性。在IOOml的反應(yīng)管中可產(chǎn)生IO12拷貝個(gè)分子，若將這些分子在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)奧林匹克游泳池(50mX25mX2m)內(nèi)稀釋后，0. Iml稀釋液含有400拷貝的擴(kuò)增分子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了 PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限。因此，PCR檢測微量感染因子吋，一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問題，對臨床實(shí)驗(yàn)室尤應(yīng)如此。所以如何消除PCR假陽性結(jié)果則成了科研工作者們要解決的一大難題。為了能解決PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染所造成的假陽性，許多學(xué)者也是想盡各種辦法來解決這個(gè)問題。
PCR反應(yīng)前后工作區(qū)的隔離包括試劑的準(zhǔn)備和配制；臨床標(biāo)本的處理，提取DNA 模板；模板的擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和檢定等。隔離PCR反應(yīng)前后工作區(qū)，并且在PCR操作中封閉加罩，可提高擴(kuò)增序列的特異性。目前認(rèn)為將PCR反應(yīng)工作分為試劑配制區(qū)、模板制備區(qū)、PCR反應(yīng)區(qū)、產(chǎn)物檢測區(qū)四部分；工作區(qū)環(huán)境應(yīng)堅(jiān)持經(jīng)常紫外線消毒，這是防止PCR 污染的最主要措施。使用PCR預(yù)防污染試劑盒PCR污染預(yù)防試劑盒為采用修飾的dUTP(UNG)取代PCR 反應(yīng)系統(tǒng)中的dTTP。擴(kuò)增后產(chǎn)物可在下次PCR反應(yīng)之前經(jīng)尿嘧啶糖基酶(UNG)作用下被特異性降解，而此酶對天然的核酸模板毫無影響，因此先前擴(kuò)增產(chǎn)物污染PCR系統(tǒng)，也不能成為下次PCR擴(kuò)增的模板，從而可以根本上清除PCR污染dUTP擴(kuò)增產(chǎn)物。同天然DNA —祥具有模板、雜交、克隆性質(zhì)，只是對限制性內(nèi)切酶作用有所影響。此外也可用dU代替引物中 dT，從而使UNG —開始就可以阻斷污染的引物擴(kuò)增。使用PCR預(yù)防污染試劑盒應(yīng)注意PCR 反應(yīng)中退火溫度最好高于5°C，因?yàn)閁NG在5°C以下才具有活性，如果退火溫度低于5°C，變性后殘余的DNA可降解新合成的dUDNA。通常95°C并不能完全滅活UNG ；擴(kuò)增產(chǎn)物最好立即檢測。RS-PCR法(RNA-specif ic PCR)也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3'端(A區(qū))有20個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5'端20個(gè)核苷酸(C區(qū)) 為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使cDNA與多余引物分開，再用和第二引物 (C)以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物 C進(jìn)行擴(kuò)増加尾cDNA，而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會被擴(kuò)增。熒光定量PCR法亦稱熒光PCR技術(shù)(fluoresence PCR，F(xiàn)-PCR)，是1995年由美國 PE公司首先研制成功的，它融匯了 PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，電腦同步跟蹤，數(shù)據(jù)自動化處理，直接探測PCR過程中的變化以獲得定量的結(jié)果，不需要做PCR后處理或檢測，完全閉管操作。探針標(biāo)記除用TET和FAM外，還可用HEX、JOE作為報(bào)告熒光，3'端的淬滅基團(tuán)常用TAMRA。在探針保持完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光被熒光抑制基團(tuán)淬滅，而在探針被切斷后，熒光報(bào)告基團(tuán)才發(fā)出報(bào)告熒光，且熒光的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比。熒光檢測儀器透過PCR管壁能直接檢測到熒光信號的波長和長度變化。 熒光定量PCR法檢測靶核酸雖可起到全封閉、自動化檢測，但由于儀器昂貴，操作場地要求嚴(yán)格以及操作人員須持證上崗，檢測成本高，限制了核酸檢測的廣泛應(yīng)用。全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置其原理為擴(kuò)增反應(yīng)完成后，完全不打開反應(yīng)管的管蓋，以避免靶核酸擴(kuò)增物釋放到空氣中形成污染，把反應(yīng)管在不開蓋的情況下放入在封閉性的裝置內(nèi)，將靶核酸擴(kuò)增物在物理性封閉的環(huán)境中由反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至檢測試紙條上，通過熒光檢測的數(shù)值，判讀結(jié)果，檢測后不打開密封的裝置，可將其全部廢棄于安全處。在靶核酸擴(kuò)增操作過程中?？梢姌?biāo)本間的污染，污染可能來自陰性標(biāo)本處理過程中所伴隨的已知或未知的陽性物質(zhì)，通過空氣污染或氣溶膠，造成假陽性反應(yīng)；然而更多見的是上次靶核酸擴(kuò)增的產(chǎn)物，成為下次靶核酸反應(yīng)的模板，主要是通過靶核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，必須打開PCR反應(yīng)管的管蓋，吸出擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行凝膠電泳或其它必須開蓋式的傳統(tǒng)檢測方法檢測。擴(kuò)增極其微量的樣品靶序列污染，在短時(shí)間內(nèi)可擴(kuò)增上百萬倍，從而影響檢測結(jié)果判定。目前能夠防止污染的免開蓋的儀器或是裝置都有著這樣或那樣的缺點(diǎn)如PCR反應(yīng)前后工作區(qū)的隔離法，不能保證徹底的防止污染，且實(shí)驗(yàn)操作人員身上如果不慎攜帶有PCR產(chǎn)物，那么這種方法也起不到好的效果。PCR預(yù)防污染試劑盒法，使用該系統(tǒng)防污染的先決條件，是整個(gè)PCR系統(tǒng)必須從ー開始就采用dUTP代替dTTP，而且UNG-dUTP系統(tǒng)防污染試劑的價(jià)格也使該試劑的使用受到了限制。RS-PCR法對引物設(shè)計(jì)要求很高，同樣不適合基層操作人員。熒光定量PCR法，由于熒光定量PCR儀的價(jià)格昂貴、操作要求高所以不適合基層操作人員使用。全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置，雖然簡單方便。但是密封效果不好，稍有不慎，同樣會造成PCR產(chǎn)物的泄露而污染。況且成本過高，所以難以推廣使用。 如果能有ー種既簡單方便又快速又成本低的方法將對生物學(xué)領(lǐng)域有著巨大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了能更好地解決靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染的問題，并結(jié)合以上所有可以防止靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本申請人結(jié)合熒光探針技術(shù)，開發(fā)出全密閉式快速檢測靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的快速熒光檢測物的裝置，稱為全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置。本發(fā)明提供一種全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測方法，是擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，把反應(yīng)管在不開蓋的情況下放入在密閉性的裝置內(nèi)，在該密閉性裝置內(nèi)反應(yīng)管被破壁， 使反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物與密閉裝置內(nèi)預(yù)置的檢測液反應(yīng)，然后進(jìn)行熒光檢測，判讀結(jié)果。上述方法中擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，不打開反應(yīng)管的管蓋，可以避免靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物釋放空氣中形成嚴(yán)重的氣溶膠污染；擴(kuò)增產(chǎn)物在這個(gè)完全密閉的裝置內(nèi)可以進(jìn)行熒光檢測； 檢測后不打開密封的裝置，可將其全部廢棄于安全處。整個(gè)過程在密閉環(huán)境中進(jìn)行，能有效地防止靶核酸擴(kuò)增物交叉污染，避免假陽性。本發(fā)明提供ー種將PCR、恒溫?cái)U(kuò)增或其它方法擴(kuò)增的產(chǎn)物應(yīng)用熒光檢測的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置。其包括PCR管、頂針塞、離心管，所述PCR管能置于離心管中，所述頂針塞具有能刺破PCR管的穿刺針，離心管具有可密閉的管蓋。所述頂針塞包括塞體和穿刺針，為了讓PCR管中的液體順利進(jìn)入離心管，穿刺針外側(cè)有突出的針脊，塞體上設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，脊可以是1條或多條。穿刺針上還有漏液孔。上述裝置還包括配合該裝置的剪刀鉗。以確保剪切后的O.aiil PCR管能夠倒置入 1. 5ml離心管中，PCR管的頂部與離心管體是吻合的，從而確保PCR管進(jìn)入離心管不會置歪。頂針塞塞體的尺寸是當(dāng)頂針塞放置于離心管中吋，其位置使倒置放入的PCR管的尾部突出離心管ロ 3-10mm。刺破PCR管的方式是利用離心管管蓋封閉離心管的過程中，管蓋擠壓PCR管管尾產(chǎn)生壓力，推動PCR管向下移動，PCR管管蓋被頂針刺破；頂針針尖鋒利度能確保剛置入的PCR管沒有刺破PCR管，在離心管管蓋沒有與管ロ接觸前沒有刺破PCR 管頂，只有在離心管管蓋與管ロ接觸形成一個(gè)全封閉的環(huán)境，頂針針尖刺破PCR管。在針表面的脊型設(shè)計(jì)使PCR管被刺破后頂針與管蓋間產(chǎn)生縫隙，在離心力作用下，PCR管內(nèi)的液體能夠從原來密封的PCR管中流出；頂針塞體部設(shè)計(jì)的漏斗樣穿空能夠使從PCR管中流出的液體通過塞體進(jìn)入離心管底部反應(yīng)，且在PCR管內(nèi)、塞體均沒有液體殘留。頂針塞塞體四周的鏤空可以使管壁上的液體離心進(jìn)入管底。頂針塞塞體的體長為2-6mm，使離心管內(nèi)的反應(yīng)液體在0. 5ml以下均適用。本發(fā)明還公開了ー種快速熒光檢測靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，是使用上述的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置檢測核酸序列擴(kuò)增物。
5
本發(fā)明還公開了ー種防止核酸擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染，避免假陽性的方法，是使用上述全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置核酸序列擴(kuò)增物。本發(fā)明還公開了上述全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測方法或裝置在臨床傳染病病原體檢測、食品致病菌檢測以及基因水平上的種類鑒定中的用途。本發(fā)明將利用熒光探針技術(shù)，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案，在上述方法中，所述的封閉裝置(離心管)內(nèi)包含了靶核酸反應(yīng)液以及檢測液，井能在密封的環(huán)境中充分混合并反應(yīng)，無須打開就能直接檢測熒光，從而防止裝置內(nèi)的可能污染的物品因意外而外泄。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案，在上述方法中，如果PCR管的管蓋有突出部分，可以用用剪刀嵌剪切PCR管蓋成圓型，但不破壞PCR管的密閉性，又能使PCR管順利倒置入離心管內(nèi)，同時(shí)經(jīng)剪切后的PCR管管蓋盡可能貼近離心管管壁，起到對PCR管一個(gè)相對定位的作用，使頂針對應(yīng)PCR管管蓋的中間位置。本發(fā)明的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置與常規(guī)靶核酸檢測技術(shù)相比，主要有以下優(yōu)點(diǎn)(1)全密閉式檢測。整個(gè)過程都是無須開蓋的，且是密封的，很好的避免了因?yàn)殚_蓋而造成的靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的污染a) PCR反應(yīng)管從核酸擴(kuò)增結(jié)束到倒置入離心管，均是封閉的；b)PCR管被刺破是在離心管管蓋完全合上形成ー個(gè)密閉空間時(shí)開始的，至管蓋蓋死時(shí)穿刺產(chǎn)生的破ロ最大；c)由于PCR管的液體量小于100 μ 1，即使PCR管倒置后其液體由于毛細(xì)管虹吸現(xiàn)象留在頂端，只有在頂針完全刺破PCR管管蓋并通過離心其才會進(jìn)入離心管管底；(2)快速熒光檢測。由于在離心管底部已預(yù)先加入有特異性識別靶核酸反應(yīng)產(chǎn)物的瑩光探針和限制性內(nèi)切酶，靶核酸產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)離心一進(jìn)入離心管底部與其混勻即開始反應(yīng)探針A和探針B同時(shí)識別靶核酸序列，三者形成一特殊結(jié)構(gòu)，一旦形成這ー特殊結(jié)構(gòu)，就能被限制性內(nèi)切酶識別，限制性內(nèi)切酶在探針A上標(biāo)記有熒光基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)Q 間進(jìn)行切割，F(xiàn)AM與Q基團(tuán)分離并脫落，Q基團(tuán)不能再淬滅FAM，F(xiàn)AM發(fā)出熒光，同時(shí)新的探針A又結(jié)合到靶序列上產(chǎn)生新的切割，熒光信號不斷被放大，10分鐘左右熒光信號即可達(dá)到最強(qiáng)；(3)特異性強(qiáng)。由于需兩條相鄰探針同時(shí)識別靶序列，形成ー個(gè)特殊的空間結(jié)構(gòu)后，限制性內(nèi)切酶才開始切割并產(chǎn)生熒光信號(見圖4)；(4)靈敏度高。該方法第一步靶核酸擴(kuò)增具有公認(rèn)的高靈敏性，同時(shí)第二步探針檢測在限制性酶的作用下也是ー個(gè)信號放大方法；(5)操作簡單、快速。整個(gè)檢測過程只需十到十五分鐘左右的時(shí)間；(6)檢測只須一臺小型熒光檢測儀。由于該裝置可使靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測在完全密閉狀態(tài)下完成，大大降低了傳統(tǒng)擴(kuò)增后核酸檢測法中因?yàn)殡娪緳z測而開蓋造成的污染。此方法操作簡單，快速，檢測成本低，可靠性高。本密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置在各領(lǐng)域使用過程中可以增加結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性，縮短檢測時(shí)間，也可使各領(lǐng)域的總體成本降低。這ー裝置由于操作簡単、快速、成本低和對防止靶核酸擴(kuò)增物污染的效果顯著，對在生物學(xué)領(lǐng)域工作的技術(shù)人員來說，有著很大的幫助。由于核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)的廣泛使用，所以本發(fā)明的這項(xiàng)裝置可以應(yīng)用于所有需要使用核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)法來檢測的領(lǐng)域。如臨床傳染病病原體檢測、食品致病菌檢測以及農(nóng)業(yè)エ業(yè)海關(guān)牧業(yè)等領(lǐng)域在基因水平上的種類鑒定和基因突變檢測等方面的應(yīng)用。如1.本發(fā)明的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置可應(yīng)用于遺傳病的產(chǎn)前診斷。用胎兒羊膜細(xì)胞，羊水或甚至母血可以檢查胎兒的性別，這在與性染色體關(guān)聯(lián)遺傳病診斷中是必要的。對于高發(fā)的遺傳病，如地中海貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血、凝血因子缺乏、DMD 等已在臨床應(yīng)用多年，為優(yōu)生優(yōu)育作了貢獻(xiàn)，對于有遺傳傾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂癥、甚至腫瘤中的一部分。2.本發(fā)明的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置可應(yīng)用于致病病原體的檢測。外源入侵的基因，一旦闡明其部分核酸序列，就可以設(shè)計(jì)引物或探針，用PCR、PT_PCR 或雜交方法來檢測，其范圍包括細(xì)菌、病毒、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物，PCR診斷的特點(diǎn)檢測的靈敏度和特異性都遠(yuǎn)高于當(dāng)前的免疫學(xué)方法，所需時(shí)間也已達(dá)到臨床要求，這對于難于培養(yǎng)的病毒(乙肝)，細(xì)菌(如結(jié)核、厭氧菌)和原蟲 (如梅毒螺旋體)等來說尤為適用。3.本發(fā)明的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置可應(yīng)用于癌基因的檢測和診斷。雖然對癌基因的研究大部分還屬于基礎(chǔ)階段，但癌變是由基因變異所導(dǎo)致的這ー 基本事實(shí)已無庸置疑，所以癌基因、抗癌基因入抗轉(zhuǎn)移基因的研究，離開分子水平的診斷手段是無法進(jìn)行的，臨床上已可應(yīng)用的例子有白血病殘留細(xì)胞的定量(包括慢粒和急粒)，肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神經(jīng)質(zhì)瘤N-myc基因的激活和表達(dá)。通過原位雜交觀察特定癌基因及抗轉(zhuǎn)移基因的植入和反義寡核苷酸對強(qiáng)表達(dá)癌基因的阻斷均已成為近代基因治療的著眼點(diǎn)。4.本發(fā)明的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置可應(yīng)用于DNA指紋、個(gè)體識別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證。這ー為公、檢、法部分所矚目的課題已經(jīng)在某些國家取得法律認(rèn)可。肌紅蛋白小衛(wèi)星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重復(fù)次數(shù)的差異都被應(yīng)用于鑒定，其靈敏度已達(dá)到一根頭發(fā)、一個(gè)細(xì)胞、ー個(gè)精子取得個(gè)體特征圖譜，這ー 領(lǐng)域也已發(fā)展到骨髓或臟器移植配型及動物種系的研究中。5.本發(fā)明的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置可應(yīng)用于動、植物檢疫。 靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我國進(jìn)出口 ロ岸的門衛(wèi)，檢查出入國門的人員、動、植物 (種畜、種籽)等是否攜帶烈性傳染病(艾滋、動物病毒、植物病毒等)病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于國門之外，是提高我國綜合國力的必要保證。6.本發(fā)明的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置可應(yīng)用于高科技生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。在轉(zhuǎn)基因動植物中檢查植入基因的存在。


圖1是本發(fā)明的全封閉靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置的結(jié)構(gòu)。圖2是本發(fā)明的檢測裝置頂針塞的結(jié)構(gòu)。圖3是本發(fā)明的檢測裝置的操作步驟。
圖4是本發(fā)明的全封閉靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置檢測原理。圖5是本發(fā)明的全封閉靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置檢測金黃色葡萄球菌基因。圖6本發(fā)明的全封閉靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置檢測金黃色葡萄球菌耐藥基因。圖7本發(fā)明的全封閉靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置檢測沙眼衣原體基因
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例可以具體說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的保護(hù)范圍的限制。如圖1，ー種全封閉靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置，其包括PCR反應(yīng)管11、頂針塞12 和離心管13 ；在PCR管11中進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，PCR反應(yīng)管11內(nèi)有核酸擴(kuò)增反應(yīng)液14，使管11倒置進(jìn)入離心管13，離心管13預(yù)置有頂針塞12以及檢測液16 (含有檢測核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的探針A、探針B以及限制性內(nèi)切酶)，利用離心管管蓋封閉離心管的過程中， 管蓋擠壓PCR管管尾產(chǎn)生壓力，推動PCR管11向下移動，PCR管管蓋15被頂針刺破；頂針針尖鋒利度能確保剛置入的PCR管不能被刺破，即在離心管管蓋沒有與管ロ接觸前頂針沒有刺破PCR管蓋15，只有在離心管管蓋與管ロ接觸形成一個(gè)全封閉的環(huán)境，頂針針尖刺破 PC R管。在針表面的脊型設(shè)計(jì)使PCR管被刺破后頂針與管蓋間產(chǎn)生縫隙，在離心力作用下， PCR管內(nèi)的液體14能夠從原來密封的PCR管中流出；頂針塞體部設(shè)計(jì)的漏斗樣穿空能夠使從PCR管中流出的液體通過塞體進(jìn)入離心管底部與預(yù)置檢測液16混合并反應(yīng)，且在PCR管內(nèi)、塞體均沒有液體殘留。頂針塞塞體四周的鏤空可以使管壁上的液體離心進(jìn)入管底。如圖2，頂針塞包括穿刺針21、固定穿刺針的塞體ぬ，穿刺針和塞體都具有漏液設(shè)計(jì)。具體地，頂針塞包括針21、脊型突起22、塞體弧形表面23，針塞漏液漕對、塞體漏液漕 25.頂針塞的針尖設(shè)計(jì)的大小能保證其能刺破PCR管管蓋且自身不易折斷，圍繞頂針的脊型突起22可保證在穿刺針21穿破管蓋后針尖與管蓋間產(chǎn)生縫隙，使PCR管內(nèi)液體可以流出。塞體弧形表面23的弧形表面設(shè)計(jì)可使PCR管中的液體進(jìn)到塞體表面液體不殘留。 穿刺針體鏤空漕對、塞體中間漏斗樣小孔漕25能保證在離心時(shí)PCR管內(nèi)液體通過頂針孔出來且可以完全穿過頂針塞塞體，不會有液體殘留。圖3說明了本發(fā)明的檢測裝置的操作步驟。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案中，所述的反應(yīng)管是PCR反應(yīng)管，管蓋部分超薄設(shè)計(jì)，易被刺破。所用離心管為標(biāo)準(zhǔn)的1. 5ml印pendorf離心管。ー個(gè)具體的實(shí)施步驟如下a)靶核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，不打開反應(yīng)管的管蓋，以避免靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物釋放到空氣中形成嚴(yán)重的氣溶膠污染；b)PCR反應(yīng)管利用剪刀鉗剪切管蓋成圓型并可以倒置放入離心管內(nèi)，整個(gè)PCR管還是ー個(gè)密封的狀態(tài)；c)通過離心管管蓋對PCR管尾部的推力，將倒置的PCR管下壓，PCR管管蓋被頂針塞刺破；d)通過離心，靶核酸反應(yīng)液在離心力作用下穿過被刺破的PCR管蓋和頂針塞孔， 進(jìn)入離心管；
e)由于離心管中已預(yù)置有檢測靶核酸反應(yīng)液的熒光探針，使擴(kuò)增產(chǎn)物在這個(gè)完全
密閉的裝置內(nèi)可以進(jìn)行熒光檢測；f)通過熒光檢測的數(shù)值，判讀結(jié)果；g)檢測后不打開密封的裝置，因PCR管、離心管、頂針塞材質(zhì)均為塑料制品，無金
屬器件，可將其全部廢棄于安全處。如下實(shí)施例可以具體說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1 金黃色葡萄球菌(ATCC25923)為例的靶核酸擴(kuò)增物檢測1.PCR 擴(kuò)增

權(quán)利要求
1.一種全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測方法，是擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，把反應(yīng)管在不開蓋的情況下放入在密閉性的裝置內(nèi)，在該密閉性裝置內(nèi)反應(yīng)管被破壁，使反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物與密閉裝置內(nèi)預(yù)置的檢測液反應(yīng)，然后進(jìn)行熒光檢測，判讀結(jié)果。
2.—種全密閉式靶核酸擴(kuò)增物快速熒光檢測裝置，包括PCR管、離心管，其特征在于還包括ー頂針塞，所述PCR管能置于離心管中，所述頂針塞具有能刺破PCR管的穿刺針，離心管具有可密閉的管蓋。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的全密閉式靶核酸擴(kuò)增物快速熒光檢測裝置，其特征在于所述頂針塞包括塞體和穿刺針，穿刺針外側(cè)有突出的針脊，塞體上設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的全密閉式靶核酸擴(kuò)增物快速熒光檢測裝置，其特征在于所述穿刺針上有漏液孔。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的的全封閉靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置，其特征在于還包括配合該裝置的剪刀鉗。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的的全封閉靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置，其特征在于頂針塞塞體的尺寸是當(dāng)頂針塞放置于離心管中吋，其位置使倒置放入的PCR管的尾部突出離心管ロ 3-10mmo
7.ー種快速熒光檢測靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，是使用權(quán)利要求4-7之一的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置檢測核酸序列擴(kuò)增物。
8.ー種防止核酸擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染，避免假陽性的方法，其包括使用權(quán)利要求4-7之一的全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置核酸序列擴(kuò)增物。
9.權(quán)利要求1所述方法在臨床傳染病病原體檢測、食品致病菌檢測以及基因水平上的種類鑒定、基因突變檢測中的用途。
10.權(quán)利要求2— 6之ー全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測裝置在臨床傳染病病原體檢測、食品致病菌檢測以及農(nóng)業(yè)ェ業(yè)海關(guān)牧業(yè)在基因水平上的種類鑒定、基因突變檢測中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及全密閉式靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物快速熒光檢測方法和裝置，所述方法是擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，把反應(yīng)管在不開蓋的情況下放入在密閉性的裝置內(nèi)，在該密閉性裝置內(nèi)反應(yīng)管被破壁，使反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物與密閉裝置內(nèi)預(yù)置的檢測液反應(yīng)，然后進(jìn)行熒光檢測，判讀結(jié)果。所述裝置包括PCR管、離心管和一頂針塞，所述PCR管能置于離心管中，所述頂針塞具有能刺破PCR管的穿刺針，離心管具有可密閉的管蓋。采用本發(fā)明的方法的裝置，可快速熒光檢測靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，并能防止核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染、避免假陽性；可在臨床傳染病病原體檢測、食品致病菌檢測以及農(nóng)業(yè)工業(yè)海關(guān)牧業(yè)等領(lǐng)域在基因水平上的種類鑒定等方面得到應(yīng)用。
文檔編號C12M1/34GK102534011SQ201210014508
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者曹利民 申請人:曹利民