專(zhuān)利名稱(chēng)：一種產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選方法及用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選方法及應(yīng)用該菌株生產(chǎn)乙偶姻，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
3-輕基丁酮(3-hydroxybutanone)又名乙偶姻，具有令人愉快的香味,可作為一種食用香料廣泛應(yīng)用在食品生產(chǎn)中，如用于奶油、咖啡的香味增強(qiáng)劑及配制乳品、草莓型香精等，也可作為微生物合成重要化工原料和液體燃料的2，3- 丁二醇及雙乙酰的前體物質(zhì)。此外，3-羥基丁酮還可作為一種平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于其他眾多行業(yè)，2004年美國(guó)能源部將其列為30種優(yōu)先開(kāi)發(fā)利用的平臺(tái)化合物之一。因此，3-羥基丁酮作為一種重要的化 學(xué)合成中間體和多功能材料，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工等領(lǐng)域。其生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。其中，化學(xué)合成法已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，該法操作簡(jiǎn)單易行，但污染重、成本高、原料受石油制約、產(chǎn)品質(zhì)量難以達(dá)到食用香料的要求。微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)成本低廉、對(duì)環(huán)境友好、產(chǎn)品純度高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢(shì)，能解決化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化法所面臨的環(huán)境、資源、產(chǎn)品質(zhì)量等問(wèn)題受到越來(lái)越多的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乙偶姻生產(chǎn)菌及其篩選方法和用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻。本發(fā)明的技術(shù)方案I、一種產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選方法從制酒作坊附近的土壤取土樣，稱(chēng)取約5. 0g，在80°C的烘箱中烘烤48h，加入到200ml的無(wú)菌水中制成懸液。此菌懸液作為母液梯度稀釋至10_6，取KT4-IO-6稀釋菌液涂布于富集培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)24h，挑取不同菌落形態(tài)的單菌落進(jìn)行V-P實(shí)驗(yàn)考察，將V-P陽(yáng)性菌株逐一轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，并進(jìn)行編號(hào)保存；培養(yǎng)結(jié)束后各取2mL，10000r/min離心lOmin，用HPLC法檢測(cè)上清液中的乙偶姻含量，篩選出十幾株產(chǎn)乙偶姻的菌株，其中菌株FMME044產(chǎn)乙偶姻的能力最強(qiáng)。2、根據(jù)權(quán)利要求I所述一種產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選方法，其篩選得到產(chǎn)乙偶姻菌株的鑒定方法如下I)生理生化鑒定接觸酶試驗(yàn)，V. P.及M. R.試驗(yàn)，明膠液化及淀粉水解，耐鹽試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn);2) 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，采用枯草芽孢桿菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化，并連接至克隆載體pMD 18 TVector，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，利用克隆載體的青霉素抗性篩選到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并用通用引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定。陽(yáng)性克隆測(cè)序所得16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，得到與之親緣關(guān)系最近的菌種Bacillus amyloliquifaciens,同源性達(dá)99%。通過(guò)生理生化及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，并命名為 Bacillus amyloliquifaciens FMME044。3、本發(fā)明公開(kāi)的一種乙偶姻的生產(chǎn)方法，其特征是采用Bacillusamyloliquifaciens FMME044為出發(fā)菌株，以種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻；I)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，初始pH 7.0;培養(yǎng)條件溫度37°C、搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下，培養(yǎng)10-1 ；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K2HPO4 3，MgSO4O. 4，初始 pH 7.0 ；發(fā)酵條件接種量10% (v/v)，溫度37°C、搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下，發(fā)酵60_72h。3) 7L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K2HPO4 3，MgSO4O. 4，初始 pH 7.0 ；7L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為4L，接種量10% (v/v)，溫度為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min，通氣量為I. Ovvm，過(guò)程中不控制pH，培養(yǎng)時(shí)間32_48h。4、乙偶姻產(chǎn)量的測(cè)定取發(fā)酵液IOOOOrpm離心lOmin，收集上清液，并以乙偶姻作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制1、2、3、4、5g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上清液與標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾后，用高效液相色譜法測(cè)定乙偶姻的含量。色譜條件色譜柱AminexHPX-87H ；流動(dòng)相5mmol/L稀硫酸,用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾；柱溫60°C;檢測(cè)波長(zhǎng)290nm；進(jìn)樣量20μ L流速0.6ml/min。標(biāo)準(zhǔn)曲線在l_5g/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖I)，回歸方程y = 0. 0027，R2=O. 9999。據(jù)此得到72h乙偶姻的產(chǎn)量為35g/L，如圖I。


圖I乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2色譜檢測(cè)結(jié)果，A 5g/L乙偶姻標(biāo)樣，B 32h發(fā)酵液
具體實(shí)施例方式以下是解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquifaciens FMME044)篩選、鑒定及發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻的實(shí)施例。實(shí)施例I從制酒作坊附近地表取土樣，稱(chēng)取約5. 0g，在80°C的烘箱中烘烤48h，加入到200mL的無(wú)菌水中制成懸液。此菌懸液作為母液梯度稀釋至10—6，取10—4-10—6稀釋菌液涂布于富集培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)24h，挑取不同菌落形態(tài)的單菌落進(jìn)行V-P實(shí)驗(yàn)考察，將V-P陽(yáng)性菌株逐一轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，并進(jìn)行編號(hào)保存；培養(yǎng)結(jié)束后各取2mL，10000r/min離心lOmin，用HPLC法檢測(cè)上清液中的乙偶姻含量，篩選出十幾株產(chǎn)乙偶姻的菌株，其中菌株FMME044產(chǎn)乙偶姻的能力最強(qiáng)。
實(shí)施例2對(duì)篩選的FMME044菌株按《微生物分類(lèi)學(xué)》進(jìn)行生理生化特性鑒定(見(jiàn)表I)，并按細(xì)菌基因組提取試劑盒提取方法提取基因組DNA，以Pl和P2為正向和反向引物Pl :5' -CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG-3'，P2:5' -CGACTTCACCCCAATCATCTG-3'。用PCR擴(kuò)增16S rDNA基因，委托華大基因研究中心進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，得到本菌株部分16S rDNA序列后，在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢索工具進(jìn)行同源性比對(duì)分析?；?6SrDNA序列分析和生理生化特性鑒定，結(jié)合對(duì)該菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵特性研究，認(rèn)為是解淀粉芽抱桿菌，命名為 Bacillus amyloliquifaciens FMME044。菌株FMME044 部分 16S rDNA 序列I gccaagagca tgacggcaag tggacgattc gacttcaccc caatcatctg tcccaccttc61 ggcggctggc tccaaaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt121 gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta181 ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt241 tgtgggattg gcttaacctc gcggtttcgc tgccctttgt tctgcccatt gtagcacgtg301 tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg361 tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg421 ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc481 tgtcactctg cccccgaagg ggacgtccta tctctaggat tgtcagagga tgtcaagacc541 tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc601 ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc661 gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg721 tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagtt781 acagaccaga gagtcgccct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg catttcaccg841 ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc caatgaccct901 ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcga gccctttacg961 cccaataatt ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt1021 agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa ggtgccgccc tatttgaacg gcacttgttc1081 ttccctaaca acagagcttt acgatccgaa aaccttcatc actcacgcgg cgttgctccg1141 tcagactttc gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg1201 tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg tcgccttggt
1261 gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt ggtagccgaa1321 gccacctttt atgtctgaac catgcggttc aaacaagcat ccggtattag ccccggtttc1381 ccggagttat cccagtctta caggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta1441 acatcaggga gcaagctccc atctgaatct ccagaggatc gccgggaacc gaggacgag表I菌株(FMME044)生理生化鑒定結(jié)果
菌株革蘭氏接觸酶 ν.Ρ. M.R. 明膠淀粉硝酸鹽 2%Naa 70/Ν Γ,
名稱(chēng)染色試驗(yàn)試驗(yàn)試驗(yàn)液化水解還原解淀粉
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選方法，其特征為 從無(wú)錫郊外菜地地表取土樣，稱(chēng)取約5. Og，在80°C的烘箱中烘烤48h，加入到200ml的無(wú)菌水中制成懸液。此菌懸液作為母液梯度稀釋至10_6，取10_4-10_6稀釋菌液涂布于富集培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)24h，挑取不同菌落形態(tài)的單菌落進(jìn)行V-P實(shí)驗(yàn)考察，將V-P陽(yáng)性菌株逐一轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，并進(jìn)行編號(hào)保存；培養(yǎng)結(jié)束后各取2ml，10000r/min離心lOmin，用HPLC法檢測(cè)上清液中的乙偶姻含量，篩選出十幾株產(chǎn)乙偶姻的菌株，其中菌株FMME044產(chǎn)乙偶姻的能力最強(qiáng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選方法，其篩選得到產(chǎn)乙偶姻菌株經(jīng)生理生化及16 S rDNA分子生物學(xué)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，并命名為Bac i 11 u samyIOIiquifaciensFMME044o
3.一種乙偶姻的生產(chǎn)方法，其特征是采用Bacillus amyIoliquifaciens FMME044為出發(fā)菌株，以種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻； 1)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，初始PH 7.0 ； 培養(yǎng)條件溫度37°C、搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下，培養(yǎng)10_12h ； 2)液體發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5,K2HPO4 3,MgSO4 0.4，初始pH 7. 0 ； 發(fā)酵條件接種量10% (v/v)，溫度37°C、搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下，發(fā)酵60_72h ； 3)7L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5,K2HPO4 3,MgSO4 0.4，初始pH 7. 0 ； 7L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為4L，接種量10% (v/v)，溫度為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min，通氣量為I. Ovvm，過(guò)程中不控制pH，培養(yǎng)時(shí)間32_48h。
全文摘要
本發(fā)明闡述了一種產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選方法和用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明菌株是將土樣經(jīng)過(guò)烘烤懸浮后稀釋涂布，通過(guò)V-P實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定性分析篩選，并對(duì)篩選菌株進(jìn)行生理生化及分子生物學(xué)鑒定，采用高效液相色譜法得到一株高產(chǎn)乙偶姻的解淀粉芽孢桿菌。本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)一種采用該菌株生產(chǎn)乙偶姻的方法，采用本方法發(fā)酵72h乙偶姻產(chǎn)量為35g/L。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102634563SQ20121001460
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者劉立明, 張燕婕, 李樹(shù)波, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)