專利名稱：一種分離培養(yǎng)內皮克隆形成細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分離培養(yǎng)內皮克隆形成細胞的方法，具體涉及一種從臍帶中分離培養(yǎng)內皮克隆形成細胞的方法。
背景技術：
內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，亦是具有向成熟血管內皮細胞分化能力的祖細胞。許多研究表明EPCs參與胚胎血管和出生后血管發(fā)生過程，具有新生血管、修復血管損傷、分泌多種促進新生血管生長因子的作用，在靶向治療缺血性疾病、炎癥性疾病、惡性腫瘤、防止血管再狹窄、血管創(chuàng)傷愈合、促進造血恢復等過程中有著重要臨床應用前景。目前EPCs主要來源于外周血、骨髓和臍帶血，其獲得主要存在以下問題:循環(huán)血中的EPCs數(shù)目非常低，骨髓取材不便，臍帶血取材及操作困難等。內皮祖細胞分離培養(yǎng)的難度和數(shù)量的稀少成為未來臨床應用的一個瓶頸，因此，如何有效獲得EPCs成了實驗研究和臨床應用急需解決的難題，從新的來源尋找EPCs，以克服骨髓等來源的不足成為必要。EPCs有早期EPCs及晚期EPCs兩種亞型，晚期EPCs又稱內皮克隆形成細胞(endothelial colony forming cells, ECFCs),或內皮外向生長細胞,而ECFCs作為內皮祖細胞的一種亞群，具有較高的增殖能力和較強的成血管活性。研究證實ECFCs更適用于心血管疾病等的治療，因此，獲得ECFCs對內皮祖細胞實驗研究和臨床應用非常關鍵。臍帶由羊膜、華氏膠、兩個臍動脈和兩個臍靜脈組成。2005年Ingram和2006年Cherqui兩位學者證實血管壁內存在EPCs。臍帶來源廣泛，取材容易，對供者無不利影響，無道德倫理問題的限制，如果能夠從臍帶中獲得EPCs，將會成為骨髓等來源EPCs的理想替代來源。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種臍帶來源的ECFCs的制備方法，為ECFCs的獲得提供一種具有很大優(yōu)越性的新來源。本發(fā)明的一個方面涉及一種從臍帶中分離培養(yǎng)內皮克隆形成細胞的方法，其包括以下步驟:(I)用消化酶消化離體臍帶的臍靜脈血管內膜；(2)沖洗消化后的臍靜脈，收集沖洗液；(3)取沖洗液進行細胞培養(yǎng)，得到內皮克隆形成細胞。在本發(fā)明中，所述臍帶來源于人或哺乳動物；在本發(fā)明的一個實施方案中，所述臍帶來源于人。在本發(fā)明中，所述消化酶可以為任何能夠消化血管內膜的酶，例如可為膠原酶、透明質酸酶或脫氧核糖核酸酶I型；在本發(fā)明的一個實施方案中，所述消化酶為膠原酶。在本發(fā)明的一個具體實施方案中， 所述消化酶為II型膠原酶。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，其中所述用消化酶消化臍靜脈血管內膜前還包括沖洗臍帶外周及臍靜脈腔內殘留血液的步驟。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，其中所述用消化酶消化臍靜脈血管內膜的方法為將消化酶注入臍靜脈腔內；任選地，在將消化酶注入臍靜脈腔內之前還包括結扎臍靜脈一端的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，將消化酶注入臍靜脈內后，將臍帶放入一定的緩沖液中以維持細胞的活性狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，所述用消化酶消化的條件根據(jù)不同的消化酶確定。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述消化酶為膠原酶，其反應條件為37°C溫育。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，其中所述取沖洗液進行細胞培養(yǎng)之前還包括將沖洗液進行濃縮的步驟；所述濃縮的方法例如為先離心，然后棄上清。在本發(fā)明中，所述濃縮是指收集沖洗液中細胞的過程，例如可以采用離心后棄上清或靜止后棄上清方法進行濃縮；在本發(fā)明的一個實施方案中，通過離心、棄上清的方式收集細胞。在本發(fā)明的實施方案中，所述離心的條件為收集細胞的離心條件，例如為1000-2000rpm,離心10_20min ;在本發(fā)明的一個具體實施方案中，為1500rpm, IOmin ;離心
溫度一般為4°C。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，其中所述膠原酶的濃度為0.05-0.2%重量體積比，例如為0.075-0.15%重量體積比；在本發(fā)明的一個實施方案中，所述濃度為
0.1 %重量體積比。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，其中所述的用消化酶消化的時間為30-120min，例如為45_90min，例如為60_80min ;在本發(fā)明的一個實施方案中，為60min。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基為適合內皮克隆形成細胞生長的細胞培養(yǎng)基，例如可以為含VEGF及bFGF的M199培養(yǎng)基或含添加多種生長因子的EGM-2培養(yǎng)基或DF-12培養(yǎng)基；在本發(fā)明的一個實施方案中，為EGM-2培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，在細胞培養(yǎng)基中可以添加5-20%體積胎牛血清，例如為7.5% -15%體積胎牛血清，例如為9% -12%體積胎牛血清；在本發(fā)明的一個實施方案中，添加了 10%胎牛血清。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，其中步驟(3)中所述的細胞培養(yǎng)是指將細胞按I 2 X IOVcm2接種于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)；任選地，3-5天后換液，棄去非貼壁細胞，以后每3-4天半量換液。根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的方法，在所述進行細胞培養(yǎng)后，得到的是原代內皮克隆形成細胞，可以通過傳代，獲得傳代后的內皮克隆形成細胞。所述傳代方法為本領域常用的貼壁細胞的傳代方法，例如可以用胰酶消化細胞，然后按照一定比例傳入新的培養(yǎng)瓶中；所述胰酶的濃度例如可以為0.125%-0.25%，所述一定比例可以為1:2-1:4;在本發(fā)明的一個實施方案中，所述胰酶的濃度為0.25%，所述一定的比例為1: 3。在本發(fā)明的一個實施方案中，待細胞達80%以上融合時再進行消化傳代。本發(fā)明的第二方面涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述方法獲得的內皮克 隆形 成細胞。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項所述的內皮克隆形成細胞，其表達⑶34、⑶73、⑶90、CD105、CD31 和 VEGFR2，不表達 CD45、CD31 和 HLA-DR。根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項所述的內皮克隆形成細胞，其表達vWF。本發(fā)明還涉及臍帶在制備內皮克隆形成細胞中的用途。本發(fā)明還涉及血管內膜消化酶在制備內皮克隆形成細胞中的用途。 在本發(fā)明中，按照本發(fā)明制備方法獲得的內皮克隆形成細胞命名為臍帶源ECFCs。在本發(fā)明中，所述臍帶可以來源于人或哺乳動物；臍帶是連接胚胎和胎盤之間的索狀結構，外被羊膜，內含臍靜脈、臍動脈和體蒂分化的粘液性結締組織即華通氏膠(Wharton jelly)。在本發(fā)明中，所述臍帶源ECFCs來源于臍靜脈，因此當臍靜脈從所述臍帶剝離時，所述臍帶也可以指臍靜脈。在本發(fā)明中，所述血管內膜是指臍靜脈內皮和內皮下層。在本發(fā)明中，所述消化酶是指能夠消化血管內膜的酶。在本發(fā)明中，所述消化血管內膜是指通過消化酶的作用分離血管內皮細胞的過程。在本發(fā)明中，所述膠原酶可以為II型膠原酶或I型膠原酶。在本發(fā)明中，所述內皮克隆形成細胞是指具有高增殖潛能和成血管能力的一類內皮祖細胞，其形態(tài)呈鋪路石樣，具有細胞克隆形成能力，增殖能力強，能夠連續(xù)傳代，細胞周期具有干細胞特點，免疫表型為表達⑶34、VEGFR2、⑶73、⑶90、⑶105，同時表達⑶31及vWF成熟內皮細胞標志，不表達HLA-DR，具有和內皮細胞吞噬及成血管能力一樣的功能。


圖1為臍帶源ECFCs的細胞形態(tài)；圖2為臍帶源ECFCs的細胞生長曲線；圖3為臍帶源ECFCs的細胞周期分析；圖4為臍帶源ECFCs的免疫表型流式細胞儀分析；圖5為臍帶源ECFCs的細胞克隆形成實驗；圖6為臍帶源ECFCs成血管實驗；圖7為臍帶源ECFCs吞噬實驗；圖8為免疫熒光檢測臍帶源ECFCs vWF表達；其中C圖為陰性對照組；D圖為vWF陽性組；其中標尺為100 μ m。圖9為免疫組織化學法檢測臍帶源ECFCs vWF表達。其中左圖為陰性對照組；右圖為vWF陽性組；其中標尺為100 μ m。發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明的從臍帶中分離培養(yǎng)內皮克隆形成細胞的方法，操作簡單易行，分離成功率100%，其形態(tài)、增殖能力、免疫表型、細胞周期、克隆形成能力等指標符合內皮克隆形成細胞的特征，且在10代以內形態(tài)和免疫表型不變，無衰老現(xiàn)象，為滿足實驗研究和臨床應用提供了堅實的保障。2.本發(fā)明的臍帶源ECFCs體外易擴增， 增殖能力強，為ECFCs的獲得提供了新的來源。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。實施例1臍帶源ECFCs的分離和培養(yǎng)(I)用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH = 7.0)反復沖洗足月人臍帶外周及臍靜脈腔殘留血液，去除血液；(2)用無菌手術線結扎臍帶一末端，在臍靜脈腔內注入5-10毫升濃度為0.1%重量體積比的II型膠原酶，并在臍帶另一端進行結扎，置入盛有磷酸鹽緩沖液(也可用生理鹽水、Hank’ S液代替)的平皿中，所述緩沖液用于維持臍帶中細胞的狀態(tài)；(3)放入37°C培養(yǎng)箱中孵育，II型膠原酶(GIBC0，美國)消化60分鐘；(4)用磷酸鹽緩沖液反復沖洗臍靜脈腔5次，收集沖洗液，1500rpm/min離心IOmin,棄上清,收集細胞沉淀；(5)細胞按I 2X IOVcm2接種于T75塑料培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清的完全EGM-2培養(yǎng)基(Lonza，瑞士)，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3_5天后換液，棄去非貼壁細胞，以后每3-4天半量換液。(6)待倒置顯微鏡下觀察細胞達80%融合，0.25%胰酶消化，按1: 3傳代。本方法短期內可獲得大量的臍帶源內皮克隆形成細胞(ECFCs)，例如培養(yǎng)至第30天，約至P3代時可培養(yǎng)5.4 X IO7個細胞。實施例2臍帶源ECFCs原代細胞培養(yǎng)及傳代過程觀察采用實施例1方法分離的臍帶源ECFCs原代細胞多于24_36小時內貼壁，可見梭形、圓形貼壁細胞，培養(yǎng)3-7天，倒置顯微鏡觀察到散在分布的細胞克隆，細胞呈梭性、多角形、圓形，胞體大。7-10天后增長速度較快，出現(xiàn)許多細胞克隆，10-14天左右可達80%細胞融合，呈鋪路石樣排列。連續(xù)傳10代，細胞形態(tài)無明顯改變。(圖1)圖1為臍帶來源的ECFCs的細胞形態(tài)。㈧、原代細胞培養(yǎng)36h ；⑶、原代細胞培養(yǎng)第5天；(C)、原代細胞培養(yǎng)第14天；(D)、Pl代細胞；(E)、P3代細胞；(F)、PlO代細胞。實施例3臍帶源ECFCs生長曲線的測定將按照實施例1方法獲得的貼壁細胞達80%融合后用0.25%胰酶消化后，按2 X IO4細胞/孔接種在24孔板內，每隔24h消化3個孔，收集細胞，并用0.4%的臺盼蘭計數(shù)活細胞，共觀察7天，繪制生長曲線。臍帶源ECFCs生長曲線基本符合細胞生長曲線規(guī)律，分為潛伏期、對數(shù)期、平臺期，分別為l-2d、3-7d和7d后。提示臍帶源ECFCs在體外增殖相對穩(wěn)定，生長狀態(tài)無異常。細胞增殖較快，在對數(shù)生長期，細胞倍增時間均約為(43.53±5.38)h (圖2)。實施例4臍帶源ECFCs的細胞周期測定在實施例1獲得的臍帶源ECFCs生長的對數(shù)期，消化細胞，冷凍75%乙醇4°C固定lh, 10 μ g/mL的RNase A 37° C孵育30min,加入50 μ g/mL碘化丙唳4°C避光孵育5min,流式細胞儀(FACA Calibur型，美國)檢測，ModiFIT軟件分析結果。流式細胞儀分析細胞周期顯示，GcZG1期占75.58%，S+G2+M期的細胞僅占24.42%(圖 3)。結果表明，臍帶源ECFCs大多數(shù)細胞處于G0/G1期，少數(shù)處于S期，具有典型干細胞增殖特點。實施例5臍帶源ECFCs的免疫表型分析取按照實施例1方法制備的第3代處于對數(shù)生長期的臍帶源ECFCs，按每管I X IO5個細胞，依次加入 ο μ IPE標記的鼠抗人單克隆抗體CD31，CD73，CD105，VEGFR2，F(xiàn)ITC標記的⑶34，⑶45，⑶90，HLA-DR抗體(以上抗體均購自BD PharMingen，美國)及其相應同型對照標記ECFCs細胞，室溫避光30分鐘；用PBS洗2_3次，流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測第3代細胞免疫表型顯示，貼壁細胞均表達⑶34、⑶73、⑶90和CD105、CD31、VEGFR2，不表達CD45和內皮細胞的特征性表型CD31，不表達HLA-DR。CD34表達在傳代過程中表達逐漸下降，一般在5-7代以后表達消失，其余表達則不變(圖4)。結果表明，按照本發(fā)明方法制備得到的細胞是內皮克隆形成細胞，而不是普通的血管內皮細胞。實施例6臍帶源ECFCs的細胞集落形成實驗按照實施例1方法制備得到的貼壁細胞常規(guī)消化，以IXlO3個細胞接種于直徑60cm培養(yǎng)皿中，37°C,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)14天，甲醇固定5分鐘，棄培養(yǎng)基，0.5%結晶紫染色，以大于50個細胞為一個集落，計算集落數(shù)。細胞集落形成實驗顯示每IO3個細胞約有36個克隆形成(圖5)。結果表明，臍帶源ECFCs具有細胞克隆形成能力，增殖能力強。實施例7細胞表型特征實驗1.成血管實驗按每孔30 μ IMatrigel溶液(BD，美國)接種到預冷的48孔板中，置于37 °C、40min,使Matrigel凝固。按照實施例1方法制備得到的第三代ECFCs調整為濃度lX104/lml，按每孔Iml加入鋪好Matrigel的48孔板中，置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24h。設三個復孔，倒置顯微鏡下觀察血管形成。細胞接種于Matrigel中孵育24小時拉長，成為芽式生長，形成管狀樹枝狀分叉結構(圖6)。成血管實驗結果表明，臍帶源ECFCs體外具有形成新生血管的能力。2.吞噬實驗按照實施例1方法制備得到的第三代ECFCs在玻片上培養(yǎng)5d后，PBS漂洗I次后加入乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL，10 μ g/ml)，37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4h，PBS漂洗2次，1%多聚甲醛固定20min，PBS漂洗后，加入DAPI(L 5μ g/ml)，37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中避光孵育lh，在倒置熒光顯微鏡下觀察。倒置熒光顯微鏡下觀察紅色細胞為吞噬Dil-acLDL的ECFCs (圖7)。吞噬實驗結果表明，臍帶源ECFCs具有內皮細胞吞噬功能的特點。實施例8免疫熒光方法檢測細胞表面血管性血友病因子(vWF)的表達按照實施例1方法制備 得到的第三代ECFCs在玻片上培養(yǎng)5d后，用1%多聚甲醛固定10min;PBS洗2次，0.2%riton-100透膜20min，依次加入1: 50稀釋鼠抗人vWF單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology,美國)100 μ I, 37°C孵育 lh, PBS 洗 2 次,加入羊抗鼠IgG抗體，37°C孵育lh，PBS洗2次，DAPI (1.5ug/ml)染核30min，倒置熒光顯微鏡下觀察結果。倒置熒光顯微鏡下觀察紅色細胞為表達vWF陽性的ECFCs (圖8)。結果表明，臍帶源ECFCs表達內皮細胞標志vWF抗原。實施例9vWF免疫組織化學檢測按照實施例1方法制備得到的第三代ECFCs在玻片上培養(yǎng)5d后，用1%多聚甲醛固定10min，PBS洗2次，用3% H2O2滅活內源性過氧化物酶lOmin，山羊血清阻斷l(xiāng)Omin，然后分別加入1: 50稀釋鼠抗人vWF單克隆抗體100μ 1，37°C孵育60min，用PBS清洗后加入二抗37°C孵育30min，DAB顯色，顯微鏡下觀察，細胞漿棕色為陽性反應細胞，根據(jù)棕色深淺判斷陽性強度。免疫細胞化學染色顯示，ECFCs表達vWF，陽性細胞呈棕褐色染色，陰性對照未見染色(圖9)。結果表明，臍帶源ECFCs表達內皮細胞標志vWF抗原。盡管本發(fā)明的具體實施方式
已經(jīng)得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的全部范 圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
權利要求
1.一種從臍帶中分離培養(yǎng)內皮克隆形成細胞的方法，其包括以下步驟: (1)用消化酶消化離體臍帶的臍靜脈血管內膜； (2)沖洗消化后的臍靜脈，收集沖洗液； (3)取沖洗液進行細胞培養(yǎng)，得到內皮克隆形成細胞。
2.權利要求1的方法，其中所述消化酶為膠原酶、透明質酸酶或脫氧核糖核酸酶I型。
3.權利要求1的方法，其中所述用消化酶消化臍靜脈血管內膜前還包括沖洗臍帶外周及臍靜脈腔內殘留血液的步驟。
4.權利要求1的方法，其中所述用消化酶消化臍靜脈血管內膜的方法為將消化酶注入臍靜脈腔內；任選地，在將消化酶注入臍靜脈腔內之前還包括結扎臍靜脈一端的步驟。
5.權利要求1的方法，其中所述取沖洗液進行細胞培養(yǎng)之前還包括將沖洗液進行濃縮的步驟；所述濃縮的方法例如為先離心，然后棄上清。
6.權利要求2的方法，其中所述膠原酶的濃度為0.05-0.2%重量體積比，例如所述濃度為0.1 %重量體積比。
7.權利要求1的方法，其中所述的用消化酶消化的時間為30-120min，例如為60min。
8.權利要求1的方法，其中所述細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基為M199培養(yǎng)基或EGM-2培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權利要求1-8任一項所述方法獲得的內皮克隆形成細胞。
10.權利要求9的內皮克隆形成細胞，其表達⑶34、⑶73、⑶90、⑶105、⑶31和VEGFR2，不表達CD45和HLA-DR。
11.權利要求9的內皮克隆形成細胞，其表達vWF。
12.臍帶在制備內皮克隆形成細胞中的用途。
13.血管內膜消化酶在制備內皮克隆形成細胞中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離培養(yǎng)內皮克隆形成細胞的方法，具體涉及一種從臍帶中分離得到內皮克隆形成細胞的方法，其包括以下步驟(1)用消化酶消化臍靜脈血管內膜；(2)沖洗消化后的臍靜脈，收集沖洗液；(3)取沖洗液進行細胞培養(yǎng)，得到內皮克隆形成細胞。本發(fā)明分離得到的臍帶源內皮克隆形成細胞，其細胞形態(tài)、細胞周期、免疫表型、成管能力和吞噬能力等符合內皮祖細胞生物學特征，證明了臍帶可以作為內皮祖細胞的新來源，為實驗研究和臨床應用提供了保障。
文檔編號C12N5/071GK103215218SQ201210019579
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月21日 優(yōu)先權日2012年1月21日
發(fā)明者陳虎, 張顥, 張斌, 扈江偉, 湯永永 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院