專利名稱：甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的體外培養(yǎng)方法，尤其是涉及甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒是從發(fā)病甲魚中分離的ー種新型病毒。該病毒能導(dǎo)致甲魚系統(tǒng)性出血、敗血，來勢猛，7-10天內(nèi)累積死亡率可達(dá)90-100%。由于該病毒的研究正處于初始階段，材料均來自發(fā)病甲魚，供應(yīng)不穩(wěn)定且很有限，給該病毒研究及其引起的疾病防治研究帶來了極大的不便。鑒于此，能否建立一種適合甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒大量培養(yǎng)的方法，為該病毒的研究提供穩(wěn)定的材料，已成為目前制約該病毒研究的瓶頸。在尋找預(yù)防和控制甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒感染的有效方法的基礎(chǔ)上，要對其進(jìn)行進(jìn)ー步的研究就必須要有穩(wěn)定的病毒來源，最好的方法就是對其進(jìn)行體外培養(yǎng)，迄今為止，國內(nèi)外對病毒的體外培養(yǎng)多集中在細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)上，但是細(xì)胞培養(yǎng)操作復(fù)雜，容易產(chǎn)生污染，并且這 種方法存在培養(yǎng)成本高、培養(yǎng)條件要求相對較高等缺點，同時還存在著病毒能否傳代的問題。雞胚培養(yǎng)是ー種廣泛運(yùn)用于哺乳動物病毒、禽類病毒等的培養(yǎng)方法，如授權(quán)公告號為CN101633911A，公告日為2010年I月27日，發(fā)明名稱為“適合于大規(guī)模生產(chǎn)人用禽流感疫苗的純化技術(shù)中病毒的培養(yǎng)方法”，就采用了 9-11日齡無畸形、血管清晰、活動的健康雞胚進(jìn)行病毒培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方法可為規(guī)模化生產(chǎn)人用禽流感病毒裂解疫苗提供足夠的、合格的禽流感病毒。但是，目前國內(nèi)外罕見水生動物病毒雞胚培養(yǎng)的報道，更沒有關(guān)于利用雞胚培養(yǎng)方法培養(yǎng)甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的方法的相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供首次將雞胚培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的培養(yǎng)，可實現(xiàn)甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒快速、高效的體外傳代培養(yǎng)且穩(wěn)定、便捷的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為
一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法，采用SPF雞胚作為甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的體外培養(yǎng)載體，選擇預(yù)先培養(yǎng)了 4 6天的健康雞胚，將預(yù)先制備好的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液接種至雞胚卵黃囊內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)直至雞胚出現(xiàn)死亡,收集死亡雞胚進(jìn)行勻漿、離心分離病毒，得到含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液，該甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒(Soft-shelled turtlesystemic septicemia spherical virus, STSSSV),毒株為？1015株，保藏號為06110^0.5378，于2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。病毒無囊膜，直徑23-40nm，細(xì)胞核內(nèi)、外均可増殖。具體的操作步驟如下
(I)選取符合SPF規(guī)格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相対濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養(yǎng)4 6天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用；
(2)選取患系統(tǒng)性敗血癥的甲魚若干只，取甲魚內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比Ig=IOml比例將甲魚內(nèi)臟加入到pH為7. 4的TM緩沖液，于勻漿器中勻漿，將勻漿液于4°C，6000g離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用I 2ml的TM緩沖液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4°C，6000g，離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液用O. 45 μ m濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的針式濾頭過濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000IU青霉素和1000 μ g鏈霉素后，于4°C冰浴過夜處理，即得到甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液；
(3)選取健康，發(fā)育良好的4 6日齡的雞胚，將甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液按接種量O. 15 O. 2ml接種到雞胚的卵黃囊內(nèi)，將已接種了病毒的雞胚于33. 5°C的恒溫條件下培養(yǎng)9 10天，收集培養(yǎng)時間為第3 10天的死亡雞胚；
(4)將步驟(3)得到的死亡雞胚分離出胚體、尿囊膜與卵黃囊液，混勻后加入10倍的pH為7. 4的O. I M的TM緩沖液，重復(fù)步驟(2)即得到含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液。步驟(2)中采用的TM緩沖液配制方法是Tris 6. 0578g、MgCl. 6H20 2. 0338g補(bǔ)足雙蒸水至500ml,調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌。毒力測定取步驟(4)分離得到的含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液及從發(fā)病甲魚內(nèi)臟分離的病毒液(將發(fā)病甲魚內(nèi)臟與pH為7. 4的TM緩沖液按質(zhì)量體積比Ig : IOml比例混合)，分別于甲魚后肢肌肉注射攻毒，同設(shè)對照組注射等量TM，每組10只，觀察15天內(nèi)甲魚發(fā)病及死亡情況。對照組未發(fā)生死亡已及系統(tǒng)性敗血癥相關(guān)癥狀，雞胚源病毒組及甲魚源病毒組顯癥并全部死亡，致死率同樣達(dá)到100%，說明甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒在該培養(yǎng)方法下能很好的増殖，且未造成毒カ減弱。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明首次提出了甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法，該方法具有如下優(yōu)點
(I)用雞胚培養(yǎng)的方法培養(yǎng)甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒，避免了細(xì)胞培養(yǎng)成本高、易污染且不能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的缺點；本發(fā)明培養(yǎng)的病毒其毒力與原代病毒毒力相當(dāng)，未出現(xiàn)弱化，可用于該病毒的繼續(xù)傳代以及其他任何針對該病毒的研究。(2)所用雞胚在當(dāng)?shù)赜袑ｉTSPF養(yǎng)殖場供應(yīng)，獲取方便，成本較低，一年四季均可培養(yǎng)。(3)電鏡結(jié)合PCR的檢測方法更方便、準(zhǔn)確的檢測雞胚中病毒的存在與含量，為病毒培養(yǎng)體系建立成功與否提供了ー個更便捷的驗證途徑。(4)接種了甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚在上述相應(yīng)的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間下，病毒能得到較好的繁殖。(5)相對于現(xiàn)今利用最多的細(xì)胞培養(yǎng)而言，病毒的雞胚培養(yǎng)比細(xì)胞培養(yǎng)容易成功，操作簡單。無需特殊的設(shè)備或條件。另外SPF雞胚無病毒隱性感染，同時雞胚的敏感范圍很廣，多種病毒均能適用，且不會產(chǎn)生抗體，是我們建立ー種新的、簡便的病毒培養(yǎng)方法的不二之選。具有很高的科研價值和現(xiàn)實意義。綜上所述，本發(fā)明甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法提供ー種更高效更適用的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的體外培養(yǎng)方法，以對甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒進(jìn)行快速、有效的體外傳代培養(yǎng)，克服了在甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒培養(yǎng)過程無合適培養(yǎng)體系，現(xiàn)有培養(yǎng)方法難以進(jìn)行病毒傳代培養(yǎng)的問題，并為以后的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒(Soft-shelled turtle systemic septicemiasphericalvirus, STSSSV)，毒株為 P1015 株，保藏號為 CGMCC No. 5378，于 2011 年 10 月 21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。


圖I為接種甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒培養(yǎng)后瀕死雞胚的胚體和尿囊膜、卵黃囊液離心的沉淀制作超薄切片圖，箭頭示甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒。圖2為接種甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒培養(yǎng)后瀕死雞胚的胚體和尿囊膜、卵黃囊液PCR檢測圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。以下實施例對本發(fā)明作了進(jìn)ー步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此，保護(hù)范圍以權(quán)利要求為準(zhǔn)。本發(fā)明ー種甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法，采用SPF雞胚作為甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇預(yù)先培養(yǎng)了 4 6天的健康雞胚，將預(yù)先制備好的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液接種至雞胚卵黃囊內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)直至雞胚出現(xiàn)死亡，收集死亡雞胚進(jìn)行勻漿離心分離，得到含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液，該甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的毒株為P1015株，保藏號為CGMCC No. 5378，于2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。其具體操作步驟如下
(1)選取符合SPF標(biāo)準(zhǔn)的新鮮種 蛋，氣室向上38°C孵化，相対濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養(yǎng)4 6天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室輪廓，并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用；
(2)選取患系統(tǒng)性敗血癥的甲魚若干只，取甲魚內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比Ig:10ml比例將甲魚內(nèi)臟加入到pH為7. 4的TM緩沖液，于勻漿器中勻漿；
(3)將勻漿液于4°C，6000g離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用I 2ml的TM緩沖液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4°C，6000g，離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將上清液用O. 45 μ m濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的針式濾頭過濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000IU青霉素和1000 μ g鏈霉素，于4°C冰浴過夜處理，即得到甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液；
(4)選取健康，發(fā)育良好的4 6日齡的雞胚，將甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液按接種量O. 15 O. 2ml接種到雞胚的卵黃囊內(nèi)，將已接種了病毒的雞胚于33. 5°C的恒溫條件下培養(yǎng)9 10天，收集接種后培養(yǎng)時間為第3 10天死亡的雞胚；
(5)將步驟(3)得到的死亡雞胚分離出胚體、卵黃囊液、尿囊膜，混合后加入10倍總體積的pH為7. 4的TM緩沖液(TM緩沖液的體積為胚體、卵黃囊液和尿囊膜混合物體積的10倍)，勻漿，按步驟(3)操作，即得到含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液。傳代培養(yǎng)取步驟(5)得到的含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液按步驟(4)操作接種雞胚，收集3-10天死亡的雞胚，再重復(fù)步驟(5)得到由雞胚傳代的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液。其中步驟(2)中采用的TM緩沖液配制方法是Tris 6. 0578g、MgCl. 6H20 2. 0338g補(bǔ)足雙蒸水至500ml，調(diào)節(jié)pH至7. 4，高壓滅菌。取胚體和尿囊膜、卵黃囊液離心的沉淀制作超薄切片，電鏡下觀察、檢測病毒，電鏡觀察各組織中病毒粒子情況，如圖I所示。從圖I中我們可以觀察到大量的球狀病毒粒子，這些病毒粒子無論在形態(tài)還是大小上都與甲魚組織中的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒相同。圖2中通過提取雞胚內(nèi)病毒RNA，進(jìn)行PCR驗證獲得的目的片段大小為972bp，與已知甲魚球狀病毒核酸片段大小相符。初歩說明本發(fā)明中使用的雞胚培養(yǎng)甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的方法獲得成功。
將雞胚傳代培養(yǎng)后純化的病毒回歸接種甲魚感染成功，顯癥并全部死亡，致死率同樣達(dá)到100%，說明甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒在該培養(yǎng)方法下能很好的増殖，且未造成毒カ減弱。
權(quán)利要求
1.一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于采用SPF雞胚作為甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的體外培養(yǎng)體系,選擇預(yù)先培養(yǎng)了 4 6天的健康雞胚，將預(yù)先制備好的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液接種至雞胚卵黃囊膜內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)直至雞胚出現(xiàn)死亡，收集死亡雞胚進(jìn)行勻漿離心分離，得到含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液，所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的毒株為P1015株，保藏號為CGMCC No. 5378，于2011年10月21日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于具體的操作步驟如下 (1)選取符合SPF規(guī)格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相對濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養(yǎng)4 6天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用； (2)選取患系統(tǒng)性敗血癥的甲魚若干只，取甲魚內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比Ig=IOml比例將甲 魚內(nèi)臟加入到pH為7. 4的TM緩沖液，于勻漿器中勻漿，將勻漿液于4°C，6000g離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用I 2ml的TM緩沖液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4°C，6000g，離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液用O. 45 μ m濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的針式濾頭過濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000IU青霉素和1000 μ g鏈霉素后，于4°C冰浴過夜處理，即得到甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液； (3)選取健康，發(fā)育良好的4 6日齡的雞胚，將甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液按接種量O. 15 O. 2ml接種到雞胚的卵黃囊內(nèi)，將已接種了病毒的雞胚于33. 5°C的恒溫條件下培養(yǎng)9 10天，收集培養(yǎng)時間為第3 10天的死亡雞胚； (4)將步驟(3)得到的死亡雞胚分離出胚體、尿囊膜與卵黃囊液，混勻后加入10倍的pH為7. 4的O. I M的TM緩沖液，重復(fù)步驟(2)即得到含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)中采用的TM緩沖液配制方法是Tris 6. 0578g、MgCl. 6H20 2. 0338g補(bǔ)足雙蒸水至500ml,調(diào)節(jié)pH至7· 4,高壓滅菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的雞胚培養(yǎng)方法，特點是采用SPF雞胚作為甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇預(yù)先培養(yǎng)了4-6天的健康雞胚，將預(yù)先制備好的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒接種液接種至雞胚卵黃囊內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)直至雞胚出現(xiàn)死亡，收集死亡雞胚進(jìn)行勻漿離心分離，得到含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的上清液，優(yōu)點是首次將雞胚培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的培養(yǎng)，可實現(xiàn)甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒進(jìn)行快速、高效的體外傳代培養(yǎng)且穩(wěn)定、便捷。
文檔編號C12R1/93GK102628031SQ20121001914
公開日2012年8月8日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者劉聯(lián)國, 周永強(qiáng), 彭嬌, 李登峰, 陳炯 申請人:寧波大學(xué)