專利名稱：一種快速提取質(zhì)粒dna的試劑盒及其提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及的是一種快速提取質(zhì)粒DNA的試劑盒及其提取方法。
背景技術：
細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從11Λ至2001Λ以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。
質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取。
堿裂解法是一種應用最為廣泛的現(xiàn)有制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA 是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在PH值高達12. 6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以PH4. 8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其PH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體 DNA不能復性而形成纏連的網(wǎng)狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
堿裂解法存在以下不足
①耗時較長由于使用此方法提取質(zhì)粒DNA需要提前人工配制數(shù)種新鮮溶液，導致實驗過程延長
②成功率較低現(xiàn)有技術由于溶液配比的不適宜，容易導致DNA提取的失敗
③提取到的DNA純度較低普通印pendorf管對DNA沒有特別的吸附作用，會導致 DNA的流失和提取純度降低。若要再次純化DNA，需要用到有毒的苯酚等化學藥劑發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足提供一種快速提取質(zhì)粒DNA 的試劑盒及其提取方法。
本發(fā)明的技術方案如下
一種快速提取質(zhì)粒DNA的試劑盒，該試劑盒由溶液I-VI組成
溶液I :50mM Tris-HCI 禾Π IOmM EDTA, pH = 8. 0 (25 °C )，50 微克 / 毫升 RNaseA ；
溶液II 0. 2M NaOH 禾口 1% SDS ；
溶液III :4M鹽酸胍和0. 5M醋酸鉀，pH = 4. 2 ；
溶液IV :5M鹽酸胍，20mM Tris-HCI, pH6. 6(25°C )，使用前加入乙醇，乙醇濃度為 38% ；
溶液V:20mM NaCL, 2mM Tris-HCI, pH 7. 5 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇濃度為80% ；
溶液VI =IOmM Tris-HCI, pH 8. 5 (25°C )。
應用權利要求1所述試劑盒的質(zhì)粒DNA提取方法，包括以下步驟A1、用1. 5ml離心管收集l-5ml菌液。12，OOOrpm離心Imin,棄上清；
A2、加入250 μ 1溶液I，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸?。皇覝仂o置Hmin ；
A3、加入250 μ 1溶液II，輕柔地反復顛倒混勻5_6次；室溫靜置l-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液；
A4、加入350 μ 1溶液III，立即輕柔地反復顛倒混勻5_6次；
Α5、12，OOOrpm 室溫離心 lOmin，收集上清；
A6、將上清置于DNA純化柱中，靜置Hmin ；
A7、12，OOOrpm 離心 lmin，棄濾液；
A8、加入 500 μ 1 溶液 IV，12，OOOrpm 離心 lmin,棄濾液；
A9、加入 500 μ 1 溶液 V, 12，OOOrpm 離心 lmin,棄濾液；
A10、加入 500 μ 1 溶液 V, 12，OOOrpm 離心 lmin,棄濾液；
All、12，OOOrpm離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體；
A12、將DNA純化柱置于新的離心管中，向純化柱中央處懸空滴加50-100 μ 1溶液 VI，室溫放置anin ；12，OOOrpm離心lmin，管底即為高純度質(zhì)粒DNA。
用此試劑盒及方法提取出來的DNA純度較高O擬60/280在1. 7-1. 9之間，而用一般方法提取出來的DNA —般在1. 6-2. O之間。
具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
實施例1試劑盒由溶液I-VI組成
溶液I :50mM Tris-HCI 禾Π IOmM EDTA, pH = 8. O (25 °C )，50 微克 / 毫升 RNaseA ；
溶液II :0. 2M NaOH 和 1 % SDS ；
溶液III :4M鹽酸胍和0. 5M醋酸鉀，pH = 4. 2 ；
溶液IV :5M鹽酸胍，20mM Tris-HCI, pH6. 6 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇濃度體積百分比為38% (ν/ν) 0
溶液V :20mM NaCL, 2mM Tris-HCI,pH 7. 5 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇濃度體積百分比為80% (ν/ν) 0
溶液VI =IOmM Tris-HCI, pH 8. 5(25°C )；
實施例2應用實施例1中試劑盒的提取方法
Al、用1. 5ml離心管收集l_5ml菌液。12，OOOrpm離心lmin，棄上清。
應根據(jù)所培養(yǎng)菌體的濃度與質(zhì)粒的拷貝數(shù)，確定收集的菌液量。菌量過大可能導致溶菌不充分，純化時會影響質(zhì)粒純度。菌體的體積與質(zhì)?？截悢?shù)參見注意事項。
A2、加入250μ 1溶液I，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮。室溫靜置 l-2min(為使溶液中的RNA被充分降解)。不能有殘留細小菌塊。菌體懸浮充分與否將決定質(zhì)粒DNA得率的高低；
A3、加入250 μ 1溶液II，輕柔地反復顛倒混勻5_6次。室溫靜置l-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。若溶液II出現(xiàn)沉淀，請于37°C保溫溶解。待恢復至室溫后使用。沉淀的出現(xiàn)不會影響質(zhì)粒DNA的純化結果。不可劇烈混和，否則會使染色體 DNA斷裂。此步驟不宜超過5min。
A4、加入350 μ 1溶液III，立即輕柔地反復顛倒混勻5_6次。此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
A5、12，OOOrpm 室溫離心 lOmin，收集上清。
A6、將上清置于DNA純化柱中，靜置Umiru
如果收集的上清液過多，超過DNA純化柱容積(800 μ 1)，可將上清分次加入DNA純化柱中。
Α7、12，OOOrpm 離心 lmin，棄濾液。
此時質(zhì)粒DNA被吸附于DNA純化柱的硅膠膜上。
A8、加入 500 μ 1 溶液 IV, 12，OOOrpm 離心 lmin,棄濾液。
此步驟的作用是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量質(zhì)粒DNA。
A9、加入 500 μ 1 溶液 V，12，OOOrpm 離心 lmin,棄濾液。
A10、加入 500 μ 1 溶液 V, 12，OOOrpm 離心 lmin,棄濾液。
All、12，OOOrpm離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。
A12、將DNA純化柱置于新的離心管中。向純化柱中央處懸空滴加50-100 μ 1溶液 VI，室溫放置anin。12，OOOrpm離心lmin，管底即為高純度質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA于_20°C保存。
純度高本方法中，硅膠膜可以和DNA的特異性結合，再經(jīng)過溶液IV和溶液V對蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)的洗脫，可以使被提取的DNA最大限度地純化。
成功率高標準化的最優(yōu)溶液配比可以最大限度地減少實驗人員因不適宜地配制提取、洗脫溶液而引起的提取失敗。
所需時間短采用本方法提取DNA，減少了配制溶液的時間、減少了對提取后的 DNA進行純化的時間，從而大大縮短了 DNA提取的時間。
提取效率高由于采用硅膠管、適宜的溶液配比，使單位底物所能提取到的DNA量大大增加。
經(jīng)過試驗表明用此方法提取出來的DNA純度較高，其O擬60/280在1. 7-1. 9之間，而用一般方法提取出來的DNA 0D260/280 一般在1. 6-2. O之間。
備注一般用0D260/280來檢測DNA的純度。0D260/280在1. 7-1. 9之間表明比較純。
應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種快速提取質(zhì)粒DNA的試劑盒，其特征在于，試劑盒由溶液I-VI組成 溶液 I :50mM Tris-HCI 禾Π IOmM EDTA, pH = 8. 0 (25 °C )，50 微克 / 毫升 RNaseA ； 溶液 II :0. 2M NaOH 和 SDS ；溶液III :4M鹽酸胍和0. 5M醋酸鉀，pH = 4. 2 ；溶液IV :5M鹽酸胍，20mM Tris-HCI，pH6. 6 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇濃度為38% ； 溶液V:20mM NaCL, 2mM Tris-HCI,pH 7. 5 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇濃度為80% ； 溶液 VI: IOmM Tris-HCI, pH 8.5(25°C)。
2.應用權利要求1所述試劑盒的質(zhì)粒DNA提取方法，其特征在于包括以下步驟:A1、 用1. 5ml離心管收集l-5ml菌液。12，OOOrpm離心Imin,棄上清；A2、加入250 μ 1溶液I，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸?。皇覝仂o置Ι-aiiin ； A3、加入250 μ 1溶液II，輕柔地反復顛倒混勻5-6次；室溫靜置l-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液；A4、加入350 μ 1溶液III，立即輕柔地反復顛倒混勻5-6次；Α5、12，OOOrpm室溫離心lOmin，收集上清；A6、將上清置于DNA純化柱中，靜置Ι-aiiin ；A7、12，OOOrpm 離心 Imin,棄濾液；A8、加入500 μ 1溶液IV，12，OOOrpm離心Imin,棄濾液；Α9、加入500 μ 1溶液V，12，OOOrpm離心Imin,棄濾液；Α10、加入500 μ 1溶液V，12，OOOrpm離心Imin,棄濾液；All、12，OOOrpm離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體；A12、將DNA純化柱置于新的離心管中，向純化柱中央處懸空滴加50-100 μ 1溶液VI，室溫放置anin ； 12，OOOrpm離心lmin，管底即為高純度質(zhì)粒DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速提取質(zhì)粒DNA的試劑盒，試劑盒由溶液I-VI組成溶液I50mM Tris-HCI和10mM EDTA，pH＝8.0(25℃)，50微克/毫升RNaseA；溶液II0.2MNaOH和1％SDS；溶液III4M鹽酸胍和0.5M醋酸鉀，pH＝4.2；溶液IV5M鹽酸胍，20mM Tris-HCI，pH6.6(25℃)，使用前加入乙醇，乙醇濃度為38％；溶液V20mM NaCL，2mM Tris-HCI，pH 7.5(25℃)，使用前加入乙醇，乙醇濃度為80％；溶液VI10mMTris-HCI，pH 8.5(25℃)。還公開了應用所述試劑盒的質(zhì)粒DNA提取方法；用此試劑盒及方法提取出來的DNA純度較高OD260/280在1.7-1.9之間，而用一般方法提取出來的DNA一般在1.6-2.0之間。
文檔編號C12N15/10GK102533732SQ20121001653
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權日2012年1月19日
發(fā)明者季陽, 張新全, 楊盛婷, 梁小玉, 江雙呂, 許暢, 黃琳凱 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學