專利名稱：抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及分子檢驗(yàn)領(lǐng)域的核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過反義“死”寡核苷酸競爭非特異性模板來干擾引物聚合等非特異性擴(kuò)增的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:核酸擴(kuò)增技術(shù)起源于1971年，Korana首先提出核酸體外擴(kuò)增設(shè)想:“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。其思想種子進(jìn)入到現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展的土壤就會(huì)生根、發(fā)芽。終于1983年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis在研究核酸測序方法時(shí)產(chǎn)生了核酸擴(kuò)增的靈感:于試管中模擬天然的DNA體內(nèi)指數(shù)式復(fù)制過程。其基本原理:提供一種合適的條件一模板DNA，寡聚核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間，就可成幾何級數(shù)地?cái)U(kuò)增已知兩端序列的一段DNA分子。經(jīng)過一系列探索、發(fā)展和耐熱聚合酶、熱循環(huán)儀的發(fā)明、應(yīng)用，Cetus公司于1987年申請了首個(gè)PCR發(fā)明專利(US Patent4，683，202)。核酸擴(kuò)增PCR反應(yīng)由變性一退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:擬擴(kuò)增的模板DN A經(jīng)加熱至94°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至54°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸:升溫至72°C左右，DNA模板一引物結(jié)合物在耐熱DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，尊循堿基反向配對與半保留復(fù)制原理，按5’ -3’方向合成一條新的與模板DNA鏈反向互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，不斷重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。一般PCR進(jìn)行30個(gè)循環(huán)就能將待擴(kuò)目的基因呈指數(shù)擴(kuò)增放大數(shù)百萬倍以上，超過30個(gè)循環(huán)引物二聚體非特異性擴(kuò)增就極劇增加。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y =(1+X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，η代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期PCR產(chǎn)物逐漸增加，進(jìn)入一定循環(huán)后靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式即對數(shù)期，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的累積及PCR成份的消耗，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，達(dá)到“停滯效應(yīng)”平臺(tái)期。隨著1985-1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到Taq耐熱DNA聚合酶以及pfu、Vent、Tth等其它耐熱聚合酶的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用，PCR技術(shù)逐漸成熟、實(shí)用，并因其高靈敏度、操作簡便而快速傳播全世界，因而1989年稱為“PCR爆炸年”。PCR技術(shù)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的核心基礎(chǔ)技術(shù)，Kary Mullis也因此榮獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在以后的二十年里，多達(dá)數(shù)十種PCR新改進(jìn)，新方法不斷涌現(xiàn)，被發(fā)明，包括反轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR)，原位 PCR,連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction, LCR)，標(biāo)記PCR(Labeled primers, LP-PCR),反向 PCR(reverse PCR,擴(kuò)增兩引物外側(cè)未知序列)，不對稱 PCR(asymmetric PCR),降落 PCR(touchdown PCR),重組 PCR(recombinant PCR),巢式 PCR(nest PCR)，多重 PCR(multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA 差異 PCR，鏈替換擴(kuò)增(Strand displacement amplification, SDA),依賴核酸序列的擴(kuò)增(Nucleicacid sequence-based amplification, NASBA),轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(Transcript-basedamplification system, TAS), Q β 復(fù)制酶(Q-beta replicase)催化 RNA 擴(kuò)增，滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling circle amplification, RCA),環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(Loop mediated isothermalamplification, LAMP)等，尤其是各種實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time PCR)技術(shù)的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了從定性測定到精確定量的飛躍，如熒光染料SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR和各種熒光探針Taqman(Hydrolysisprobe) ,FRET Hybridition probes,and Molecular Beacons PCR,詳見綜述(Maisa L.Wong and Juan F.Medrano, BioTechniques39:75-85, July 2005)。核酸擴(kuò)增技術(shù)不僅極大提升了基因克隆技術(shù)也提高了核酸檢測靈敏度、效率，PCR應(yīng)用已拓展到生物學(xué)的眾多領(lǐng)域。PCR技術(shù)已不是單一技術(shù)方法，而是包括一系列理論、方法學(xué)及應(yīng)用的新學(xué)科。詳細(xì)綜述于PCR書籍(黃留玉等“PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用”化學(xué)工業(yè)出版社2005年)，PCR廣泛應(yīng)用于分子克隆、測序、基因重組、蛋白質(zhì)工程等生命科學(xué)研究，及醫(yī)療、農(nóng)林、畜牧、環(huán)保、食品等眾多檢測應(yīng)用領(lǐng)域，已成為二十一世紀(jì)生物學(xué)最核心的基礎(chǔ)技術(shù)。近年來，在PCR基礎(chǔ)上為提高檢測效率而發(fā)展出了許多增加熱循環(huán)速度的快速微流體縮微PCR(lab-on-chip)和多重靶檢測的高通量納升PCR芯片(PCR-on_chip)，詳見論文SURVEYand SUMMARY, Da Xing (2007) Nucleic Acids Res.，Vol.35，N0.13，p4223_4237，截至目前全世界PCR專利或相關(guān)的設(shè)計(jì)更是多達(dá)四至五位數(shù)以上。綜上，常規(guī)終末檢測PCR只能定性分析，靈敏度不夠，低于1000拷貝數(shù)標(biāo)本測不了否則引物二聚體非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致假陽性結(jié)果，以及擴(kuò)增產(chǎn)物汽霧膠再污染所致假陽性等難題，常規(guī)PCR加產(chǎn)物凝膠電泳檢測方法難以適用臨床檢驗(yàn)等應(yīng)用檢測。1992年Higuchi等首次提出了采用動(dòng)態(tài)PCR方法和封閉式熒光檢測方式對目的基因數(shù)量進(jìn)行分析，為解決傳統(tǒng)PCR的難題提出了新思路。實(shí)時(shí)熒光PCR定量分析是通過實(shí)時(shí)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物量(產(chǎn)物標(biāo)記熒光強(qiáng)度)與起始靶基因量直接相關(guān)而定量。擴(kuò)增產(chǎn)物量增加的熒光信號(hào)達(dá)到對數(shù)期的循環(huán)數(shù)Ct值(Cycle threshold)與祀模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在負(fù)相關(guān)線性關(guān)系。即起始模板稀釋一倍達(dá)到同樣對數(shù)期熒光強(qiáng)度所需的擴(kuò)增循環(huán)就要增加一個(gè)循環(huán)數(shù)(Ct)。擴(kuò)增產(chǎn)物增加的信號(hào)既可通過產(chǎn)物DNA結(jié)合熒光染料顯示，如基于熒光染料SYBR Green I的實(shí)時(shí)熒光PCR(US Patent6, 569, 627);又可采用帶淬滅基團(tuán)的熒光探針來檢測。被淬滅的熒光探針即可以通過降解而激活，如1995年美國PE公司研制出了 Taq酶水解的熒光標(biāo)記探針及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)(Livak KJ，et al.，1995，Genome Res:4:357_362)，于 1997 年申請了水解探針(商品名:TaqMan) PCR發(fā)明專利(US Patent 6，485，903),以及Epoch公司在水解熒光探針基礎(chǔ)上增加結(jié)合效率的MGB探針(US Patent 7，205，105)。被淬滅的熒光探針也可以通過二級結(jié)構(gòu)改變而激活,分子信標(biāo)Molecular beacon (Tyagi S, et al, 1996,NatBiotechnol 14:303-308)正是這樣一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雜交探針，于1999年申請了 Molecularbeacon發(fā)明專利(US Patent 05925517)。其它雙雜交(FRET)探針，蝎形(Scorpion)探針，Sunrise-Primer, Lux Pimers等使用范圍局限于一定的應(yīng)用，不明顯優(yōu)于水解探針TaqMan方法。熒光染料SYBR Green I的實(shí)時(shí)熒光PCR法靈敏度可達(dá)數(shù)個(gè)拷貝，定量精確，但引物二聚體擴(kuò)增結(jié)合熒光的假陽性限制了其臨床應(yīng)用；而水解探針TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR增加了一道特異探針雜交，非特異性引物二聚體擴(kuò)增不產(chǎn)生熒光，廣泛用于臨床檢驗(yàn)，但也存在靈敏度低一個(gè)數(shù)量級，定量線性關(guān)系不精確。不同于常規(guī)PCR檢測終末反應(yīng)-平臺(tái)期擴(kuò)增產(chǎn)物，一般PCR只擴(kuò)增25至30個(gè)循環(huán)產(chǎn)物量就夠用了 ；而實(shí)時(shí)熒光PCR需要檢測低至10拷貝靶分子的近Ct40循環(huán)數(shù)，TaqMan等標(biāo)記探針PCR至少需要擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，基于熒光染料SYBR Green I的實(shí)時(shí)熒光PCR為了發(fā)揮更高靈敏度通常需要擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。因此實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)存在著更嚴(yán)重的引物二聚體非特異性擴(kuò)增問題，極過量的僅四種堿基排列組合的一對引物存在25%以上的同源性，也具有25%的互補(bǔ)性，引物對3’末端少量互補(bǔ)雜交后在聚合酶作用下延伸形成引物二聚體，在隨后熱循環(huán)中以二聚體為模板被游離引物大量非特異性擴(kuò)增、并結(jié)合染料。在不加模板的基于染料SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)中，絕大多數(shù)一對引物產(chǎn)生二聚體的本底循環(huán)閾值(Ct值)一般在30個(gè)循環(huán)附近，有些引物對本底Ct值甚至不到25個(gè)循環(huán)，位于靶分子定量檢測范圍Ct值15-37循環(huán)或“黃金檢測窗口”之內(nèi)，嚴(yán)重干擾低濃度(拷貝數(shù))靶分子的定量和弱陽性誤讀。其實(shí)常被忽略的是TaqMan等探針實(shí)時(shí)熒光PCR亦存在引物二聚體問題，只是不見引物二聚體發(fā)射熒光，但會(huì)競爭PCR系統(tǒng)成份，降低擴(kuò)增效率而導(dǎo)致靈敏度降低，弱陽性易漏檢；定量也不準(zhǔn)確，低濃度(拷貝數(shù))線性關(guān)系及重復(fù)性不佳。實(shí)時(shí)熒光PCR “閉管分析”多數(shù)情況下并不完全密閉，也存在擴(kuò)增產(chǎn)物汽霧膠再污染的難題，除螺旋蓋毛細(xì)管外，大多數(shù)0.2ml PCR試管或96孔板，在熱循環(huán)95°C變性時(shí)，高溫高壓下就會(huì)有一些氣霧膠溢(擠)出管蓋，一個(gè)氣霧膠顆粒就含有IO5個(gè)分子拷貝，氣霧膠不僅含高濃度已擴(kuò)增陽性靶分子，更多的是過量一對引物間產(chǎn)生的引物二聚體擴(kuò)增或引物-探針聚合體的擴(kuò)增，且每一個(gè)檢測反應(yīng)管/孔都會(huì)產(chǎn)生引物二聚體非特異性指數(shù)擴(kuò)增。隨著重復(fù)同一 PCR，泄漏的污染物會(huì)得到反復(fù)地指數(shù)擴(kuò)增、積聚，隨后的實(shí)時(shí)熒光PCR不是從O循環(huán)開始而是從上次PCR結(jié)束循環(huán)數(shù)開始，污染物越來越多。擴(kuò)增產(chǎn)物汽霧膠再污染一般采用dUTP代替dTTP產(chǎn)物再結(jié)合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG，US Patent 6，090，553)選擇性降解污染產(chǎn)物，UDG/UNG隨后PCR熱變性失活，但在實(shí)際工作中對大量的引物二聚體含dUTP擴(kuò)增產(chǎn)物降解作用有限，并不能消除或推后SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR本底引物Ct值。為了克服引物二聚體造成的PCR假陽性結(jié)果使SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR等核酸擴(kuò)增技術(shù)不利于臨床檢測分析的局限，本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”在充分優(yōu)選的一對引物基礎(chǔ)上，采用一段與引物3’末端互補(bǔ)的4-14base反義寡核苷酸來模擬潛在的非特異性模板DNA，競爭性地結(jié)合引物3’末端而干擾抑制過量引物非特異性擴(kuò)增；或使用3’末端固相化任意序列4-9base (優(yōu)選5-7)反義堿基寡核苷酸結(jié)合引物熱啟動(dòng)緩釋，再進(jìn)行核酸PCR擴(kuò)增，既不干擾靶分子特異性擴(kuò)增，其本底又在PCR45個(gè)循環(huán)內(nèi)基本為一直線，沒有非特異性擴(kuò)增值干擾。再輔助以礦物油封閉下的一端引物緩釋熱啟動(dòng)及UNG修飾處理使核酸應(yīng)用檢測在PCR反應(yīng)內(nèi)沒有引物二聚體累積，PCR多重封閉沒有氣霧膠產(chǎn)生或僅沒有擴(kuò)增的氣霧膠，萬一可能的產(chǎn)物泄露也可進(jìn)一步被UNG有效酶解，多重保證不產(chǎn)生假陽性非特異性反應(yīng)，使核 酸擴(kuò)增檢測絕對可靠
發(fā)明內(nèi)容
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核酸擴(kuò)增PCR技術(shù)非特異性高背景主要是由引物二聚體(Primer Dimer)反復(fù)擴(kuò)增、累積造成的。目前采用的種種抑制引物二聚體ro非特異性擴(kuò)增的試劑、措施對引物-引物和靶-引物之間的作用缺乏特異針對性，沒有根本解決ro非特異性擴(kuò)增的限制。本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”從關(guān)鍵的引物作用差異化來解決特異問題。根據(jù)引物與特異模板為引物全長堿基都互補(bǔ)作用，而與非特異模板為僅引物3’末端互補(bǔ)起主要作用的推想。就提出一種摸擬非特異模板的反義“死”寡核苷酸來同非特異模板競爭引物3’末端，通過限制反義“死”寡核苷酸長度使其不能同特異模板競爭全長引物，從而大大減少引物二聚體非特異性擴(kuò)增的技術(shù)途徑。本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其基本特征在于能結(jié)合引物3’端的反義寡核苷酸來干擾PCR引物3’末端非特異性的策略，所述的反義寡核苷酸是特指一段4-14base由反義堿基組成的寡聚核苷酸。其關(guān)鍵特征在于反義堿基寡核苷酸保留Watson堿基配對雜交性能，但失去了作為PCR擴(kuò)增模板和引物功能，反義干擾寡核苷酸與非特異性模板競引物而PCR熱循環(huán)條件下不能與特異靶模板競爭引物，使一對引物PCR反應(yīng)內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生引物二聚體非特異性擴(kuò)增。反義寡核苷酸適用于有引物結(jié)合、延伸的各種PCR技術(shù)包括陣列擴(kuò)增等技術(shù)。所述發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”其特征是所述核酸擴(kuò)增技術(shù)的一端引物緩釋熱啟動(dòng)，所述的引物緩釋是引物雜交吸附于某一固體微球交聯(lián)的反義寡核苷酸，并溶解于某一比重大且粘性強(qiáng)的液體，固相微球可逆吸附與釋放引物。預(yù)加樣的緩釋引物常溫下不進(jìn)入PCR反應(yīng)液使擴(kuò)增不能進(jìn)行，熱變性后引物完全釋放入PCR反應(yīng)液啟動(dòng)PCR運(yùn)行，并且要不干擾PCR。引物緩釋熱啟動(dòng)適用于有引物作用的各種熱循環(huán)PCR技術(shù)。所述發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于固體微球一般包括納米(/小于20微米)葡聚糖凝膠或聚苯乙稀微球，表面帶弱陽性電荷的納米至微米級顆粒物質(zhì)如殼聚糖(Chitosan)，弱陰性離子交換樹脂/纖維素微球。微球表面帶活性基團(tuán)以氨基首選，因?yàn)閹д姾傻陌被⑶虮旧硪嗫晌胶怂嶝?fù)電荷。所述發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于引物緩釋溶劑一般采用比重大且粘性強(qiáng)的液體如15% -20% Dextran (w/v,葡聚糖)液，天然粘膠等，所述的引物緩釋溶劑溶解引物預(yù)先加入PCR管底室溫下不與后加的反應(yīng)液混勻，在PCR熱變性后粘稠引物才被熱混勻而釋放入反應(yīng)體系啟動(dòng)擴(kuò)增。所述發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于引物緩釋配合PCR反應(yīng)液表面用礦物油封閉，從而杜絕PCR產(chǎn)物氣霧膠擠出管蓋外二次污染，礦物油面上濺出的反應(yīng)液因缺少緩釋引物而PCR成份不全，所以沒有擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏。所述發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于反義干擾寡核苷酸選擇一種4-9base任意堿基反義寡核苷酸，采用任意堿基組合的每一個(gè)序列位置均四種堿基排列的寡核苷酸，排列組合數(shù)=4n(n為序列堿基數(shù))，覆蓋了所有潛在的非特異性結(jié)合。任意堿基反義寡核苷酸采用納米活性微球共價(jià)交聯(lián)固相化，加入1-5 μ M的固相化反義寡核苷酸就可結(jié)合多數(shù)引物而間接固相化引物并抑制熱循環(huán)中引物非特異性擴(kuò)增。
所述發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于反義干擾寡核苷酸選擇一種4-14base特異堿基反義寡核苷酸，所述的特異堿基反義寡核苷酸序列與引物3’末端序列互補(bǔ)，優(yōu)選5’ -3’方向平行互補(bǔ)，加入0.1-1OOpM的特異反義寡核苷酸結(jié)合特異配對引物，抑制PCR反應(yīng)中引物非特異性擴(kuò)增。采用比重大且粘性強(qiáng)的溶劑如葡聚糖溶解反義寡核苷酸結(jié)合引物，粘稠引物與其它PCR成份短暫分隔而緩釋熱啟動(dòng)。所述發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于反義干擾寡核苷酸的反義喊基包括 2’-0-Methyl RNA、2’-Fluoro RNA、2’-0,4’-C-methylene bridgeRNA(LNA 鎖核酸)、和 PNA(妝核酸)、Morpholino、N3’ - > N5’ Phosphoramidate 等。其中 RNA 類反義喊基包括 2’ -O-Methyl RNA、2，F(xiàn)luoro RNA、2，-0,4，-C-methylene bridgeRNA(LNA鎖核酸)組成的反義干擾寡核苷酸3’末端羥基封閉。所述發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于反義干擾寡核苷酸的反義堿基可間隔1-5個(gè)正常堿基而合成嵌合DNA，這種經(jīng)濟(jì)嵌合的特異堿基反義寡核苷酸適合大部分PCR;而較短的任意堿基反義寡核苷酸全部采用反義堿基，特別適合多重PCR。所述發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于其技術(shù)用于基因檢測試劑盒，盒成份包括:核酸提取試劑，dNTPs, Taq等DNA聚合酶及其緩沖液，逆轉(zhuǎn)錄酶及其緩沖液，上游引物F /下游引物R，熒光染料或探針，標(biāo)準(zhǔn)對照物，純化水dH20，礦物油。本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其應(yīng)用的PCR擴(kuò)增基本原理、操作流程及適用范圍均同于一般常規(guī)核酸擴(kuò)增PCR技術(shù)，只是引物結(jié)合了一段短“反義”堿基寡核苷酸序列。雖然反義寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides, Stein C.A,2002,Molecular Cancer Therapeutics Vol.1,p347_355,Minireview)大量應(yīng)用于代謝研究和作為治療藥物，但目前尚未見為了減少引物二聚體非特異性擴(kuò)增的引物結(jié)合“反義”堿基寡核苷酸方法。本發(fā)明內(nèi)容主要是以熒光染料SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)來書寫、實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用，原因是基于染料SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)原理簡單、直觀，定量數(shù)據(jù)容易分析，并不是表示本發(fā)明技術(shù)僅限于SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR這一技術(shù)。本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”適用于有引物雜交、延伸的各種核酸擴(kuò)增技術(shù)而解決其引物二聚體非特異性擴(kuò)增的根本問題。核酸擴(kuò)增系統(tǒng)一般由模板、引物、底物和聚合酶及相應(yīng)的緩沖液組成，其中引物不僅決定著檢測的特異性，而且擴(kuò)增產(chǎn)物直接從引物延伸而來，靶核酸擴(kuò)增數(shù)百萬倍是由于過量的數(shù)百億倍的引物作用所致，一對擴(kuò)增引物往往使用5 μ Μ/L或5ρΜ/ μ I濃度(反應(yīng)終濃度 0.1 μ Μ/L 或 0.1pM/ μ I)，折算成分子數(shù)為 5 X 6.02 X 1017/L 或 5 X 6.02 X IO11/ μ 1.其數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量于模板濃度，甚至較最終擴(kuò)增產(chǎn)物分子數(shù)目也高出千倍以上。一對引物每條濃度必須3-5 μ Μ/L或3-5ρΜ/ μ I才能有效的特異性擴(kuò)增靶模版，如此極過量的一對引物3’末端彼此間有互補(bǔ)即相互雜交延伸產(chǎn)生二聚體，再大量被非特異性擴(kuò)增。引物二聚體形成一般是借助其3’末端多個(gè)互補(bǔ)堿基反向配對、互為引物延伸形成二聚體，引物對之間多個(gè)連續(xù)反向互補(bǔ)堿基可通過常規(guī)引物設(shè)計(jì)方法規(guī)避。但堿基僅四種組成排列，引物3’末端與非特異性模板有1-2個(gè)互補(bǔ)序列不可避免，同時(shí)DNA單鏈有一定柔性彎曲度，引物3’末端少數(shù)堿基互補(bǔ)就可借助其互補(bǔ)區(qū)外的多個(gè)斷續(xù)配對堿基的合力結(jié)合、延伸一些序列，延伸了的引物對之間易多個(gè)堿基互補(bǔ)雜交、延伸產(chǎn)生二聚體，在隨后熱循環(huán)中以二聚體為模板被游離引物大量非特異性擴(kuò)增、并結(jié)合染料，在不加模板的基于染料SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR本底對照實(shí)驗(yàn)中，引物二聚體非特異性擴(kuò)增一般在30個(gè)左右熱循環(huán)開始進(jìn)入對數(shù)增長期，非特異性擴(kuò)增開始嚴(yán)重起來，對于一般PCR而言，30個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量足夠用了，大多PCR可以結(jié)束了，如果沒有二聚體擴(kuò)增產(chǎn)物的污染以及污染被反復(fù)擴(kuò)增，引物二聚體對于大多數(shù)30個(gè)熱循環(huán)以內(nèi)的PCR影響不太大。絕大多數(shù)一對引物產(chǎn)生二聚體的本底循環(huán)閾值(Ct值)一般在30-32個(gè)循環(huán)附近，實(shí)時(shí)熒光PCR第30-38個(gè)熱循環(huán)仍位于1000-10拷貝靶分子檢測范圍或黃金檢測窗口期，因此嚴(yán)重干擾低濃度靶分子精確定量和弱陽性標(biāo)本準(zhǔn)確定性(附

圖1)。引物形成二聚體理論上是低于引物間雜交Tm值溫度時(shí)耐熱聚合酶部分催化作用，但是熱變性熱啟動(dòng)PCR的本底引物Ct值也僅推后1-3個(gè)循環(huán)數(shù)，多在Ct33個(gè)循環(huán)左右。因此熱啟動(dòng)僅能破壞一對引物3’末端個(gè)別1-2個(gè)堿基雜交，引物二聚體大部分成因還應(yīng)該是源于熱循環(huán)引物退火溫度54°C時(shí)末端少數(shù)互補(bǔ)堿基再借助3’末端外的引物間多個(gè)不連續(xù)配對互補(bǔ)堿基的合力結(jié)合、而延伸產(chǎn)生二聚體；也存在可能引物退火溫度時(shí)，其3’末端分子熱運(yùn)動(dòng)碰撞Taq酶催化每次延伸一兩個(gè)堿基。還有常常被大家忽略的是TaqMan等探針實(shí)時(shí)熒光PCR亦存在引物二聚體問題，只是不見引物二聚體發(fā)射熒光，但會(huì)耗盡PCR系統(tǒng)成份，降低擴(kuò)增效率使弱陽性定量不準(zhǔn)或漏檢。更嚴(yán)重的是TaqMan等探針與過量引物之間亦會(huì)有互補(bǔ)雜交、延伸,一些TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR的本底循環(huán)閾值(Ct值)在36-38個(gè)循環(huán)附近，亦有一定的假陽性誤診。在不加模板，僅加一對引物與TaqMan探針的SYBR Green I實(shí)時(shí)PCR的本底Ct值提前至25個(gè)循環(huán)左右，說明引物加探針PCR會(huì)形成一些“帶探針序列的二聚體、聚合體”，隨后非特異性擴(kuò)增的“二聚體、聚合體”競爭結(jié)合大量TaqMan探針，導(dǎo)致一定的假陽性和低濃度靶模板不易競爭探針?biāo)蚂`敏度降低而弱陽性漏檢。核酸擴(kuò)增假陽性結(jié)果可能的原因還包括:⑴過量引物與無關(guān)DNA模版的非特異性雜交、擴(kuò)增，首先引物設(shè)計(jì)除考慮靶基因外，樣本中所有核酸DNA可能交叉雜交的大段連續(xù)堿基序列均必須排除在引物選項(xiàng)之外，這樣即使存在個(gè)別區(qū)少量雜交也僅導(dǎo)致線性擴(kuò)增，非特異性擴(kuò)增不聚焦；不容易產(chǎn)生一對引物恰好都非特異性雜交于一段無關(guān)DNA的指數(shù)式擴(kuò)增。其次，因無關(guān)DNA模板濃度比較低，過量的引物與低濃度隨機(jī)無關(guān)序列DNA要進(jìn)行比較多個(gè)循環(huán)才有可能非特異性Ct值，但加樣過多模版也會(huì)提升引物二聚體H)所致的本底Ct值。(2)擴(kuò)增產(chǎn)物氣霧膠再污染，其主要成份是引物二聚體，也包含陽性擴(kuò)增產(chǎn)物片段。防止氣霧膠溢出擴(kuò)散的關(guān)鍵是采用螺旋蓋PCR管、加礦物油封閉等密閉措施，但即使PCR反應(yīng)液表面加一層礦物油也因加樣/礦物油時(shí)濺出的或液面管壁上殘留的PCR混合液仍然能在熱蓋條件下有效PCR擴(kuò)增，并有產(chǎn)物氣霧膠溢出，造成下次同一重復(fù)PCR交叉污染。防止這種污染的一個(gè)措施是同時(shí)采用dUTP代替dTTP的底物(dNTP)，dUTP不影響正常PCR擴(kuò)增，但PCR產(chǎn)物氣霧膠污染因含dUTP的單鏈/雙鏈DNA均被擴(kuò)增體系預(yù)加的UDG酶降解，理論上UDG酶可從含dUTP六個(gè)堿基以上的DNA片段切除dUTP，對于大于IOObp陽性靶分子片段比較有效，而實(shí)際PCR檢測中對于引物二聚體作用降解極其有限，可能引物二聚體太短，含dUTP密度不夠而量又大。核酸擴(kuò)增系統(tǒng)的引物、底物和聚合酶及相應(yīng)的緩沖液buffer和Mg2+離子成份均是長期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，允許變化的范圍非常窄，簡單的濃度改變對引物二聚體非特異性擴(kuò)增和靶特異性擴(kuò)增的效果基本 均是平行的作用。如使用降低一半濃度的常規(guī)引物能顯著降低二聚體的形成量，但也同時(shí)平行急劇降低特異性靶模板擴(kuò)增數(shù)量，使正常PCR不能進(jìn)行。改變聚合酶及相應(yīng)的緩沖液buffer和Mg2+、K+離子效果基本也是同樣結(jié)果。但對于擴(kuò)增100-200bp短模板常規(guī)實(shí)時(shí)熒光PCR尤其TaqMan探針法而言，使用降低一半常規(guī)濃度dNTP底物可提高部分?jǐn)U增效率。核酸擴(kuò)增技術(shù)常常采用多種PCR增強(qiáng)劑，如甜菜堿(Betaine)，二甲基亞砜(DMSO)，甲/乙酰胺和二甲基甲酰胺(DMF)等增加擴(kuò)增效率、平行推前約1-2個(gè)Ct值，更主要還是有效增進(jìn)模板二級結(jié)構(gòu)解鏈而增加擴(kuò)增效率，但也都平行增加引物二聚體本底Ct值，而對靶特異擴(kuò)增和引物二聚體非特異性擴(kuò)增沒有特別選擇性。尋找解決引物二聚體非特異性擴(kuò)增關(guān)鍵性措施還得從引物的靶特異配對和堿基互補(bǔ)非特異性雜交的差異化規(guī)律去探索。本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其原理是基于PCR過量引物3’末端與任意DNA有任何堿基互補(bǔ)都會(huì)雜交延伸尤其是過量引物3’末端與過量引物作為模板DNA間更易雜交延伸進(jìn)而一對引物間互為模板和互為引物形成引物二聚體非特異性擴(kuò)增，短的非特異性雜交雖沒有引物-靶特異性雜交優(yōu)勢但極度過量亦帶來一定程度非特異性延伸擴(kuò)增，且引物二聚體一旦形成就是其引物最具競爭優(yōu)勢的指數(shù)擴(kuò)增模板。最根本核心特征是這種非特異性雜交區(qū)因引物優(yōu)選設(shè)計(jì)而會(huì)很短，潛在的非特異性擴(kuò)增模板序列一定是引物3’末端互補(bǔ)堿基序列。因此一條創(chuàng)新思路就是利用“反義”寡核苷酸模擬非特異性擴(kuò)增模板，僅競爭性地結(jié)合引物3’末端而因修飾的“反義”堿基序列既不能充作擴(kuò)增模板也不能充作擴(kuò)增引物，這種僅保留結(jié)合功能“死的”反義寡核苷酸長過非特異性雜交區(qū)而選擇性地競爭抑制引物非特異性擴(kuò)增；“反義”寡核苷酸又明顯短于引物-靶特異性雜交長度而不影響熱循環(huán)條件下特異性靶擴(kuò)增Ct值。在PCR反應(yīng)循環(huán)內(nèi)消除了引物二聚體的擴(kuò)增(附圖2)，也就杜絕了連續(xù)、反復(fù)同一 PCR擴(kuò)增時(shí)累積氣霧膠的污染之源。本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其內(nèi)容是采用各種3’端輕基封閉的反義寡核苷酸，包括第一代的Methylphosphate Oligonucleotides (甲基磷酸骨架寡核苷酸)，Phosphorothioate Oligonucleotides (硫代磷酸骨架寡核苷酸)，這種第一代反義寡核苷酸能抵抗核酸酶水解而應(yīng)用于gene silence/knockout (基因沉默或敲去)研究和作為抗癌藥物，但對某些保真度不高的核酸聚合酶如Taq沒有抑制，起不到較好的“反義”作用。新一 代的反義寡核苷酸僅保留堿基結(jié)合功能而失去了作為擴(kuò)增模板或引物等核酸基本性能，包括 2’-0-Methyl RNA、2’Fluoro RNA、2’-0,4’-C-methylene bridgeRNA (LNA 鎖核酸)、和 PNA (妝核酸)、Morpholino、N3’ - > N5’ Phosphoramidate 等。不同于代謝研究和藥物使用13-25nt (nucleotides)長反義寡核苷酸,本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義寡核苷酸”是采用4-14nt/base末端羥基封閉的反義寡核苷酸，其序列與引物3’最末端堿基序列互補(bǔ)配對，平行方向互補(bǔ)配對抑制引物非特異性擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于反向互補(bǔ)配對。依據(jù)反義寡核苷酸長短不同，引物(5μΜ濃度)中含0.1ρΜ-100ρΜ不等,較長的反義寡核苷酸加低濃度的而較短的依次增加濃度得到最佳引物非特異性抑制效果。由于反義寡核苷酸有效使用濃度明顯低于引物濃度，反義寡核苷酸既可采用全長反義堿基序列也可以采用正常堿基與反義堿基間隔的策略，采用正常堿基與反義堿基間隔的反義寡核苷酸經(jīng)濟(jì)便宜，但這種部份反義寡核苷酸是一把雙刃劍，既抑制引物非特異性擴(kuò)增又可部分成為引物非特異性模板，其在引物(5 μ M濃度)中的量不能超過10ρΜ-1000ρΜ，否則引物二聚體非特異性擴(kuò)增本底Ct值明顯前移。RNA類反義堿基序列不能有效作為擴(kuò)增模板但仍可為引物，其末端羥基必須封閉但可僅限于3’末端，可采用乙?；?、磷酸基團(tuán)、氨基、烷基、醛基、羧基、生物素、地高辛、膽固醇、及各種淬滅基團(tuán)等選一種經(jīng)濟(jì)高效交聯(lián)來封閉末端羥基的延伸；反義寡核苷酸3’末端最后一個(gè)堿基也可采用雙脫氧堿基或3’ Inverted dT來封閉末端的延伸。反義寡核苷酸結(jié)合抑制一條引物就能有效抑制非特異性擴(kuò)增，一對引物都設(shè)制反義寡核苷酸可進(jìn)一步降低非特異性本底但PCR體系也帶來更多的復(fù)雜性、和不確定交叉非特異性。不同的PCR體系最終需要通過實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)取舍。本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其反義寡核苷酸亦可采用一些變通方法，如首先常規(guī)合成正常普通堿基的寡核苷酸，在其堿基未脫保護(hù)情況下作廣泛的烷基化、?；?、鹵代、及氧化等化學(xué)修飾，其末端羥基可簡單鹵氫酸反應(yīng)鹵代封閉，最后脫堿基保護(hù)基生成保留堿基特異性結(jié)合的抑制非特異性擴(kuò)增反義寡核苷酸。其次設(shè)計(jì)與引物3’最末端堿基序列互補(bǔ)配對的短4_7nt/base全反義堿基寡核苷酸,再連續(xù)合成串聯(lián)的重復(fù)序列反義寡核苷酸二聚體或化學(xué)交聯(lián)成重復(fù)序列反義二聚體及一些變通。最佳的策略還是合成4_9nt/base全反義堿基寡核苷酸全排列集合，即4_9nt/base序列包含所有排列組合的每一個(gè)序列位置均四種堿基排列，排列組合數(shù)=4n(n為序列堿基數(shù))，覆蓋了所有的非特異性雜交，引物(5μΜ濃度)中含量=100ρΜ-1ρΜΧ4η(η為序列堿基數(shù))不等的反義寡核苷酸ΝΝΝΝ-ΝΝΝΝΝΝΝΝΝ (N為任意堿基)混合物可以抑制任意可能的引物非特異性擴(kuò)增。以 7nt/base 為例，引物(5 μ M 濃度)中含量=IOpMX47 = 1.64Χ105ρΜ = 1.64Χ10-1μΜ。使用1-2 μ M的3’末端固相化(交聯(lián)微球)任意序列4-9base反義堿基寡核苷酸不僅抑制任意可能的引物非特異性擴(kuò)增，還可以使引物結(jié)合固相化反義堿基寡核苷酸并溶于15-20%Dextran (葡聚糖)液中而間接固相化，這種固相引物又可輕易被PCR熱啟動(dòng)釋放。于18%Dextran中的一端緩釋固相化引物預(yù)先加入PCR管底，再依次小心沿管壁加入PCR反應(yīng)液、樣本模板和礦物油封閉，固相化引物由于Dextran比重大而沉于管底，不要混勻以免破壞緩釋層，短瞬離心使固相化引物顆粒和加礦物油沖起的反應(yīng)液下沉。進(jìn)行PCR反應(yīng)熱變性后釋放引物進(jìn)入PCR反應(yīng)液，恢復(fù)所有成份后PCR有效擴(kuò)增，既不干擾靶分子特異性Ct值，其本底又在PCR45個(gè)循環(huán)內(nèi)基本為一直線。PCR時(shí)熱蓋并不能封閉擴(kuò)增反應(yīng)，仍需要加礦物油封閉，但在礦物油面上的殘留反應(yīng)液PCR時(shí)會(huì)揮發(fā)至管頂而擋住熒光光路，所以有礦物油時(shí)PCR儀仍需要設(shè)置熱蓋，而熱蓋條件下殘留反應(yīng)液留在礦物油面上仍能有效熱循環(huán)擴(kuò)增，所以設(shè)置熱蓋但不要等熱蓋升溫就開始PCR，首先變性95°C 2-5分鐘使礦物油面上的殘留反應(yīng)液盡量揮發(fā)擠出管外 再等熱蓋升溫至105°C，同時(shí)管底預(yù)置的固相化緩釋引物使礦物油面上的殘留反應(yīng)液因缺少一引物成份而絕不會(huì)擴(kuò)增導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物氣霧膠交叉污染；固相化緩釋引物還使礦物油下面PCR反應(yīng)液熱啟動(dòng)，避免低溫時(shí)啟動(dòng)非特異性擴(kuò)增。PCR多重封閉沒有氣霧膠產(chǎn)生或僅沒有擴(kuò)增的氣霧膠，萬一可能的擴(kuò)增產(chǎn)物泄露也可進(jìn)一步被UNG有效酶解，多重保證不產(chǎn)生假陽性非特異性反應(yīng)，使核酸擴(kuò)增應(yīng)用檢測絕對可靠。消除常溫時(shí)聚合酶非特異性擴(kuò)增的熱啟動(dòng)PCR還包括其它PCR成份如dNTP緩釋，更常見的方法還是聚合酶Taq修飾抑制和蠟包Mg2+離子熱啟動(dòng)釋放，熱啟動(dòng)聚合酶Taq又包括端N缺失的KlenTaq,抗Taq酶抗體和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar,抑制非特異性擴(kuò)增效果都不是十分明顯，且抗體、Aptamar用量太大而抵消了一點(diǎn)熱啟動(dòng)優(yōu)勢。本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，聚合酶Taq(5U/l.! I)中加入微量0.5-0.7mg/100mlPoly-Phosphoric Acid(Sigma04101,多聚磷酸)單獨(dú)使用不影響祀特異擴(kuò)增Ct值,而多聚磷酸所帶負(fù)電菏常溫時(shí)結(jié)合抑制Taq酶、推后引物本底Ct值2-3個(gè)循環(huán)，與反義寡核苷酸結(jié)合緩釋引物聯(lián)用特別有效，相互加倍作用雙重?zé)釂?dòng)，進(jìn)一步保證了靶特異擴(kuò)增可靠性。本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”典型的幾種反義寡核苷酸引物PCR實(shí)例:1.RNA類反義干擾寡核苷酸PCR:常見的RNA 類反義核苷包括 2’ -0-Methyl RNA、2’ Fluoro RNA、2’ -O,4’-C-methylene bridge RNA (LNA鎖核酸)等,這類反義干擾寡核苷酸在PCR過程中不能作為擴(kuò)增模板，其合成采用成熟的亞磷酰胺固相法，5’連接DMT的四種苯甲酰保護(hù)環(huán)外氨基的A、C、丁酰保護(hù)環(huán)外氨基的G和T核苷亞磷酰胺修飾單體均有很多商業(yè)公司供應(yīng)，化學(xué)合成從3’ -5’方向，第一步控孔玻璃珠CPG-3’固相5’ DMT核苷脫DMT帽和分別活化單體成亞磷酰胺四唑、第二步偶聯(lián)單體與5’脫帽羥基而延伸一個(gè)堿基、第三步蓋帽-乙?；忾]未反應(yīng)的5’脫帽羥基、第四步氧化-碘液氧化而穩(wěn)定亞磷酯鍵，循環(huán)一至四步延伸至所需堿基長度；最后氨解脫保護(hù)及反向柱純化，末端羥基采用乙酸酐在N-甲基咪唑作用下乙酰化封閉延伸功能，或3’標(biāo)記磷酸。現(xiàn)有太多的商業(yè)公司提供合成服務(wù)，又既可以購買ABI公司全自動(dòng)合成儀合成，較短寡核苷酸也可手工固相法合成。序列在充分優(yōu)選的一對引物基礎(chǔ)上，采用一段與引物3’末端互補(bǔ)的4-14base反義寡核苷酸，而LNA鎖核酸堿基親和力高出RNA3-7°C、高出DNA2-5°C，所以LNA選用一段與引物3’末端互補(bǔ)的3_9base反義寡核苷酸。反義干擾寡核苷酸方向優(yōu)選5 ’ -3 ’方向與引物3 ’最末端平行配對互補(bǔ)的序列，既可合成全長反義堿基序列也可以與引物3’最末端互補(bǔ)的采用反義堿基及每個(gè)反義堿基間隔1-5個(gè)正常堿基的策略，采用正常堿基與反義堿基間隔的反義寡核苷酸經(jīng)濟(jì)易合成，但這種部份反義寡核苷酸既抑制引物非特異性擴(kuò)增又 可部分成為引物非特異性模板，最多加量須少于最佳抑制量的10-100倍。反義寡核苷酸來模擬潛在的非特異性模板DNA，競爭性地結(jié)合引物3’末端并干擾抑制過量引物非特異性擴(kuò)增；再進(jìn)行常規(guī)核酸PCR擴(kuò)增，既不干擾靶分子特異性擴(kuò)增，其本底又在PCR45個(gè)循環(huán)內(nèi)基本為一直線。一對上下游引物(51^/1)，其中一條加入0.1 1-100 11不等，較長的反義寡核苷酸加低濃度的而較短的依次增加濃度、實(shí)驗(yàn)得到最佳引物非特異性抑制效果，反義寡核苷酸引物于15% -20% Dextran (葡聚糖,w/ν)和0.1M NaCl中稀釋2_4倍作為熱啟動(dòng)緩釋引物，粘稠比重大的葡聚糖溶解引物預(yù)先加入管底室溫下不與后加的反應(yīng)液混勻，在PCR熱變性后粘稠引物才釋放入反應(yīng)體系啟動(dòng)擴(kuò)增。底物dNTP(IOmM)采用dUTP代替dTTP的底物，dUTP不影響正常PCR擴(kuò)增，但PCR產(chǎn)物氣霧膠污染因含dUTP的單鏈/雙鏈DNA均被擴(kuò)增體系預(yù)加的UDG酶降解，理論上UDG酶可從含dUTP六個(gè)堿基以上的DNA片段切除dUTP，對于大于IOObp陽性交叉污染片段降解比較有效。創(chuàng)新的10XPCR反應(yīng)buffer:含0.6MTris-CL (pH8.3) ,0.lMKCL,30mM (NH4)2SO4,16mM MgCL (TaqMan探針 18mM)使擴(kuò)增效率提高并更加耐受雜質(zhì)干擾。Taq 酶(5U/ μ I)加 0.0006% Poly-Phosphoric Acid (多聚磷酸，w/v)作為熱啟動(dòng)聚合酶并含(M)G酶(lU/μ I)。進(jìn)行25 μ I反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR，首先加2 μ I的緩釋引物(1.25 μ Μ)于PCR管底，不必?fù)Q吸頭；按比例配制PCR反應(yīng)液:
權(quán)利要求
1.“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于能結(jié)合引物3’端的反義寡核苷酸來干擾PCR引物3’末端非特異性的策略，所述的反義寡核苷酸是特指一段4-14base由反義堿基組成的寡聚核苷酸，其關(guān)鍵特征在于反義堿基寡核苷酸保留Watson堿基配對雜交性能，但失去了作為PCR擴(kuò)增模板和引物功能，反義干擾寡核苷酸與非特異性模板競引物而PCR熱循環(huán)條件下不能與特異靶模板競爭引物，使一對引物PCR反應(yīng)內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生引物二聚體非特異性擴(kuò)增，反義寡核苷酸適用于有引物結(jié)合、延伸的各種PCR技術(shù)包括陣列擴(kuò)增等技術(shù)。
2.“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”其特征是所述核酸擴(kuò)增技術(shù)的一端引物緩釋熱啟動(dòng)，所述的引物緩釋是引物雜交吸附于某一固體微球交聯(lián)的反義寡核苷酸，并溶解于某一比重大且粘性強(qiáng)的液體，固相微球可逆吸附與釋放引物，預(yù)加樣的緩釋引物常溫下不進(jìn)入PCR反應(yīng)液使擴(kuò)增不能進(jìn)行，熱變性后引物完全釋放入PCR反應(yīng)液啟動(dòng)PCR運(yùn)行，并且要不干擾PCR，引物緩釋熱啟動(dòng)適用于有引物作用的各種熱循環(huán)PCR技術(shù)。
3.根椐權(quán)利要求2所述的“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，所述的固體微球一般包括小于20微米的納米葡聚糖凝膠或聚苯乙稀微球，表面帶弱陽性電荷的納米至微米級顆粒物質(zhì)如殼聚糖，弱陰性離子交換樹脂/纖維素微球，微球表面帶活性基團(tuán)以氨基首選，因?yàn)閹д姾傻陌被⑶虮旧硪嗫晌胶怂嶝?fù)電荷。
4.根椐權(quán)利要求2所述的“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，所述的引物緩釋溶劑一般采用比重大且粘性強(qiáng)的液體如15%-20% (w/v)葡聚糖液，天然粘膠等，所述的引物緩釋溶劑溶解引物預(yù)先加入PCR管底室溫下不與后加的反應(yīng)液混勻，在PCR熱變性后粘稠引物才被熱混勻而釋放入反應(yīng)體系啟動(dòng)擴(kuò)增。
5.根椐權(quán)利要求2所述的“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，所述的引物緩釋配合PCR反應(yīng)液表面礦物油封閉而杜絕PCR產(chǎn)物氣霧膠擠出管蓋外二次污染，礦物油面上濺出的反應(yīng)液因缺少緩釋引物而PCR成份不全，所以沒有擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏。
6.根椐權(quán)利要求1所述的“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，所述的反義干擾寡核苷酸選擇一種4-9base任意堿基反義寡核苷酸，采用任意堿基組合的每一個(gè)序列位置均四種堿基排列的寡核苷酸，排列組合數(shù)=4η，η為序列堿基數(shù)，覆蓋了所有潛在的非特異性結(jié)合，任意堿基反義寡核苷酸采用權(quán)利要求2所述的微球共價(jià)交聯(lián)固相化，加入1-5 μ M的固相化反義寡核苷酸就可結(jié)合多數(shù)引物而間接固相化引物并抑制熱循環(huán)中引物非特異性擴(kuò)增。
7.根椐權(quán)利要求1所述的“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，所述的反義干擾寡核苷酸選擇一種4-14base特異堿基反義寡核苷酸，所述的特異堿基反義寡核苷酸序列與引物3’末端序列互補(bǔ)，優(yōu)選5’ -3’方向平行互補(bǔ)，加入0.1-1OOpM的特異反義寡核苷酸結(jié)合特異配對引物，抑制PCR反應(yīng)中引物非特異性擴(kuò)增，采用權(quán)利要求4所述的比重大且粘性強(qiáng)的溶劑葡聚糖溶解反義寡核苷酸結(jié)合引物，粘稠引物與其它PCR成份短暫分隔而緩釋熱啟動(dòng)。
8.根椐權(quán)利要求1所述的“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，所述的反義干擾寡核苷酸的反義堿基包括2’ -0-Methyl RNA、2’Fluoro RNA、LNA鎖核酸、和肽核酸、MorphoIino> N3’ - > N5’ Phosphoramidate,其中 RNA 類反義喊基包括 2’ -O-Methyl RNA>2’ Fluoro RNA、LNA鎖核酸組成的反義干擾寡核苷酸3’末端羥基封閉。
9.根椐權(quán)利要求1所述的“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，所述的反義干擾寡核苷酸的反義堿基可間隔1-5個(gè)正常堿基而合成嵌合DNA，這種經(jīng)濟(jì)嵌合的特異堿基反義寡核苷酸適合大部分PCR;而較短的任意堿基反義寡核苷酸全部采用反義堿基，特別適合多重PCR。
10.根椐權(quán)利要求1所述的“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于5U/ μ I聚合酶Taq中加入微量0.5-0.7mg/100ml Sigma04101多聚磷酸單獨(dú)使用不影響靶特異擴(kuò)增Ct值，而多聚磷酸所帶負(fù)電菏常溫時(shí)結(jié)合抑制Taq酶、推后引物本底Ct值2-3個(gè)循環(huán)，與反義寡核苷酸結(jié)合緩釋引物聯(lián)用特別有效，相互加倍作用雙重?zé)釂?dòng)，進(jìn)一步保證了靶特異擴(kuò)增可靠性。
11.根椐權(quán)利要求1所述的“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其特征在于其技術(shù)用于基因檢測試劑盒，盒成份包括:核酸提取試劑，dNTPs, Taq等DNA聚合酶及其緩沖液，逆轉(zhuǎn)錄酶及其緩沖液，上游引物F/下游引物R，熒光染料或探針，標(biāo)準(zhǔn)對照物，純化水dH20，礦物油。 ·
全文摘要
本發(fā)明“抑制引物非特異性擴(kuò)增的反義干擾寡核苷酸”，其通過結(jié)合引物3’端的反義寡核苷酸來干擾PCR引物3’末端非特異性的擴(kuò)增，所述的反義寡核苷酸是特指一段4-14base由反義堿基組成的寡聚核苷酸。其基本特征在于反義堿基寡核苷酸保留Watson堿基配對雜交性能，但失去了作為PCR擴(kuò)增模板和引物功能，通過納米微球固相化反義寡核苷酸來間接固相化引物于PCR系統(tǒng)緩釋熱啟動(dòng)，配合礦物油封閉PCR而杜絕氣霧膠交叉污染，使PCR反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。反義寡核苷酸適用于有引物退火、延伸的各種PCR技術(shù)包括陣列擴(kuò)增技術(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103205425SQ20121001511
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者江洪, 岳素文, 阮志強(qiáng), 江必勝, 江雨康 申請人:北京萬達(dá)因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司