專利名稱：可表達(dá)耐熱β-半乳糖苷酶的重組菌及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可表達(dá)耐熱β-半乳糖苷酶的重組菌及構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-半乳糖苷酶(EC3.2. 1.23)學(xué)名為β _D_半乳糖苷半乳糖水解酶，商品名為乳糖酶(lactase)，該酶不僅能催化水解半乳糖苷鍵，將乳糖水解成為半乳糖和葡萄糖，同時(shí)具有轉(zhuǎn)移半乳糖苷的作用，可以生成低聚半乳糖，主要用于乳制品的加工。β-半乳糖苷酶主要來源于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、酵母、霉菌。國外已經(jīng)商品化的半乳糖苷酶主要來源于大腸桿菌、黑曲霉、米曲霉、酵母、乳酸桿菌等。目前，僅來源與微
生物的半乳糖苷酶具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。利用微生物發(fā)酵法制取半乳糖苷酶，酶源豐富，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，周期短，而且不受季節(jié)、地理位置等因素的影響。該酶可廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥、免疫、環(huán)境檢測等各個(gè)領(lǐng)域。世界上平均約70%_90%的成年人(尤其是非洲人和亞洲人)喝牛奶后因缺乏β -半乳糖苷酶不能降解牛奶中大量的乳糖而產(chǎn)生乳糖不耐受。而在低乳糖乳制品中，半乳糖苷酶能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，可將乳糖含量降低70%-80%，可以減輕乳糖不耐受癥狀；還可以增加乳制品甜度，減少甜味劑的用量；防止乳制品的加工時(shí)結(jié)晶析出，影響產(chǎn)品質(zhì)量；以牛乳或乳清中的乳糖為底物，經(jīng)半乳糖苷酶催化可生成低聚半乳糖，低聚半乳糖的甜度為蔗糖的20%-40%，熱穩(wěn)定較好，在酸性條件下課作為雙歧桿菌增殖因子，促進(jìn)鈣質(zhì)吸收和有機(jī)酸生成、減低腸道ΡΗ、抑制外源菌生長和改善脂質(zhì)代謝。半乳糖苷酶還可以用于酶免疫分析，具有無內(nèi)源性干擾，底物無致癌性和顯色穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)；半乳糖苷酶與熒光底物相結(jié)合可作超微量熒光酶聯(lián)免；對微量激素、藥物的定量分析，以及病毒、 單克隆抗體等測定表明，乳糖酶具有靈敏的特點(diǎn)；乳清中含有乳糖，當(dāng)乳清大量排放時(shí)會(huì)造成環(huán)境污染，用乳糖酶處理乳清，不但可生產(chǎn)食品添加劑(甜味劑、蛋白資源)，易消化吸收的禽飼料和發(fā)酵原料(發(fā)酵生產(chǎn)酒精、乳酸、酶制劑等)，而且還可解決乳清大量排放造成的環(huán)境污染問題。一般而言，工業(yè)上所產(chǎn)生的酶大多數(shù)都反應(yīng)溫度較低，熱穩(wěn)定性不好，在乳制品生產(chǎn)應(yīng)用中有一定局限性。而耐熱半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性好，能在較高溫度下作用，這樣可以提高底物的濃度并能減少其它微生物的生產(chǎn)機(jī)會(huì)，對固定化酶很重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可表達(dá)耐熱β -半乳糖苷酶的重組菌，該重組菌能表達(dá)生產(chǎn)熱穩(wěn)定性半乳糖苷酶。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述重組菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明最后解決的技術(shù)問題是提供上述重組菌在生產(chǎn)耐熱β -半乳糖苷酶上的應(yīng)用。
為了解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種可表達(dá)耐熱半乳糖苷酶的重組菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(fecAericAia coli. )BL21-LAl,已于2011年7月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No. 5097。所述的可表達(dá)耐熱β-半乳糖苷酶的重組菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟用同樣的限制性內(nèi)切酶雙酶切表達(dá)載體PGEX-4T-2和β-半乳糖苷酶基因后，將β-半乳糖苷酶基因克隆到表達(dá)載體PGEX-4T-2中，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性重組工程菌菌落，提取質(zhì)粒，然后采用雙酶切和測序的方法鑒定。所述β-半乳糖苷酶基因來自嗜熱厭氧菌群。本發(fā)明還提供了一種利用所述的重組菌表達(dá)耐熱β -半乳糖苷酶的方法，以IPTG 為誘導(dǎo)劑培養(yǎng)重組菌BL21-LA1產(chǎn)酶，每IOOml發(fā)酵液培養(yǎng)菌體生長至OD 600達(dá)到0. 8后， 加入IPTG，使其終濃度達(dá)為1 mmol/L，37°C振蕩培養(yǎng)4_6 h，誘導(dǎo)重組蛋白獲得表達(dá)。本發(fā)明獲得了一株可表達(dá)耐熱β -半乳糖苷酶的重組菌，所述重組菌為大腸埃希 ^MiMscherichia coli. )BL21_LA1，已于2011年7月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，其簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No. 5097。該重組菌在含有100 mg/mL氨芐青霉素的2 X YT液體培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可獲得目的蛋白的高效表達(dá)。經(jīng)純化處理得到的熱穩(wěn)定半乳糖苷酶對底物ONPG的降解表現(xiàn)出很高的效率。本發(fā)明重組菌表達(dá)分泌的熱穩(wěn)定β -半乳糖苷酶存在多方面的優(yōu)勢1、其最適反應(yīng)溫度高達(dá)75°C，反應(yīng)范圍非常廣泛，在50-90°C均能發(fā)揮良好的酶活力；2、其適應(yīng)pH值的范圍較寬(PH5. 0-9. 0) ；3、其對去污劑、抑制劑及金屬離子的耐受性強(qiáng)。


圖1為熱穩(wěn)定性β -半乳糖苷酶基因克隆；A β -半乳糖苷酶基因PCR擴(kuò)增；B 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證iM·/Xho I )，其中泳道1-10分別表示隨機(jī)挑取的10個(gè)重組克隆子的質(zhì)粒DNA酶切圖。圖2為熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)；M=Protein marker; 1 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的非重組菌；2 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的非重組菌；3 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌；4 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌；5 純化的GST - β-半乳糖苷酶融合蛋白。圖3為溫度對重組β -半乳糖苷酶酶活和熱穩(wěn)定的影響；Α，最適反應(yīng)溫度；B，熱穩(wěn)定性。圖4為pH值對重組β -半乳糖苷酶酶活的影響。圖5為金屬離子對重組β -半乳糖苷酶酶活的影響。圖6為酶抑制劑和去污劑對重組β -半乳糖苷酶酶活的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等所著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(New YorkiCold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的實(shí)驗(yàn)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1.
菌群總DNA的提取及耐熱β -半乳糖苷酶基因的克隆
用改進(jìn)的CTAB/NaCl法提取從永泰熱泉中富集得到的菌群YTY-70 (用深水采樣器采取70°C溫泉2-3米處的深層水樣，樣品立即封存于厭氧瓶中，冷藏處理。以Hugate厭氧培養(yǎng)法以1%的接種量加入到100 mL的富集培養(yǎng)基中，一周后換到篩選培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接15代， 使得利用纖維素的相關(guān)菌群富集，得到菌群YTY-70)的總DNA，采用下列簡并引物GlaF 5，-ATG AGT TTT (A, C) CCA AAA GGA TT-3，，GlaR 5' -TTA C(T)GA G(A)TT TTC CTT TAT AT-3'擴(kuò)增熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶酶的基因。PCR反應(yīng)體系如下95°C，5 min ；再30個(gè)循環(huán)95°C，1 min ；57°C,1 min, 72°C 2 min ；最后 72°C延伸 10 min。如附圖 1 (A)所示， PCR所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳驗(yàn)證得到一個(gè)約1400bp的DNA片段，并經(jīng)測序所得該β -半乳糖苷酶的基因序列如序列表SEQ NO. 1所示。實(shí)施例2.
耐熱β-半乳糖苷酶重組工程菌構(gòu)建
將表達(dá)載體PGEX-4T-2用Ba·和損ο I進(jìn)行雙酶切，37°C酶切池。瓊脂糖凝膠回收大片段。將用實(shí)施例1擴(kuò)增的目的片段也同樣用和ZA0 I進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠回收目的基因片段。將回收得到的半乳糖苷酶的基因片段與表達(dá)載體PGEX-4T-2連接， 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含Ampl00ug/ml的LB平板上，挑取10個(gè)陽性重組克隆子，至含AmplOOug/ml的新鮮LB培養(yǎng)基中并提取質(zhì)粒。然后采用雙酶切和測序的方法鑒定目的基因是否成功插入。將成功插入目的片段的克隆子質(zhì)粒再次送出測序。結(jié)果如圖1 (B)所示，在隨機(jī)挑取的10個(gè)克隆子中，有9個(gè)成功插入β-半乳糖苷酶基因序列，插入成功率為90%。由測序結(jié)果得知，重組半乳糖苷酶基因的長度為 1359bp，含有一個(gè)編碼452個(gè)氨基酸的閱讀框，其氨基酸序列見序列表SEQ N0. 2。實(shí)施例3.
重組耐熱β-半乳糖苷酶的表達(dá)及純化
⑴挑取含有重組質(zhì)粒(含耐熱β -半乳糖苷酶基因)的單菌落，接種于2 X YT培養(yǎng)基中， 37°C, 250 rmp培養(yǎng)過夜。過夜菌按1 %接種量轉(zhuǎn)接至裝有新鮮的IOOmL含有100 mg/mLAmp 的2 X YT液體培養(yǎng)基中，37°C，250 rpm，培養(yǎng)至OD6tltl為0. 8。加入IPTG，使其終濃度達(dá)為 1 m mol/L，37°C振蕩培養(yǎng)4-6 h,使誘導(dǎo)重組蛋白獲得表達(dá)。⑵培養(yǎng)液于4°C，IOOOOrpm離心5min，棄上清，收集菌體，置于冰上。收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體。⑶按每mL培養(yǎng)物加入冰冷的10 ml PBS緩沖液。冰浴條件下超聲裂解細(xì)菌，超聲波條件150W，工作10 s，間隔10 s，30次。⑷加入20% Triton X-100使其終濃度為1 %，輕輕柔和30min。(5)4° C, 12, 000 X g離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至冰預(yù)冷的容器中。(6)上清與預(yù)先用PBS緩沖液平衡的Glutathione Sepharose 4B混勻，4° C輕搖 30min，裝柱。(7)用10倍柱床體積的PBS緩沖液洗去雜蛋白，重復(fù)操作3-5次。⑶用洗脫緩沖液(50 m mol/L Tris-HCl, 10 m mol/L還原型谷胱甘肽，ρΗ8· 0) 洗脫目的蛋白，所用的洗脫緩沖液與柱床體積相同。重復(fù)洗脫過程三次，合并三次洗脫流出液。(9) SDS-PAGE鑒定純化的融合蛋白。SDS - PAGE電泳結(jié)果(如附圖2)表明，與未誘導(dǎo)菌株相比，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后的重組菌株在66kDa處出現(xiàn)一條非常明顯的蛋白條帶(圖2，泳道2)，此條帶的大小符合β-半乳糖苷酶與GST融合蛋白的分子量(26kDa)之和符合。說明該基因成功插入表達(dá)載體 PGEX-4T-2后在大腸桿菌BL21中獲得了高效表達(dá)。實(shí)施例4.
表達(dá)純化得到的重組耐熱β -半乳糖苷酶(實(shí)施例3純化的融合蛋白)的性質(zhì)分析 重組耐熱β -半乳糖苷酶酶活測定方法將鄰硝基苯酚β -D半乳糖苷(ONPG)溶于0. 1 mol/L磷酸緩沖液(PH7.0)配制成0. 25%的底物溶液。取適當(dāng)稀釋的重組耐熱β _半乳糖苷酶液400 ml加入1.6ml底物溶液中，75°C保溫lOmin，加入2 ml 1 mol/L Nei2CO3顯色，以不加酶液的底物溶液(加入等體積0. 1 mol/L磷酸緩沖液(PH7. 0))作為對照，測定420nm光吸收值。計(jì)算水解產(chǎn)物鄰硝基酚(ONP)的含量，將測得的數(shù)據(jù)代入由標(biāo)準(zhǔn)曲線測量值計(jì)算出的回歸方程，再由回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的鄰硝基酚(ONP)的量，然后計(jì)算出酶活力大小。 酶活力單位定義一個(gè)酶活單位(u)即在pH7.0，溫度75°C條件下，每分鐘將ONPG分解為1 umol黃色的ONP所需的酶量。⑴重組耐熱β -半乳糖苷酶作用的最適溫度及溫度耐受情況
以0.25%的鄰硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)為底物，在0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7. 0)中，于不同溫度(35-95°C)下反應(yīng)15min，以不加酶液的底物溶液為對照，測定420nm光吸收值，確定其最適作用溫度。將β -半乳糖苷酶加入到0. 1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7. 0)中，分別在不同溫度 (80°C,85°C, 900C )下，溫育30 min后，立即加入含有底物的反應(yīng)溶液，反應(yīng)15min，測定殘
余酶活。結(jié)果附圖3 (A)顯示，重組β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為75°C。該酶在50°C — 90°C范圍內(nèi)均有良好的酶活力。55 — 80°C溫度范圍內(nèi)，酶活力均高于50%。在85°C有38% 的酶活力，而在50°C以下時(shí)相對酶活力較低。將重組β -半乳糖苷酶分別置于80°C、85°C和 90°C溫育30min，然后再測酶活力。結(jié)果如附圖3 (B)所示，重組β -葡萄糖苷酶在80°C、 85°C和90°C處理30min后，相比未處理的重組酶，仍分別具有57%、44%、27%的酶活力。由此說明，該重組β -半乳糖苷酶是一種優(yōu)良的高溫酶，反應(yīng)溫度范圍比較廣泛，具有非常優(yōu)良的耐熱性。(2)重組耐熱β -半乳糖苷酶作用的最適pH
以0. 25%的鄰硝基苯酚β -D半乳糖苷(ONPG)為底物，分別在0. 1 mol/L磷酸鹽一檸檬酸緩沖液(pH值4-6)、0. 1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7-8)和0. 1 mol/L甘氨酸一氫氧化鈉緩沖(PH值9- 11)的緩沖液中，于最適溫度下反應(yīng)30min，以不加酶液的底物溶液為對照，測定420nm光吸收值，確定其最適作用pH。結(jié)果如附圖4顯示，重組β-葡萄糖苷酶的最適pH值為7.0。在pH5. 0-9.0之間， 重組β-半乳糖苷酶有良好的酶活力。而當(dāng)PH小于5.0和大于9.0的情況下，相對酶活力比較低。說明該重組酶適合中性環(huán)境。(3)金屬離子對重組耐熱β -半乳糖苷酶的影響
6以0.25%的鄰硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)為底物，在0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7. 0)中，分別加入終濃度為ImM或IOmM的金屬離子，以不加金屬離子的底物溶液為對照， 75°C下反應(yīng)IOmin后，測定420nm光吸收值，來評價(jià)金屬離子對β-半乳糖苷酶的影響。(4)去污劑和抑制劑對重組耐熱β -半乳糖苷酶的影響
以0.25%的鄰硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)為底物，在0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7. 0)中，分別加入終濃度為ImM (0. 1%)或IOmM (1%)的去污劑，以不加去污劑或抑制劑的底物溶液為對照，75°C下反應(yīng)IOmin后測定420nm光吸收值，來評價(jià)去污劑和抑制劑對β _半乳糖苷酶的影響。結(jié)果如附圖5，6顯示，大部分金屬離子對該重組耐熱β -半乳糖苷酶的酶活有一定的促進(jìn)作用，基本能提高該酶酶活5-8倍，而且濃度為IOmM的金屬離子溶液比ImM的促進(jìn)作用更明顯。同時(shí)酶去污劑或抑制劑對該酶酶活的影響較少，甚至Triton X-100對其酶活有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。由此可得，該重組耐熱半乳糖苷酶對金屬離子、去污劑和抑制劑都有很強(qiáng)的耐受性。
權(quán)利要求
1.一種可表達(dá)耐熱β-半乳糖苷酶的重組菌，其分類命名為大腸埃希氏菌 {Escherichia coli. )BL21_LA1，已于2011年7月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No. 5097。
2.一種如權(quán)利要求1所述的可表達(dá)耐熱半乳糖苷酶的重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟用同樣的限制性內(nèi)切酶雙酶切表達(dá)載體PGEX-4T-2和β -半乳糖苷酶基因后，將β -半乳糖苷酶基因克隆到表達(dá)載體PGEX-4T-2中，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性重組工程菌菌落，提取質(zhì)粒，然后采用雙酶切和測序的方法鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可表達(dá)耐熱半乳糖苷酶的重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述半乳糖苷酶基因來自嗜熱厭氧菌群。
4.一種利用權(quán)利要求1所述的重組菌表達(dá)耐熱β -半乳糖苷酶的方法，其特征在于 以IPTG為誘導(dǎo)劑培養(yǎng)重組菌BL21-LA1產(chǎn)酶，每IOOml發(fā)酵液培養(yǎng)菌體生長至OD _達(dá)到 0.8后，加入IPTG，使其終濃度達(dá)為1 m mol/L，37°C振蕩培養(yǎng)4_6 h，誘導(dǎo)重組蛋白獲得表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可表達(dá)耐熱β-半乳糖苷酶的重組菌及構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域。該重組菌能表達(dá)生產(chǎn)熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶，其分類命名為為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli.)BL21-LA1，已于2011年7月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCCNo.5097。 本發(fā)明重組菌表達(dá)分泌的熱穩(wěn)定β-半乳糖苷酶存在多方面的優(yōu)勢1、其最適反應(yīng)溫度高達(dá)75℃，反應(yīng)范圍非常廣泛，在50-90℃均能發(fā)揮良好的酶活力；2、其適應(yīng)pH值的范圍較寬(pH5.0-9.0)；3、其對去污劑、抑制劑及金屬離子的耐受性強(qiáng)。
文檔編號C12R1/19GK102559571SQ201210015508
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者劉宗保, 劉斌, 趙超, 鄧云金, 黃一帆 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)