專利名稱：一種基于Figla基因的超表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于Figla基因的超表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的方法。
背景技術(shù)：
雌性生殖細(xì)胞的發(fā)生是指雌性配子的形成、發(fā)育和成熟，這包括原始生殖細(xì)胞 (primordial germ cell,PGC)的遷移、卵原細(xì)胞的增殖、卵泡的發(fā)生以及卵母細(xì)胞成熟。在卵巢中，原始卵泡是生殖系統(tǒng)最基本的單位，也是發(fā)育成優(yōu)勢(shì)卵泡的基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示， 眾多對(duì)卵泡和胚胎形成起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子都是從早期卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育開(kāi)始起作用的， 所以早期卵泡的調(diào)控十分重要。生殖系a因子(Figla)是第一個(gè)生殖細(xì)胞特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)早期卵泡發(fā)育中的關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)控，能直接影響原始卵泡的形成(Choi Y, Rajkovic A. Genetics of early mammalian folliculogenesis[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2006,63(5) :579-590 ；Soyal S Μ, Amleh A, Dean J.FIG α , a germ cell-specific transcription factor required for ovarian follicle formatiaon[J]. Development, 2000，127 :4645-4654.)。小鼠的Figla最早可以在13. 5d的雌性胚胎的生殖嵴中表達(dá)， 并且在卵泡和生殖細(xì)胞簇的發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，對(duì)于Zp基因的表達(dá)、透明帶的形成具有調(diào)節(jié)作用(Huntriss J，Gosden R，Hinkins M et al. Isolation，characterization and expression of the human Factor In the Germline alpha (FIGLA) gene in ovarian follicles and oocytes[J]. Molecular Human Reproduction，2002，8(12) :1087-1095·)。對(duì)于雌性胚胎，缺乏Figla不會(huì)影響生殖細(xì)胞的迀移和增殖，生殖嵴也會(huì)正常形成出現(xiàn)，但是出生后卵母細(xì)胞會(huì)迅速退化消失，不能形成原始卵泡。而且敲除Figla基因會(huì)導(dǎo)致雌鼠不孕(Liang L, Soyal SM,Dean J. FIG α , a germ cell specific transcription factor involved in the coordinate expression of the zona pellucida genes[J]. Development,1997，124 :4939-4949.)。人類的Figla缺失或突變可能會(huì)引起不同程度的卵巢發(fā)育或卵母細(xì)胞成熟障礙， 促使卵巢早衰(POF)、不孕的發(fā)生(Suzumori N, Pangas SA, Rajkovic A et al. Candidate genes for premature ovarian failure[J]. Current medicinal chemistry,2007,14(3) 353-357 ；Van Dooren MF,Bertoli-Avella AM,Oldenburg RA. Premature ovarian failure and gene polymorphisms[J]. Current opinion in obstetrics & gynecology,2009, 21(4) :313-317.)。干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。已有研究證實(shí)干細(xì)胞可以在體外分化為早期生殖細(xì)胞，甚至進(jìn)一步分化為卵母細(xì)胞或精子(HUbner K, Fuhrmann G, Christenson LK et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells[J], Science,2003,300 :1251-1256 ；Geijsen N, Horoschak Μ, Kim K etal. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells [J], Nature, 2004,427 :148-154. 有研究發(fā)現(xiàn)超表達(dá)Dazl或其家族基因可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化( Z，Ji P，Cao J et al. Dazl promotes germ cell differentiation from embryonic stem cells[J]. J Mol Cell Biol, 2009,1 :93-103.Kee K,Angeles VT,Flores M et al. Human DAZL,DAZ and BOULE genes modulate primordial germ-cell and haploid gamete formation [J] · Nature, 2009，462 :222-225.)。借助外源性轉(zhuǎn)錄因子和基因可以使終末分化的體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)型的多能性干細(xì)胞(Takahashi K，Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell,2006,126 (4) :663-676.)。 而且最近的報(bào)道顯示，借助特異的外源性轉(zhuǎn)錄因子可使終末分化的體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等(Uhlenhaut N H, Jakob S, Anlag K et al. Somatic sex reprogramming of adult ovaries to testes by F0XL2ablation[J]. Cell,2009, 139(6) :1130-1142. Sekiya S, Suzuki A. Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors[J]. Nature,2011,475(7356) :390-393. Pang Z P, Yang N, Vierbuchen T et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors[J]. Nature,2011,476(7359) :220-223. Efe J A, Hilcove S, Kim J et al. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy[J]. Nat Cell Biol,2011,13(3) :215-222)。然而，已有的報(bào)道誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化尤其卵母細(xì)胞分化的數(shù)量有限，誘導(dǎo)效率和重復(fù)性較差，誘導(dǎo)過(guò)程長(zhǎng)，效果不穩(wěn)定，因此很難在體內(nèi)、體外深入探討相關(guān)細(xì)胞因子、微環(huán)境和一些關(guān)鍵基因在干細(xì)胞向生殖細(xì)胞發(fā)育分化過(guò)程中的作用和機(jī)理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種基于Figla基因的超表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的方法，通過(guò)表達(dá)外源Figla基因促進(jìn)干細(xì)胞或體細(xì)胞體外向雌性生殖細(xì)胞分化，可提高干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的效率。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種Figla基因序列，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示?；贔igla基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，包括SEQ. ID. NO. 1所示的Figla基因，在 Figla基因的下游連接熒光報(bào)告基因。所述的基于Figla基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，還在熒光標(biāo)記基因的下游連接抗生素篩選基因。所述的熒光標(biāo)記基因?yàn)镈sRed，抗生素篩選基因?yàn)閚eor。所述的基于Figla基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體為pDsRedl-Nl-Figla表達(dá)載體，通過(guò) Ecor I和Bgl II酶切位點(diǎn)將Figla基因克隆到pDsRedl-Nl表達(dá)載體中。Figla基因被標(biāo)記后轉(zhuǎn)染多能性干細(xì)胞以促進(jìn)多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化或轉(zhuǎn)分化的應(yīng)用。一種通過(guò)表達(dá)外源Figla基因促進(jìn)細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟
1)克隆如SEQ. ID. NO. 1所示的Figla基因序列，并將Figla基因序列通過(guò)Ecor I 和Bgl II酶切位點(diǎn)克隆到pDsRedl-Nl表達(dá)載體，得到pDsRedl-Nl-Figla表達(dá)載體；2)將pDsRedl-Nl-Figla表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到多能干細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染后用以下誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)液為=H-DMEM培養(yǎng)基+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1 %體積濃度的非必需氨基酸+15%體積濃度的FBS ；3)誘導(dǎo)后，通過(guò)免疫熒光染色和RT-PCR進(jìn)行生殖特異性基因表達(dá)的檢測(cè)；篩選已分化的雌性生殖細(xì)胞。所述的細(xì)胞包括P19和傳代培養(yǎng)的多能性干細(xì)胞；多能性干細(xì)胞的傳代為將多能性干細(xì)胞接種到以10 μ g/mL絲裂霉素C處理池的 2 5代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C,5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待克隆增殖到65 70%融合時(shí)傳代；培養(yǎng)液為H-DMEM培養(yǎng)液+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1 %體積濃度的非必需氨基酸+lOng/mL白血病抑制因子+15%體積濃度的胎牛血清。所述的多能性干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞或成年組織來(lái)源的具有胚胎干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1.本發(fā)明克隆了 Figla基因并構(gòu)建了 pDsRedl-Nl-Figla載體。通過(guò)提取小鼠卵巢組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。發(fā)現(xiàn)克隆的基因在558bp處發(fā)生突變，該突變未造成氨基酸的改變。通過(guò)SWISS-PR0T蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)分析，其二級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。2.本發(fā)明用pDsRedl-Nl-Figla重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在熒光顯微鏡下，P19和mESCs 中均觀察到紅色熒光蛋白(RFP)的表達(dá)；轉(zhuǎn)染后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)RFP的細(xì)胞數(shù)增多。 pDsRedl-Nl-Figla轉(zhuǎn)染P19后，細(xì)胞增大、變圓，脫離培養(yǎng)皿底部，部分出現(xiàn)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)特性，而轉(zhuǎn)染PDsRedl-Nl的細(xì)胞仍為多角形。pDsRedl-Nl-Figla轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)后，RFP表達(dá)于細(xì)胞克隆邊緣的分化細(xì)胞，而在克隆邊緣光滑處未見(jiàn)表達(dá)；轉(zhuǎn)染mESCs在傳代后成片狀生長(zhǎng)，大部分不再形成克隆。說(shuō)明Figla基因促進(jìn)了 mESCs的分化。3.本發(fā)明對(duì)轉(zhuǎn)染pDsRedl-Nl-Figla后48h的mESCs細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，顯示表達(dá)RFP的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)多能性基因0ct4，生殖特異性基因Vasa，減數(shù)分裂特異性基因 Scp3和Mra8，以及雌性生殖細(xì)胞特異性基因Figla和Zp3 ；在Stra8陽(yáng)性細(xì)胞中可見(jiàn)到分裂相的細(xì)胞。RT-RCR分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pDsRedl-Nl-Figla 2d后，mESCs內(nèi)的Figla總表達(dá)量明顯增加，且內(nèi)源性表達(dá)量亦有所提高，即轉(zhuǎn)入的外源性Figla基因可以促進(jìn)內(nèi)源性Figla 的啟動(dòng)和表達(dá)。轉(zhuǎn)染后，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，外源性Figla基因的表達(dá)下調(diào)。轉(zhuǎn)染5d后，細(xì)胞中 Vasa和維甲酸受體(RAR)的表達(dá)增強(qiáng)，而0ct4和Mra8的表達(dá)減弱。對(duì)Figla的靶基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pDsRedl-Nl-Figla可以促進(jìn)Zpl、Zp3和Gdf9的表達(dá)。QRT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染3d的mESCs中，VaSa、kp3和Zpl的表達(dá)較對(duì)照組均有明顯上調(diào)，而0ct4 和StraS的表達(dá)量下降。表明其開(kāi)始向雌性生殖細(xì)胞分化。


圖1是PCR擴(kuò)增的Figla基因的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2是Ecor I和Bgl II雙酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pDsRedl-Nl-Figla ；圖3是熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒pDsRedl-Nl-Figla在P19細(xì)胞的表達(dá)；圖4是熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒pDsRedl-Nl-Figla在mESCs的表達(dá)；圖5是免疫熒光染色顯示轉(zhuǎn)染pDsRedl-Nl-Figla的mESCs體外分化后生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記基因的表達(dá)結(jié)果；圖6是轉(zhuǎn)染pDsRedl-Nl和pDsRedl-Nl-Figla 2d和5d的mESCs體外分化后生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記基因PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果圖；圖 7 是定量 PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染 pDsRedl-Nl 和 pDsRedl-Nl-Figla 3d 的 mESCs 體外分化后生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記基因的表達(dá)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。1、Figla基因的克隆及載體構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠Figla的基因序列(NCBI :NM_012013. 1)，利用Primer Premier 5. 0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增Figla基因的上、下游引物并突變Figla基因的終止密碼子，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，具體設(shè)計(jì)以下引物上游引物5 ‘ TCAGATCTTGGTCTTGACCACCATGGATA 3 ‘下游引物5‘ CTGAATTCCATCAGACTCCTCATGAGTGAAGTA 3 ‘上游引物中劃線部分為Bgl II酶切位點(diǎn)，下游引物中下劃線部分為EcorI酶切位占.
^ \\\ Figla基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15 μ L，其中包括10Xbuffer 1. 5μ L, MgC12(25mmol/L) 1. 6μ L, dNTP (2. 5mmol/L) 1. 2 μ L，Taq DNA 聚合酶 0. 1 μ L，上、下游引物 (10 μ mol/L)各 0· 3 μ L，cDNA 模板 0. 5 μ L, ddH20 9· 5 μ L。反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C補(bǔ)延伸10min，4°C保存?；厥詹⒓兓疨CR產(chǎn)物，得到Figla基因片段(電泳結(jié)果如圖1所示，可以看到得到了目的片段)，然后將PCR產(chǎn)物、pDsRedl-m真核表達(dá)載體分別用Ecor I和Bgl II雙酶切后連接，將其克隆入pDsRedl-Nl真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pDsRedl-Nl-Figla。將重組載體pDsRedl-Nl-Figla進(jìn)行Ecor I和Bgl II雙酶切鑒定，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在609bp和4700bp處出現(xiàn)特異性條帶。pDsRedl-Nl-Figla載體的Ecor I 和Bgl II雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，可以看到克隆到的Figla基因目標(biāo)片段和剩余的 pDsRedl-Nl載體骨架。測(cè)序后得到Figla基因序列，核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示?；蛟?58bp處發(fā)生突變，該突變未造成氨基酸的改變。2、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的觀察
6
所轉(zhuǎn)染的所述細(xì)胞包括P19和傳代培養(yǎng)的多能性干細(xì)胞；多能性干細(xì)胞的傳代為將多能性干細(xì)胞接種到以10 μ g/mL絲裂霉素C處理池的 2 5代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C,5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待克隆增殖到65 70%融合時(shí)傳代；培養(yǎng)液為H-DMEM培養(yǎng)液+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1 %體積濃度的非必需氨基酸+lOng/mL白血病抑制因子+15%體積濃度的胎牛血清。所述的多能性干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞或成年組織來(lái)源的具有胚胎干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前，分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P19和mESCs用0. 05%胰蛋白酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，并用差速貼壁法去除mESCs中的MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞，分別接種到鋪有明膠的M 孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)細(xì)胞至約70%融合時(shí)，按照!^rmentas公司的TurboFect 轉(zhuǎn)染說(shuō)明書分別對(duì)P19和mESCs進(jìn)行pDsRedl-Nl_Figla重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。具體為將2 μ g重組質(zhì)粒加入300 μ 1 opti-MEM培養(yǎng)液中，再加入4 μ 1 TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，溫和混勻。室溫孵育20min后，將TurboFect/DNA混合物均勻加入培養(yǎng)皿內(nèi)。轉(zhuǎn)染后 3 4h，更換為H-DMEM+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1 %非必需氨基酸 +15%體積濃度的胎牛血清培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)2 14d。轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)RFP的細(xì)胞數(shù)增多。pDsRedl-Nl-Figla轉(zhuǎn)染P19 后，P19細(xì)胞增大、變圓，脫離培養(yǎng)皿底部，部分出現(xiàn)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)特性，而作為對(duì)照的轉(zhuǎn)染 PDsRedl-Nl的細(xì)胞仍為多角形(結(jié)果如圖3所示)。pDsRedl-Nl-Figla轉(zhuǎn)染mESCs后，RFP表達(dá)于細(xì)胞克隆邊緣的分化細(xì)胞，而在克隆邊緣光滑處未見(jiàn)表達(dá)；轉(zhuǎn)染mESCs在傳代后成片狀生長(zhǎng)，大部分不再形成克隆(圖4)。說(shuō)明Figla基因促進(jìn)了 mESCs的分化。3、轉(zhuǎn)染pDsRedl-Nl-Figla的mESCs生殖特異性基因表達(dá)的檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)染pDsRedl-Nl-Figla后2d的mESCs進(jìn)行免疫熒光染色，顯示表達(dá)RFP的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)多能性基因0ct4，生殖特異性基因Vasa，減數(shù)分裂特異性基因和Mra8，以及雌性生殖細(xì)胞特異性基因Figla和Zp3(檢測(cè)結(jié)果如圖5所示)。在StraS陽(yáng)性細(xì)胞中可見(jiàn)到分裂相的細(xì)胞。RT-RCR分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pDsRedl-Nl-Figla 2d后，mESCs內(nèi)的Figla總表達(dá)量明顯增加，且內(nèi)源性表達(dá)量亦有所提高，即轉(zhuǎn)入的外源性Figla基因可以促進(jìn)內(nèi)源性Figla 的啟動(dòng)和表達(dá)。轉(zhuǎn)染后，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，外源性Figla基因的表達(dá)下調(diào)。轉(zhuǎn)染5d后，細(xì)胞中Vasa和RAR的表達(dá)增強(qiáng)，而0ct4和Stra8的表達(dá)減弱。對(duì)Figla的靶基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pDsRedl-Nl-Figla可以促進(jìn)雌性生殖細(xì)胞標(biāo)記基因如Zpl、Zp3和Gdf9的表達(dá) (圖 6)。QRT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染外源Figla后3d的mESCs中，Vasajcp3和Zpl 的表達(dá)較對(duì)照組(對(duì)照組為轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞)均有明顯上調(diào)；而0ct4和StraS表達(dá)量較對(duì)照組下調(diào)(圖7)。這表明外源Figla的超標(biāo)達(dá)促進(jìn)雌性生殖特異基因VaSa、kp3和Zpl的表達(dá)，而多能性基因0ct4和雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前關(guān)鍵基因基因StraS的表達(dá)均下調(diào)， 證明Figla的超標(biāo)達(dá)促進(jìn)細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化。
權(quán)利要求
1.一種Figla基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
2.基于Figla基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，包括SEQ.ID. NO. 1所示的Figla 基因，在Figla基因的下游連接熒光報(bào)告基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基于Figla基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，還在熒光標(biāo)記基因的下游連接抗生素篩選基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基于Figla基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，所述的熒光標(biāo)記基因?yàn)镈sRed，抗生素篩選基因?yàn)閚eor。
5.如權(quán)利要求2所述的基于Figla基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，所述的基于 Figla基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體為pDsRedl-Nl-Figla表達(dá)載體，通過(guò)Ecor I和Bgl II酶切位點(diǎn)將Figla基因克隆到pDsRedl-Nl表達(dá)載體中。
6.Figla基因被標(biāo)記后轉(zhuǎn)染多能性干細(xì)胞以促進(jìn)多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化或轉(zhuǎn)分化的應(yīng)用。
7.一種通過(guò)表達(dá)外源Figla基因促進(jìn)細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于， 包括以下步驟1)克隆如SEQ.ID. NO. 1所示的Figla基因序列，并將Figla基因序列通過(guò)Ecor I和 Bgl II酶切位點(diǎn)克隆到pDsRedl-Nl表達(dá)載體，得到pDsRedl-Nl-Figla表達(dá)載體；2)將pDsRedl-Nl-Figla表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染后用以下誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)液為=H-DMEM培養(yǎng)基+0. 1讓01/1^-巰基乙醇+2讓01/1 L-谷氨酰胺+1 %體積濃度的非必需氨基酸+15%體積濃度的FBS ；3)誘導(dǎo)后，通過(guò)免疫熒光染色和RT-PCR進(jìn)行生殖特異性基因表達(dá)的檢測(cè)；篩選已分化的雌性生殖細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的通過(guò)表達(dá)外源Figla基因促進(jìn)細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞包括P19和傳代培養(yǎng)的多能性干細(xì)胞；多能性干細(xì)胞的傳代為將多能性干細(xì)胞接種到以10 μ g/mL絲裂霉素C處理池的2 5代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)， 待克隆增殖到65 70%融合時(shí)傳代；培養(yǎng)液為H-DMEM培養(yǎng)液+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1 %體積濃度的非必需氨基酸+lOng/mL白血病抑制因子+15%體積濃度的胎牛血清。
9.如權(quán)利要求8所述的通過(guò)表達(dá)外源Figla基因促進(jìn)細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述的多能性干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞或成年組織來(lái)源的具有胚胎干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于Figla基因的超標(biāo)達(dá)促細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的方法，F(xiàn)igla基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。Figla基因被標(biāo)記后轉(zhuǎn)染多能性干細(xì)胞以促進(jìn)多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化或轉(zhuǎn)分化的應(yīng)用。pDsRed1-N1-Figla轉(zhuǎn)染mESCs后，RFP表達(dá)于細(xì)胞克隆邊緣的分化細(xì)胞，而在克隆邊緣光滑處未見(jiàn)表達(dá)；轉(zhuǎn)染mESCs在傳代后成片狀生長(zhǎng)，大部分不再形成克隆。說(shuō)明Figla基因促進(jìn)了mESCs的分化。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102533778SQ201210015998
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者華進(jìn)聯(lián), 胡玥 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)