專利名稱：三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養(yǎng)方法，尤其是涉及三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
呼腸孤病毒是ー類宿主范圍很廣的病毒，其宿主可涵蓋哺乳動物、禽類、昆蟲、水生動物等。感染水生生物的一類呼腸孤病毒被歸類為水生呼腸孤病毒屬。Meyers等于1979年首次從美國牡蠣中分離到了水生呼腸孤病毒。目前分離鑒定的水生呼腸孤病毒有40余株。這些病毒主要通過呼吸和腸道侵染宿主，導(dǎo)致宿主出血病和肝臟與胰臟的疾病。在全球范圍內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中造成了巨大的損失，嚴重威脅了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。水生呼腸孤病毒是水生動物中普遍存在的病毒，在魚、蝦、蟹中均有報道。三疣梭子蟹是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在我國的江浙、兩廣、福建等地已經(jīng)開始成功的規(guī)?；B(yǎng)殖，近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，各種病害頻繁爆發(fā)。課題組在對三疣梭子蟹病害的研究過程中，首次從患病的三疣梭子蟹體內(nèi)檢測到了呼腸孤病毒的存在，通過人エ感染實驗等研究確定其為秋冬季梭子蟹大量死亡的主要病原，該病毒給三疣梭子蟹的養(yǎng)殖帶來了巨大的損失。為了尋找預(yù)防和控制三疣梭子蟹呼腸孤病毒感染的有效方法，對該病毒開展病原生物學(xué)、診斷學(xué)、感染機理等方面研究顯得尤為重要。這就必須要有穩(wěn)定的病毒來源，最好的方法就是對其進行體外培養(yǎng)。迄今為止，國內(nèi)外對病毒的體外培養(yǎng)多集中在細胞培養(yǎng)等技術(shù)上，呼腸孤病毒雖然具有較廣的宿主范圍，但種間差異較大，因此，利用細胞培養(yǎng)對三疣梭子蟹呼腸孤病毒進行體外培養(yǎng)需要相應(yīng)的細胞株或細胞系，目前還沒有成熟的蟹細胞培養(yǎng)技木。另外，細胞培養(yǎng)法存在培養(yǎng)成本高、培養(yǎng)條件要求高等缺點，同時還存在著病毒能否傳代的問題。雞胚培養(yǎng)是ー種廣泛運用于哺乳動物病毒、禽類病毒等的培養(yǎng)方法，如授權(quán)公告號為CN101633911A，公告日為2010年I月27日，發(fā)明名稱為“適合于大規(guī)模生產(chǎn)人用禽流感疫苗的純化技術(shù)中病毒的培養(yǎng)方法”，就采用了 9-11日齡無畸形、血管清晰、活動的健康雞胚進行病毒培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方法可為規(guī)?；a(chǎn)人用禽流感病毒裂解疫苗提供足夠的、合格的禽流感病毒。但是，病毒雞胚培養(yǎng)多見于ー些高等動物病毒的培養(yǎng)，在水生動物病毒領(lǐng)域的研究應(yīng)用極其罕見。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于利用雞胚培養(yǎng)方法培養(yǎng)蟹類病毒包括三疣梭子蟹呼腸孤病毒的方法的相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，該方法首次將雞胚培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于三疣梭子蟹呼腸孤病毒的培養(yǎng)，可實現(xiàn)三疣梭子蟹呼腸孤病毒快速、高效、穩(wěn)定、便捷的體外傳代培養(yǎng)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為
一種呼腸孤病毒，所述病毒為三疣梭子蟹呼腸孤病毒(Portunnustrituberculatusreovirus),該病毒為球狀對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，直徑30±10nm。毒株為R1015株，保藏號為CGMCC No. 5379，于2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心?！N三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，采用SPF雞胚作為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇3-4日齡健康雞胚，將預(yù)先制備好的三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，繼續(xù)培養(yǎng)直至雞胚出現(xiàn)死亡，收集培養(yǎng)時間為3-10天的死亡雞胚進行勻漿、離心分離，得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液。具體的操作步驟如下
(1)選取符合SPF規(guī)格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相対濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養(yǎng)3-4天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室邊 緣并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用；
(2)選取感染呼腸孤病毒的三疣梭子蟹若干只，取鰓、肌肉和內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比Ig:IOml比例將鰓、肌肉和內(nèi)臟的混合物加入到PH為7. 4的TNE緩沖液，于勻漿器中勻漿；將勻漿液于4°C，6000g，離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用I 2ml的TNE緩沖液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4°C，6000g,離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液先用O. 45 μ m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的濾膜抽濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000単位青霉素和IOOOug鏈霉素后，于4°C冰浴過夜處理，即得到三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液；
(3)選取健康，發(fā)育良好的3-4日齡的雞胚，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液按O. 15-0. 2ml的接種量接種到雞胚的尿囊上，將已接種了病毒的雞胚于32. 5°C的恒溫條件下培養(yǎng)13-14天，收集培養(yǎng)時間為3-10天的死亡雞胚；
(4)將步驟(4)得到的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，按質(zhì)量體積比Ig:10ml比例將尿囊膜與尿囊液的混合物加入到PH為7. 4的TNE緩沖液勻漿，按步驟(3)操作，即得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液。步驟(2)中采用的TNE緩沖液配制方法是稱取6. 0578g Tris，12g Nacl，1.8612gEDTA，加入800ml雙蒸水完全溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至7. 4，加入雙蒸水定容至IOOOml，高壓滅菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明首次提出了三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，該方法具有如下優(yōu)點
(I)目前為止針對蟹病毒培養(yǎng)主要還是依靠人工感染宿主蟹后收集發(fā)病或死亡宿主蟹來獲取病毒，并沒有蟹病毒體外培養(yǎng)相關(guān)研究報道。本發(fā)明中涉及的三疣梭子蟹呼腸孤病毒雞胚培養(yǎng)是雞胚培養(yǎng)首次運用于蟹病毒的體外培養(yǎng)。利用病毒宿主蟹進行人工培養(yǎng)的方法雖然可以較好獲得的病毒，但是存在著宿主蟹帶毒的風(fēng)險。而SPF雞胚無病毒隱性感染，此外雞胚對病毒的敏感范圍很廣，多種病毒均能適用。(2)用雞胚培養(yǎng)的方法培養(yǎng)三疣梭子蟹呼腸孤病毒，克服了三疣梭子蟹呼腸孤病毒培養(yǎng)過程中無合適培養(yǎng)體系，細胞培養(yǎng)成本高、易污染且不能進行傳代培養(yǎng)及無法滿足病毒需求等缺點，并且本發(fā)明培養(yǎng)的病毒其毒力與原代病毒毒力相當(dāng)，未出現(xiàn)弱化，可用于該病毒的繼續(xù)傳代以及其他任何針對該病毒的研究。(3)蟹類病毒大多都沒有細胞培養(yǎng)的方法，因此蟹類病毒若采用細胞培養(yǎng)將面臨著諸如培養(yǎng)細胞選擇，細胞培養(yǎng)基條件探索等問題。這些過程往往需要花費大量的精力和財力。而使用蟹病毒宿主蟹進行病毒傳代除了上述的帶毒隱患外，還存在實驗動物購買成本高的問題，另外養(yǎng)殖條件和實驗管理以及季節(jié)氣候等因素也會對實驗造成一定的影響。雞胚培養(yǎng)則很好的解決了上述問題。本發(fā)明中所用的雞胚均購置當(dāng)?shù)貙ｉT的SPF種雞養(yǎng)殖場，獲取方便，成本較低，避免了開發(fā)細胞培養(yǎng)以及購買三疣梭子蟹面臨的成本高，對實驗條件要求嚴格，養(yǎng)殖管理等方面的問題，而且不會受季節(jié)氣候的影響，一年四季均可培養(yǎng)。(4)接種了三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚在上述相應(yīng)的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間下，病毒能得到較好的繁殖。綜上所述，本發(fā)明三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法提供ー種更高效、更適用的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養(yǎng)方法，以對三疣梭子蟹呼腸孤病毒進行快速、有效的體外傳代培養(yǎng)，克服了在三疣梭子蟹呼腸孤病毒培養(yǎng)過程無合適培養(yǎng)體系，現(xiàn)有培養(yǎng)方法難以進行病毒傳代培養(yǎng)的問題，因此雞胚培養(yǎng)方法在三疣梭子蟹呼腸孤病毒中的應(yīng)用將填補水產(chǎn)動物病毒雞胚培養(yǎng)體系的空白，并為以后的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。三撫梭子蟹呼腸孤病毒(Portunnustrituberculatus reovirus),毒株為 R1015株，保藏號為CGMCC No. 5379，于2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。


圖I三疣梭子蟹呼腸孤病毒雞胚培養(yǎng)電鏡觀察結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進ー步詳細描述。以下實施例對本發(fā)明作了進ー步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此，保護范圍以權(quán)利要求為準(zhǔn)。本發(fā)明三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，采用SPF雞胚作為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇預(yù)先培養(yǎng)了 3-4天的健康雞胚，將預(yù)先制備好的三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，繼續(xù)培養(yǎng)直至雞胚出現(xiàn)死亡，收集培養(yǎng)時間為3-10天的死亡雞胚進行勻漿離心分離提取含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液，該三疣梭子蟹呼腸孤病毒的毒株為R1015株，保藏號為CGMCC No. 5379，于2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。其具體培養(yǎng)方法如下
(1)選取符合SPF規(guī)格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相対濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養(yǎng)3-4天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用；
(2)選取感染呼腸孤病毒的三疣梭子蟹若干只，取鰓、肌肉和內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比Ig IOml比例將鰓、肌肉和內(nèi)臟的混合物加入到PH為7. 4的12%。的TNE緩沖液，于勻漿器中勻漿；將勻漿液于4°C，6000g，離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用I 2ml的12%。TNE重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4°C，6000g，離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液先用O. 45 μ m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的濾膜抽濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000単位青霉素和IOOOug鏈霉素后，于4°C冰浴過夜處理，即得到三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液；
(3)選取健康，發(fā)育良好的3-4日齡的雞胚，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液按O. 15-0. 2ml的接種量接種到雞胚的尿囊上，將已接種了病毒的雞胚于32. 5°C的恒溫條件下培養(yǎng)13-14天，收集培養(yǎng)時間為第3-10天的死亡雞胚；
(4)將步驟(4)得到的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，按質(zhì)量體積比Ig IOml比例將尿囊膜與尿囊液的混合物加入到PH為7. 4的12%。的TNE緩沖液勻漿，按步驟(3)操作，即得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液；
(5)傳代培養(yǎng)將步驟(4)中制備的病毒液按照步驟(3)的方法接種雞胚。 在此具體實施例中，步驟(I)中種蛋培養(yǎng)時間3天后接種效果最佳；步驟(2)中米用的TNE緩沖液配制方法是稱取6. 0578g Tris，12g Nacl，1.8612g EDTA，加入800ml雙蒸水完全溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至7. 4，加入雙蒸水定容至1000ml，高壓滅菌。在本實施例中，死亡雞胚各組織電鏡觀察結(jié)果如圖I中所示，各組織細胞中見大量的球狀病毒粒子，其形態(tài)大小與三疣梭子蟹組織中以及純化后的的病毒形態(tài)大小基本相同。將其純化后回歸接種梭子蟹感染成功，致死率100%，臨床癥狀與自然發(fā)病死亡蟹相同，說明病毒經(jīng)雞胚培養(yǎng)后病毒毒力沒有減弱。在對病毒進行雞胚傳代研究中，接種了從死亡雞胚組織中分離得到的含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液的雞胚在培養(yǎng)結(jié)束時死亡率為100%，對照組(空白對照組，未接種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚)雞胚沒有出現(xiàn)死亡，這說明了病毒的雞胚傳代培養(yǎng)是可行的。結(jié)果表明利用雞胚培養(yǎng)三疣梭子蟹呼腸孤病毒取得成功。
權(quán)利要求
1.一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于采用SPF雞胚作為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇預(yù)先培養(yǎng)了 3-4天的健康雞胚，將預(yù)先制備好的三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，繼續(xù)培養(yǎng)直至雞胚出現(xiàn)死亡，收集培養(yǎng)時間為3-10天的死亡雞胚進行勻漿離心分離，得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液，所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的毒株為R1015株，保藏號為CGMCC No. 5379，于2011年10月21日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于具體的操作步驟如下 (1)選取符合SPF規(guī)格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相對濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養(yǎng)3-4天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用； (2)選取感染呼腸孤病毒的三疣梭子蟹若干只，取鰓、肌肉和內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比Ig:IOml比例將鰓、肌肉和內(nèi)臟的混合物加入到PH為7. 4的TNE緩沖液，于勻漿器中勻漿；將勻漿液于4°C，6000g，離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用I 2ml的TNE緩沖液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4°C，6000g,離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液先用O. 45 μ m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的濾膜抽濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000單位青霉素和IOOOug鏈霉素后，于4°C冰浴過夜處理，即得到三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液； (3)選取健康，發(fā)育良好的3-4日齡的雞胚，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液按O.15-0. 2ml的接種量接種到雞胚的尿囊上，將已接種了病毒的雞胚于32. 5°C的恒溫條件下培養(yǎng)13-14天，收集培養(yǎng)時間為3-10天的死亡雞胚； (4)將步驟(3)得到的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，按按質(zhì)量體積比Ig:10ml比例將尿囊膜與尿囊液的混合物加入到PH為7. 4的TNE緩沖液勻漿，按步驟(2)操作，即得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)中采用的TNE緩沖液配制方法是稱取6. 0578g Tris，12g Nacl，1.8612g EDTA，加入800ml雙蒸水完全溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至7. 4，加入雙蒸水定容至1000ml，高壓滅菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了三疣梭子蟹呼腸孤病毒的雞胚培養(yǎng)方法，特點是采用SPF雞胚作為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇3-4日齡健康雞胚，將預(yù)先制備的三疣梭子蟹呼腸孤病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，繼續(xù)培養(yǎng)直至雞胚出現(xiàn)死亡，收集培養(yǎng)時間為3-10天的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，將尿囊膜與尿囊液混合后勻漿、離心、過濾即得到含三疣梭子蟹呼腸孤病毒的上清液，優(yōu)點是提供一種更高效、更適用的三疣梭子蟹呼腸孤病毒體外培養(yǎng)方法，以對病毒進行快速、有效的體外傳代培養(yǎng)，克服了在三疣梭子蟹呼腸孤病毒培養(yǎng)過程無合適培養(yǎng)體系，將填補蟹類病毒雞胚培養(yǎng)體系的空白，并為以后的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/93GK102628030SQ20121001913
公開日2012年8月8日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者劉聯(lián)國, 周永強, 彭嬌, 李登峰, 陳炯 申請人:寧波大學(xué)