專利名稱：凝膠電泳核酸標(biāo)志物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳核酸標(biāo)志物，尤其涉及ー種可用于分析、分離小分子核酸PAGE電泳的核酸標(biāo)志物、及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
凝膠電泳(Gel electrophoresis)是用于分離和分析不同物理性質(zhì)的分子的ー類技木，該方法操作簡便快捷，可以分辨其它方法不能分類的DNA、RNA片段，因此被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)，通過檢測出的不同條帶，即可確定核酸的位置，進行進一歩分析或回收。核酸的凝膠電泳一般采用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，其中，聚丙烯酰胺凝膠具有較高的分辨率，能有效分離相差I(lǐng)nt的核酸分子，因此，對于小分子(く 200nt)核酸的電泳，一般采用聚丙烯酰胺凝膠。目前用作小分子(<100nt)核酸電泳的分子對照物(標(biāo)志物)很少，并且大多為單鏈 RNA。由于RNA酶無處不在，并且難以滅活，通常在操作前需要對所用器材進行嚴格處理，對操作者技術(shù)要求較高，大大限制了 RNA分子標(biāo)志物的應(yīng)用。而不含變性劑(如尿素、甲酰胺等)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離IOOnt以下片段RNA、尤其是20nt左右微小RNA (miRNA), 尚缺乏有效的分子標(biāo)志物。通過液相雜交然后非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，可用于小分子核酸的檢測， 該方法建立在傳統(tǒng)Northern Blot技術(shù)核心上，能有效檢測樣品內(nèi)非編碼小RNA的表達量， 具有簡便、經(jīng)濟、快速、可靠等特點。然而要獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，必須有非變性聚丙烯酰胺電泳相對應(yīng)的分子標(biāo)志物作參照。因此，需要探索用于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離更為穩(wěn)定、可靠的核酸分子標(biāo)志物。

發(fā)明內(nèi)容
針對小分子核酸凝膠電泳分子標(biāo)志物缺乏、以及實用性受限的缺陷，本發(fā)明提供了ー種新型小分子核酸標(biāo)志物，用于液相雜交后非變性PAGE凝膠電泳分子對照，尤其適用于對<200bp核酸的檢測。本發(fā)明第一個目的是提供ー種核酸電泳的分子標(biāo)志物，包括包括單鏈DNA，還包括DNA-DNA雙鏈和/或DNA-RNA雜化雙鏈。DNA-DNA雙鏈中的兩個單鏈DNA堿基數(shù)目相同并且互補，同樣地，DNA-RNA雙鏈中的單鏈DNA和單鏈RNA堿基數(shù)目相同并且互補。其中，所述DNA-RNA雜化鏈中單鏈RNA優(yōu)選為10nt、21nt、40nt、88nt的序列，進ー 步優(yōu)選為21和40nt的序列；所述單鏈DNA、DNA-DNA雙鏈和DNA-RNA雜化鏈中單鏈DNA優(yōu)選為10nt、21nt、40nt、88nt的序列，進ー步優(yōu)選為21和40nt的序列。本發(fā)明上述的非變性PAGE電泳核酸標(biāo)志物的ー種優(yōu)選實施方式，其中，單鏈DNA 和單鏈RNA中同一堿基連續(xù)不超過4個。
其中，單鏈DNA和單鏈RNA中A、G堿基占堿基總數(shù)量的百分比彡60%。本發(fā)明上述的非變性PAGE電泳的核酸標(biāo)志物，單鏈DNA和/或單鏈RNA的3'端標(biāo)記非同位素(生物素)。本發(fā)明第二個目的是提供ー種上述非變性PAGE電泳核酸標(biāo)志物的制備方法，根據(jù)待測樣品來源和探針類型，設(shè)計合成DNA單鏈及其互補單鏈DNA序列，RNA單鏈及其互補的DNA單鏈；DNA單鏈及其互補單鏈DNA序列，RNA單鏈及其互補的DNA單鏈通過液相雜交按照堿基互補配對原則分別形成DNA-DNA雜化鏈和/或DNA-RNA雙鏈。其中，所述單鏈RNA和單鏈DNA優(yōu)選為10nt、21nt、40nt、88nt的序列，進ー步優(yōu)選為21nt和40nt的序列；如10nt、21nt、40nt、88nt等不同大小序列。例如
IOntDNA 序列(5‘ -3')
atgtagagctSEQ ID No. 1
IOntDNA 互補序列(5‘ -3')
agctctacatSEQ ID No. 2
2IntDNA 序列(5‘ -3')
acccagtagccagatgtagctSEQ ID No. 3
2IntDNA 互補序列(5‘ -3')
agctacatctggctactgggtSEQ ID No. 4
40ntDNA 序列(5' -3')
atcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgaggctbEQ ID No. 5
40ntDNA 互補序列(5' -3')
agcctcgcttcggcagcacatatactaaaattggaacgatSEQ ID No. 6
88ntDNA 序列(5' -3')
aaccatgacctcaagaacagtatttccaggaatccccatcttagcatctaagggattcctgggaaaactggac cgtgaggacaaggctSEQ ID No. 7
88ntDNA 互補序列(5' -3')
agccttgtcctcacggtccagttttcccaggaatcccttagatgctaagatggggattcctggaaatactgtt cttgaggtcatggttSEQ ID No. 8
2IntRNA 序列(5‘ -3')
agcuacaucuggcuacuggguSEQ iD No. 9
40 ntRNA 序列(5' -3') agccucgcuucggcagcacauauacuaaaauuggaacgaubEQ ID No. 10
本發(fā)明上述的非變性PAGE電泳核酸標(biāo)志物的ー種優(yōu)選實施方式，其中，DNA單鏈和RNA 單鏈中同一堿基連續(xù)不超過4個。其中，A、G堿基占堿基總數(shù)量的百分比不超過60%。本發(fā)明上述的非變性PAGE電泳核酸標(biāo)志物，單鏈DNA和/或單鏈RNA的3'端還標(biāo)記非同位素(生物素)。本發(fā)明第三個目的是提供ー種使用上述非變性PAGE電泳核酸標(biāo)志物進行凝膠電泳檢測核酸的方法，步驟包括
步驟1，核酸探針與待測核酸液相雜交；步驟2，加入分子對照物進行凝膠電泳；
步驟3，確定待測核酸探針和目的核酸的雜交鏈在凝膠電泳遷移。其中，所述待測核酸為可以是彡200bp的核酸，包括RNA和DNA。其中，所述凝膠電泳可以是含變性劑的PAGE或非變性PAGE凝膠電泳，最優(yōu)選為非變性PAGE凝膠電泳。本發(fā)明用于非變性PAGE電泳的核酸對照物，可起到有效的分子標(biāo)志作用，填補了缺乏液相雜交-非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳下的分子對照物空白；該非變性PAGE電泳的核酸對照物中DNA單鏈對照物同樣也適用于變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的分子對照，拓展了該系列分子對照物的應(yīng)用。


圖1為使用末端轉(zhuǎn)移酶在單鏈DNA末端標(biāo)記生物素，經(jīng)聚丙烯酰胺膠電泳檢測顯示結(jié)果；
圖2為紫外交聯(lián)固定，結(jié)合鏈親和霉素-HRP，顯影發(fā)光檢測不同分子雜交鏈標(biāo)記的有效性結(jié)果；
圖3為各DNA單鏈及不同大小單鏈DNA混合后在非變性PAGE電泳的遷移； 圖4為使用本發(fā)明的核酸標(biāo)志物檢測微小RNA在非變性PAGE電泳遷移； 圖5為使用本發(fā)明RNA-DNA雙鏈為對照物、凝膠電泳監(jiān)測微小RNA電泳照片； 圖6為使用本發(fā)明DNA-DNA雙鏈為對照物、凝膠電泳監(jiān)測微小RNA電泳照片。
具體實施例方式核酸對照物序列的設(shè)計源于探針與目的核酸雜交的原理，綜合考慮到序列的可靠性及能在一定條件下形成雜交雙鏈或雜化鏈。目前用于核酸雜交的探針主要有DNA探針、 cDNA探針、RNA探針、cRNA探針、寡核苷酸探針等，寡核苷酸單鏈DNA探針應(yīng)用較為廣泛，技術(shù)相對成熟。本發(fā)明根據(jù)序列類型及堿基互補配對原則，液相雜交后形成RNA-DNA雙鏈、 DNA-DNA雙鏈，提供了具有較高實用性的可用于非變性PAGE的分子對照物。首先根據(jù)寡核苷酸探針要求設(shè)計核酸對照物序列，但是為了避免單鏈DNA/RNA內(nèi)部形成發(fā)夾或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，同一堿基連續(xù)不超過4個，A、G堿基不超過堿基總數(shù)的60%，不同數(shù)目的核苷酸間不互補。合成DNA單鏈及其互補DNA序列，RNA單鏈及其互補的DNA序列，使用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)在單鏈DNA 3’末端標(biāo)記非同位素(生物素)，經(jīng)聚丙烯酰胺膠電泳-轉(zhuǎn)移至尼龍膜-HRP偶聯(lián)的鏈親和霉素檢測寡核苷酸標(biāo)記有效性；然后在液相雜交緩沖液中使RNA、DNA互補的序列模擬退火按照堿基互補配對原則形成RNA-DNA鏈、DNA-DNA雙鏈。運用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，驗證單鏈RNA、單鏈DNA、RNA-DNA雙鏈及DNA-DNA雙鏈在非變性聚丙烯酰胺膠中的遷移及評估作為小分子對照物的可能性。固相轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素膜后，結(jié)合鏈親和素酶-HRP，便可在X線光片顯影以確認各分子的大??；同樣，檢測單鏈DNA、RNA-DNA雙鏈、DNA-DNA雙鏈混合液中不同堿基數(shù)的核酸的遷移并評估作為小分子核酸對照物的實用性。下面參照附圖，通過實施例對本發(fā)明凝膠電泳核酸標(biāo)志物、及其指標(biāo)方法和應(yīng)用進行詳細的解釋和描述，以使更好地理解本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。實施例1
選取不同核苷酸數(shù)目的單鏈DNA序列和RNA序列，其中，單鏈NDA序列分別為10nt、 21nt、40nt、88nt，單鏈RNA序列分別為21nt、40nt。所述單鏈DNA序列如下 IOntDNA 序列(5 ‘ -3')
atgtagagctSEQ ID No. 1
IOntDNA 互補序列(5‘ -3')
agctctacatSEQ ID No. 2
2IntDNA 序列(5 ‘ -3')
acccagtagccagatgtagctbEQ ID No. 3
2IntDNA 互補序列(5‘ -3')
agctacatctggctactgggtSEQ ID No. 4
40ntDNA 序列(5' -3')
atcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgaggctSEQ ID No. 5
40ntDNA 互補序列(5' -3')
agcctcgcttcggcagcacatatactaaaattggaacgatSEQ ID No. 6
88ntDNA 序列(5' -3')
aaccatgacctcaagaacagtatttccaggaatccccatcttagcatctaagggattcctgggaaaactggac cgtgaggacaaggctbEQ ID No. 7
88ntDNA 互補序列(5' -3')
agccttgtcctcacggtccagttttcccaggaatcccttagatgctaagatggggattcctggaaatactgtt cttgaggtcatggttSEQ ID No. 8
2IntRNA 序列(5‘ -3')
agcuacaucuggcuacuggguSEQ ID No. 9
40 ntRNA 序列(5' -3') agccucgcuucggcagcacauauacuaaaauuggaacgauSEQ iD No. 10
使用末端轉(zhuǎn)移酶在單鏈DNA的3'端標(biāo)記生物素，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，顯示單鏈DNA末端成功標(biāo)記了生物素(圖1)。然后混合DNA單鏈及其互補DNA序列、RNA及其互補DNA序列，液相雜交形成 DNA-DNA雙鏈和DNA-RNA雜化鏈。液相雜交體系如下
DNA寡核苷酸A5μ 1
DNA寡核苷酸B5 μ 1 (或RNA單鏈)
退火緩沖液10 μ 1
總體積20 μ 1
按上述順序加入各試劑，混勻。置于95 ° C，5min，然后 42 ° C，2_3h。純化后，使用Exonuclease I特異性切除單鏈未雜交核酸，反應(yīng)體系如下雜交雙鏈混合物2. 5 μ g
10 X Exonuclease I 緩沖液2μ 1iixonuclease 丄10 μ 1
ddH20補充至20 μ 1
置于 37 ° C、30min;然后 80 ° C、15min。使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至尼龍膜，紫外交聯(lián)固定，結(jié)合鏈親和霉素-HRP，顯影發(fā)光檢測不同分子雜交鏈標(biāo)記的有效性。結(jié)果顯示，雜交后的條帶在未雜交條帶上方，各雜交條帶按堿基數(shù)大小依次排列(圖2)。首先選擇10nt、21nt、40nt、88nt的單鏈DNA及其混合物在非變性聚丙酰胺膠電泳，確認不同單鏈DNA分子在非變性聚丙酰胺凝膠的遷移(圖3)。選擇21nt單鏈RNA及互補DNA、40nt的單鏈RNA及互補DNA分別雜交形成雙鏈， 并加入不同堿基數(shù)目的單鏈DNA混合物在非變性聚丙酰胺凝膠電泳，確認雜化雙鏈在非變性聚丙酰胺凝膠的遷移(圖3)。選擇10nt、21nt、40nt、88nt單鏈DNA及各自互補單鏈DNA分別雜交成雙鏈，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，確認DNA雙鏈在非變性聚丙酰胺凝膠的遷移(圖3)。本實施例制備的分子對照物具有如下特點
1)應(yīng)用于非變性聚丙烯酰胺膠電泳檢測小分子核酸，尤其適用于微小RNA的檢測，對變性聚丙烯酰胺膠檢測小RNA也具有分子參照作用。2)條帶大小和含量容易記住。單鏈DNA分子對照物10nt、21nt、40nt、88nt ； DNA-DNA 分子對照 21nt、40nt、88nt、176nt ；DNA-RNA 分子對照 4&it、80nt。3)可預(yù)先設(shè)置各條帶濃度，對DNA/RNA條帶進行粗略定量。4)單鏈DNA，或DNA-DNA雙鏈，DNA-RNA雙鏈穩(wěn)定性較好，可在_20°C長期保存，使用方便，快捷。實施例2
以檢測微小RNA (約20nt)為例，使用上述實施例制備的分子對照物進行非變性 PAGE電泳方法如下miRNA探針和總RNA液相雜交，雜交后的雙鏈長約40nt，加入含有 IOnt (2 μ Μ)、21nt (4 μ Μ)、40nt (4 μ Μ)、88nt (2 μ Μ)單鏈DNA分子對照物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。確定miRNA探針和目的核酸(待測核酸)的雜交鏈在非變性聚丙酰胺凝膠電泳遷移。結(jié)果如圖4所示，可以看出，miRNA探針與目的核酸雜交條帶與未雜交探針條帶分離。說明本發(fā)明上述實施例制備的分子對照物能夠用于非變性PAGE電泳檢測miRNA序列。實施例3 RNA-DNA雙鏈檢測實例
以檢測小RNA U6(約IOOnt)為例，使用上述實施例制備的分子對照物進行非變性PAGE 電泳方法如下U6探針和總RNA液相雜交，雜交后的條帶約120nt，加入含有42nt、80nt (各 2 μ M)的RNA-DNA雙鏈分子對照物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。確定U6探針和目的核酸 (待測核酸)的雜交鏈在非變性聚丙酰胺凝膠電泳遷移。結(jié)果如圖5所示，可以看出，U6探針與目的核酸雜交條帶出現(xiàn)在RNA-DNA雙鏈對照物SOnt上方。說明本發(fā)明上述實施例制備的分子對照物能夠用于非變性PAGE電泳檢測小RNA序列。實施例4DNA-DNA雙鏈檢測實例
以檢測微小RNA (約20nt)為例，使用上述實施例制備的分子對照物進行非變性 PAGE電泳方法如下miRNA探針和總RNA液相雜交，雜交后的雙鏈長約40nt，加入含有 20nt (4 μ Μ)、42nt (4 μ Μ) DNA-DNA雙鏈分子對照物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。確定 miRNA探針和目的核酸(待測核酸)的雜交鏈在非變性聚丙酰胺凝膠電泳遷移。結(jié)果如圖6所示，可以看出，miRNA探針與目的核酸雜交條帶與未雜交探針條帶分離。說明本發(fā)明上述實施例制備的分子對照物能夠用于非變性PAGE電泳檢測miRNA序列。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種凝膠電泳核酸標(biāo)志物，其特征在干，包括單鏈DNA，還包括DNA-DNA雙鏈和/或 DNA-RNA雜化雙鏈；其中，DNA-DNA雙鏈中的兩個單鏈DNA堿基數(shù)相同，并且互補；DNA-RNA 雙鏈中的單鏈DNA和單鏈RNA堿基數(shù)相同，并且互補。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝膠電泳核酸標(biāo)志物，其特征在干，所述DNA-RNA雜化鏈中單鏈RNA為IOnt 88nt的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所示的凝膠電泳核酸標(biāo)志物，其特征在干，所述單鏈小DNA、DNA-DNA 雙鏈和DNA-RNA雜化鏈中單鏈DNA為IOnt 88nt的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的凝膠電泳核酸標(biāo)志物，其特征在干，所述單鏈DNA和/或單鏈RNA中，同一堿基數(shù)量連續(xù)不超過4個，A、G堿基占堿基總數(shù)的百分含量彡60%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所示的凝膠電泳核酸標(biāo)志物，其特征在干，單鏈DNA和/或單鏈RNA 的3'端標(biāo)記非同位素。
6.ー種應(yīng)用權(quán)利要求1所述凝膠電泳核酸標(biāo)志物進行凝膠電泳檢測核酸的方法，其特征在于，步驟包括步驟1，核酸探針與待測核酸液相雜交；步驟2，加入權(quán)利要求1所述分子對照物中的一種或多種進行凝膠電泳；步驟3，確定待測核酸探針和目的核酸的雜交鏈在凝膠電泳遷移。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在干，所述待測核酸為<200bp的核酸。
8.—種如權(quán)利要求1所述的凝膠電泳核酸標(biāo)志物的制備方法，其特征在干，設(shè)計合成單鏈DNA、單鏈DNA互補系列和/或單鏈RNA ；單鏈RNA、單鏈DNA、單鏈DNA互補序列液相雜交按照堿基互補配對原則形成RNA-DNA雜化雙鏈和DNA-DNA雙鏈。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的凝膠電泳核酸標(biāo)志物的制備方法，其特征在干，所述單鏈DNA 或單鏈RNA中，同一堿基數(shù)量連續(xù)不超過4個，A、G堿基占堿基總數(shù)的百分含量彡60%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的凝膠電泳核酸標(biāo)志物的制備方法，其特征在干，所述單鏈 RNA為IOnt 88nt的序列；所述單鏈DNA為IOnt 88nt的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種聚丙烯酰胺凝膠電泳核酸標(biāo)志物、所述凝膠電泳核酸標(biāo)志物的制備方法以及使用所述凝膠電泳核酸標(biāo)志物進行凝膠電泳檢測核酸的方法，所述凝膠電泳核酸標(biāo)志物包括單鏈DNA，還包括DNA-DNA雙鏈和/或DNA-RNA雜化雙鏈；其中，DNA-DNA雙鏈中的兩個單鏈DNA堿基數(shù)相同，并且互補；DNA-RNA雙鏈中的單鏈DNA和單鏈RNA堿基數(shù)相同，并且互補，可用于液相雜交后非變性PAGE凝膠電泳分子對照，尤其適用于對<200bp核酸的檢測。
文檔編號C12N15/11GK102534012SQ20121001498
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者姜斌, 時婧, 郭躍輝, 高豐厚 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院