專利名稱：一種將抗根結線蟲的rna干擾基因?qū)朦S瓜的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及黃瓜轉(zhuǎn)基因技術，特別是一種獲得表達干擾線蟲MiMpkl基因的RNA干擾片段的黃瓜轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術：
近些年隨著保護地栽培大面積推廣，加之重茬嚴重，根結線蟲對黃瓜生產(chǎn)的危害日趨嚴峻。而現(xiàn)有資源中缺乏抗南方根結線蟲的種質(zhì)資源，目前利用傳統(tǒng)育種手段尚無法解決此問題，因此需通過轉(zhuǎn)基因技術引入新的抗原，拓寬栽培黃瓜的遺傳基礎。在專利號為ZL200810118726.X，名稱為“一種RNA干擾載體及其應用”的專利中公開了以南方根結線蟲的MiMpkl基因為靶標構建的MiMpkl RNA干擾載體，并將該載體轉(zhuǎn)入蕃茄中，使蕃茄獲得了較好的對線蟲的抗性,體外飼喂實驗也證明該RNA干擾載體能夠有效干預線蟲體內(nèi)的一個信號轉(zhuǎn)導酶MARK蛋白的合成，阻礙線蟲的生長和發(fā)育，從而達到防治線蟲的目的?？梢灶A知，將載有該基因的RNA干擾載體轉(zhuǎn)入黃瓜中獲得抗線蟲的轉(zhuǎn)基因黃瓜品系，將是一種緩解目前黃瓜受線蟲危害的有效方法，但是為順利實現(xiàn)此目的，須借助高效的轉(zhuǎn)基因體系。雖然在蕃茄，大豆等作物上，都有轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化率高的報道，同時未有報道將干擾載體轉(zhuǎn)化于黃瓜中，通過沉默線蟲自身基因達到防治線蟲的目的。黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化研究始于1986年，但在黃瓜抗線蟲的遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究仍然很少，于玉梅(2008)從被根結線蟲侵染的黃瓜根系cDNA中擴增出根結線蟲的保守基因16D10，構建植物表達載體，通過花粉管通道法將16D10轉(zhuǎn)入黃瓜，得到的抗性苗經(jīng)PCR檢測，I株擴增出特異條帶。朱妍妍(2008)采用相同的方法擴增得到基因16D10，構建了抗根結線蟲的RNAi植物表達載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導法和花粉管通道法轉(zhuǎn)化黃瓜，但最終未得到轉(zhuǎn)基因植株。魏愛民等(2006)用農(nóng)桿菌介導法將抗蟲基因eqkam導入黃瓜，僅對抗蟲基因轉(zhuǎn)化黃瓜的影響因素進行了研究說明，未說明是否獲得再生植株，后其又采用花粉管通道法將抗蟲基因eqkam轉(zhuǎn)化黃瓜，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，獲得了再生植株，但轉(zhuǎn)化率僅為0. 14%。在植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中，常通過使用乙酰丁香酮(AS)來輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，因為AS是一種酚類物質(zhì)，可誘導農(nóng)桿菌內(nèi)Ti或Ri質(zhì)粒DNA上的Vir區(qū)基因的活化和表達，促進農(nóng)桿菌T-DNA向宿主細胞核轉(zhuǎn)移，從而提高轉(zhuǎn)化效率。AS尤其對單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化非常必要，而雙子葉植物由于在外植體受傷后會自行合成酚類物質(zhì)，因此不必外加酚類物質(zhì)就可以使Vir區(qū)基因活化，但實驗證明加入適量AS依然可以提高轉(zhuǎn)化率。AS被廣泛應用于目前的植物轉(zhuǎn)基因技術中，在黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化中利用AS輔助轉(zhuǎn)化的報道也較多，將IOOmg/LAS添加到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，再生頻率高達83. 3 %，但對轉(zhuǎn)化效率的影響并不大，有待進一步改進。因此隨著對雙子葉植物轉(zhuǎn)基因研究的深入和技術的改進，迫切需要開發(fā)輔助轉(zhuǎn)化效果更明顯、對外植體傷害更小的試劑。以往的研究曾發(fā)現(xiàn)抗氧化劑對促進植物外植體分化、緩解褐化有較好的作用，近些年硫辛酸(lipoic acid，下文簡寫為LA)作為一種超強型抗氧化劑被運用到植物組織培養(yǎng)研究中，并獲得了較好的試驗效果。而目前LA也被應用到大豆和番茄的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，結果顯示轉(zhuǎn)化效率分別從0. 6%和29. 8%顯著增加到
3.7%和87%，并可顯著降低大豆和番茄的假陽性率；小麥的轉(zhuǎn)化率從2. 8%提高到5. 7% ;在棉花上，可以使草甘膦抗性芽率由41. 4%增長到61. 2%。而目前在黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化中利用AS輔助轉(zhuǎn)化的報道較多，將100mg/L AS添加到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，再生頻率高達83. 3%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領域的需求和空白，提供一種改進的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，使黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化率顯著提高，高效地獲得了能夠表達干擾線蟲MiMpkl基因的轉(zhuǎn)基因黃瓜，該遺傳轉(zhuǎn)化體系能減少在遺傳轉(zhuǎn)化篩選過程中所耗費的時間和人力成本，提高遺傳轉(zhuǎn)化的工作效率。同時，通過黃瓜表達MiMpkl基因，可有效的沉默根結線蟲的MiMpkl基因，影響其正常發(fā)育，減少對黃瓜的危害。本發(fā)明的方案如下 一種將抗根結線蟲的RNA干擾基因?qū)朦S瓜的方法，包括以下步驟(I)預培養(yǎng)黃瓜外植體子葉或子葉節(jié)；(2)準備用于浸染的含有外源基因載體的農(nóng)桿菌液；(3)將所述外植體置于所述農(nóng)桿菌懸液中浸染15 20mins ；(4)浸染后的外植體接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25°C黑暗條件下培養(yǎng)2 3d ; (5)共培養(yǎng)后的外植體置于初步選擇培養(yǎng)基中初步篩選2 3周，篩選抗生素為潮霉素；(6)初步篩選出的外植體轉(zhuǎn)入到再次選擇培養(yǎng)基中再次篩選I周，篩選抗生素為
潮霉素；(7)再次篩選出的保持綠色的外植體接種到添加0. 5mg/L GA的BPM培養(yǎng)基中伸長
培養(yǎng)；(8)生根培養(yǎng)獲得再生植株；其特征在于所述含有外源基因載體為pCAGC1341_dsMiMpkl，⑵中的農(nóng)桿菌懸液中和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有硫辛酸50 100mg/L，乙酰丁香酮50mg/L。所述外植體為子葉，所共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2. Omg/L BA+1. 0mg/L ABA+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。所述外植體為子葉節(jié)，所共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+0. 5mg/L BA+2. 0mg/L AgN03+50 lOOmg/L LA+50mg/l AS pH = 5. 4。所述外植體為子葉，(5)和(6)中用于篩選的潮霉素的濃度分別為10mg/L，25mg/L0所述外植體為子葉節(jié)，(5)和(6)中用于篩選的潮霉素的濃度分別為7mg/L，15mg/L0所述外植體為子葉，所述初步選擇培養(yǎng)基為MS+2. Omg/L BA+1. Omg/L ABA+10mg/L Hyg+400mg/L cef,pH= 5. 4,再次選擇培養(yǎng)基為MS+25mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4。
所述外植體為子葉節(jié)，所述初步選擇培養(yǎng)基為MS+0. 5mg/L BA+2. Omg/LAgN03+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4,再次選擇培養(yǎng)基為MS+15mg/L Hyg+400mg/lcef pH = 5. 4。所述(I)中，所述預培養(yǎng)指外植體為子葉，經(jīng)消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養(yǎng)基中生長I 2天后，切除胚根，子葉部分十字對切成4塊，獲得子葉外植體；或所述外植體為子葉節(jié)，經(jīng)消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)4 5天，當子葉呈直立狀態(tài)時切取，去除1/2子葉僅留2mm的下胚軸，并在預培養(yǎng)基PM上培養(yǎng)2天得到子葉節(jié)外植體。本發(fā)明為了獲得抗線蟲轉(zhuǎn)基因黃瓜，以專利號為ZL200810118726.X，名稱為“一種RNA干擾載體及其應用”中公開的RNA干擾載體pCAGC1341-dsMiMpkl為外源基因載體轉(zhuǎn)化黃瓜，希望獲得抗線蟲的轉(zhuǎn)基因黃瓜品種。鑒于目前報道的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化方法不夠高效難以獲得轉(zhuǎn)基因再生植株的現(xiàn)狀，發(fā)明人對于現(xiàn)有的黃瓜轉(zhuǎn)基因方法進行了改進。在外源基因載體轉(zhuǎn)化到外植體的階段，本發(fā)明在浸染菌液與共培養(yǎng)培養(yǎng)基中都加硫辛酸(LA)和乙酰丁香酮(AS),顯著提高了獲得轉(zhuǎn)化效率,轉(zhuǎn)化效率(％ ) = PCR或southern blot檢測為的陽性植株數(shù)/再生植株總數(shù)X 100%。本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)表明，在適當濃度的如50 100mg/L LA搭配適當濃度的如50mg/L AS的情況下，二者共同作用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時，抗性芽率相比對照或者單獨使用LA或AS時都有顯著提高，且Southern-blot檢驗下的轉(zhuǎn)化效率也有所增長，證明LA與AS協(xié)同作用更有利于黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化，其中LA可緩解自由基對細胞的傷害、減緩組織的氧化過程，而AS促進Vir區(qū)基因的活化，兩者共同作用下使轉(zhuǎn)化率得以提高。但是，本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)同時也表明，LA與AS之間的合作協(xié)調(diào)作用僅限于非常小的濃度范圍內(nèi)，超過某些閾值，可能二者之間的作用存在相互拮抗，因為在一些情況下，如表3和表4所示，搭配使用的結果出人意料地比單獨使用AS或LA都低。本發(fā)明還提供了含有AS和LA的共培養(yǎng)培養(yǎng)基的配方，以使本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化體系得到整體上的優(yōu)化和改進。本發(fā)明還研究了在對轉(zhuǎn)化體初步篩選及再次篩選中，采用潮霉素進行篩選的方案，現(xiàn)有技術中一般都采用從一而終的高濃度潮霉素篩選抗性轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，采用梯度篩選即先低濃度后高濃度的潮霉素對初步轉(zhuǎn)化體進行選擇，與對照相比，能夠顯著降低假陽性率，提高獲得陽性再生植株的比例。本研究中發(fā)現(xiàn)，不同的外植體對于潮霉素的耐受力不相同，因此，不同的外植體采用不同的梯度設置，如以子葉為外植體時，潮霉素篩選梯度為10mg/L, 25mg/L。如以子葉節(jié)為外植體時,潮霉素篩選梯度為7mg/L, 15mg/L。


圖I黃瓜子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化過程I :預培養(yǎng)；2 :選擇培養(yǎng)；3 :抗性植株；4 :對照。圖2不同選擇壓對子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化的影響每組柱形圖從左到右依次為對照、15mg/L Hyg篩選、梯度Hyg篩選。圖3黃瓜抗性植株的PCR檢測圖4黃瓜抗性植株的southern blot檢測圖5黃瓜MiMPKl轉(zhuǎn)化植株的根結線蟲田間接種試驗I對照；2黃瓜轉(zhuǎn)化植株圖6黃瓜轉(zhuǎn)基因植株田間接種根結線蟲鑒定結果縱坐標表示平均根結數(shù)(根結數(shù)/株)、
圖7不同LA/AS處理對黃瓜子葉節(jié)再生頻率的影響左縱坐標表示再生頻率(％ )，右縱坐標表示再生芽數(shù)/外植體(個)圖8PCR驗證黃瓜子葉節(jié)再生植株轉(zhuǎn)化效率
具體實施例方式以下通過實驗具體描述本發(fā)明的技術方案，但以下實驗不應被解釋為對本發(fā)明的限制。試驗材料本試驗所用的試驗材料是新泰密刺黃瓜，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所黃瓜育種課題組提供。根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105。質(zhì)粒載體為pCAGC1341_dsMiMpkl，含有潮霉素抗性基因和線蟲基因MiMPKl，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所植物病理實驗室惠贈。以上生物材料，本實驗室亦有保存，可自申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗證實驗。其它試劑MS基本培養(yǎng)基(M5519)、硫辛酸(LA)和乙酰丁香酮(AS)購自Sigma (上海)生物技術公司，6-BA、ABA、IAA、AgN03、頭孢霉素(Cef)、卡納霉素(Km)、利福平(Rif)、潮霉素(Hyg)、NaCl、酵母粉、蛋白胨均購自北京拜爾迪生物技術公司。所配制的MS固體(液體)培養(yǎng)基和LB固體(液體)培養(yǎng)基高壓滅菌后常溫保存?zhèn)溆?；試驗所需試劑配制為母液后用一次性過濾器(0. 22um)過濾除菌，-20°C保存?zhèn)溆?，培養(yǎng)基配方如表I所不。表I本發(fā)明最終確定的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化用優(yōu)化培養(yǎng)基
權利要求
1.一種將抗根結線蟲的RNA干擾基因?qū)朦S瓜的方法，包括以下步驟 (1)預培養(yǎng)黃瓜外植體子葉或子葉節(jié)； (2)準備用于浸染的含有外源基因載體的農(nóng)桿菌液； (3)將所述外植體置于所述農(nóng)桿菌懸液中浸染15 20mins； (4)浸染后的外植體接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25°C黑暗條件下培養(yǎng)2 3d ; (5)共培養(yǎng)后的外植體置于初步選擇培養(yǎng)基中初步篩選2 3周，篩選抗生素為潮霉素； (6)初步篩選出的外植體轉(zhuǎn)入到再次選擇培養(yǎng)基中再次篩選I周，篩選抗生素為潮霉素； (7)再次篩選出的保持綠色的外植體接種到添加0.5mg/L GA的BPM培養(yǎng)基中伸長培養(yǎng); (8)生根培養(yǎng)獲得再生植株； 其特征在于所述含有外源基因載體為pCAGC1341-dsMiMpkl，(2)中的農(nóng)桿菌懸液中和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有硫辛酸50 100mg/L，乙酰丁香酮50mg/L。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉，所共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2.Omg/LBA+1. Omg/L ABA+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉節(jié)，所共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/LBA+2. Omg/L AgN03+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。
4.根據(jù)權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉，(5)和(6)中用于篩選的潮霉素的濃度分別為10mg/L, 25mg/L。
5.根據(jù)權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉節(jié)，(5)和(6)中用于篩選的潮霉素的濃度分別為7mg/L, 15mg/L。
6.根據(jù)權利要求4所述的方法，所述初步選擇培養(yǎng)基為MS+2.Omg/L BA+1. Omg/LABA+1 Omg/L Hyg+400mg/L cef, pH = 5. 4,再次選擇培養(yǎng)基為MS+25mg/L Hyg+400mg/L cefpH = 5. 4。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，所述初步選擇培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L BA+2. Omg/LAgN03+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4,再次選擇培養(yǎng)基為MS+15mg/L Hyg+400mg/Lcef pH = 5. 4。
8.根據(jù)權利要求I 7任一所述的方法，(I)中所述預培養(yǎng)指外植體為子葉，經(jīng)消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養(yǎng)基中生長I 2天后，切除胚根，子葉部分十字對切成4塊，獲得子葉外植體；或所述外植體為子葉節(jié)，經(jīng)消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)4 5天，當子葉呈直立狀態(tài)時切取，去除1/2子葉僅留2mm的下胚軸，并在預培養(yǎng)基PM上培養(yǎng)2天得到子葉節(jié)外植體。
全文摘要
本發(fā)明“一種將抗根結線蟲的RNA干擾基因?qū)朦S瓜的方法”，涉及黃瓜轉(zhuǎn)基因技術。其特征在于在轉(zhuǎn)化過程中，利用含有外源基因載體pCAGC1341-dsMiMpkl，在農(nóng)桿菌懸液中和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中均添加硫辛酸100mg/L和乙酰丁香酮50mg/L以提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率，此外本發(fā)明還采用了潮霉素梯度篩選的方法以及相應的培養(yǎng)基方案，進一步提高了獲得黃瓜陽性轉(zhuǎn)化體的效率。
文檔編號C12N15/82GK102634539SQ20121001685
公開日2012年8月15日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權日2012年1月18日
發(fā)明者張圣平, 王燁, 苗晗, 謝丙炎, 陳國華, 顧興芳 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所