專利名稱：一種產油微生物的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種產油微生物的培養(yǎng)方法，屬于生物技術領域。更具體地講，是直接利用碳水化合物聚合物為培養(yǎng)基的碳源，在水解酶存在下培養(yǎng)產油微生物，實現(xiàn)將碳源轉化為貯存在細胞內的油脂。該油脂含有一種或多種長鏈脂肪酸及其衍生物，可用于制備生物柴油、功能性油脂或其他高附加值產品。
背景技術：
某些酵母、霉菌、細菌和藻類等在一定條件下，能夠以碳水化合物、碳氫化合物等為碳源，在體內合成并貯存大量油脂，凡是可以在胞內油脂積累超過細胞干重20%的微生物稱為產油微生物(Ratledge C,ffynn JP Adv Appl Microbiol, 2002, 51:1-52)。某些產油微生物的甚至可以積累超過其細胞干重的70%的微生物油脂。微生物油脂，尤其是酵母產生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸組成與商品化的動植物油脂相似，以C14-C22長鏈脂肪酸為主。相對于動植物油脂，微生物油脂生產周期短，不受季節(jié)與氣候限制，原料來源廣，基本不占用額外耕地資源，易于實現(xiàn)規(guī)模生產，被認為是很有潛力的新型油脂資源。因此，微生物油脂不僅可能作為食用油或其他功能性油脂的替代品，還可能在可再生液體燃料生物柴油產業(yè)發(fā)展中發(fā)揮重要作用(趙宗保.中國生物工程雜志，2005，25 (2):8-11)。產油微生物培養(yǎng)的碳源通常是水溶性有機化合物。利用蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、纖維二糖、甘油、水溶性低聚果糖(菊粉)、乙醇等培養(yǎng)產油微生物，已有文獻報道(Ageitos JM, et al.Appl Microbiol Biotechnol.2011,90:1219-1227)。常見的生物質，如木材、作物秸桿、農作物種子、農作物營養(yǎng)塊莖等，含有大量碳水化合物聚合物。由于聚合度較高，它們一般不溶于水。因此，通常采用各種技術手段，首先將碳水化合物聚合物降解為水溶性化合物，再利用微生物轉化制備包括油脂在內的各種代謝產物。特別地，將木質纖維素降解為可發(fā)酵性糖，然后利用這些可溶性的糖類混合物為碳源積累油脂已見諸報道。發(fā)酵性絲孢酵母Trichosporon fermentans利用脫毒的稻草烯酸水解液發(fā)酵,8天后,菌體油脂含量達到 40.1% ( Huang C，et al.Bioresour Technol, 2009,100(19):4535-4538)；利用產油酵母Cryptococcus curvatus對麥桿烯酸水解液發(fā)酵,菌體油脂含量為35.5%。利用油脂酵母Lipomyces starkeyi對麥桿烯酸水解液發(fā)酵,菌體油脂含量達到31.2% (YuXC, et al.Bioresour Technol, 2011，102:6134-6140)。采用固態(tài)發(fā)酵模式，可以將生物質原料直接轉化為油脂。如，用經氣爆預處理的麥桿為原料，培養(yǎng)一種可分泌纖維素酶的植物內生真菌，在額外添加10FPU/g底物的纖維素酶條件下，通過10天發(fā)酵，油脂得率為80mg/g干物質(Peng Xff, Chen HZ.BioresourTechnol.2008,99:3885-3889)。在優(yōu)化條件下，米曲霉 Aspergillus oryzae A-4 轉化麥桿生產微生物油脂，培養(yǎng)6天后油脂得率為62mg/g干物質(Lin H, et al.BioresourTechnol.2010,101:7556-7562)。上述例子中，微生物雖然同時具備生產纖維素酶和積累油脂的功能，然而其產酶能力低，酶水解效果差，且采用固態(tài)發(fā)酵模式，發(fā)酵周期長，轉化率低，油脂產量低。
由于現(xiàn)有產油微生物培養(yǎng)技術利用水溶性有機化合物為主要碳源，原料成本高，整體效率低，難以規(guī)?；a。因此，研究發(fā)展新技術，拓展產油微生物培養(yǎng)的碳源，具有重要意義。

發(fā)明內容
直接利用碳水化合物聚合物為碳源，培養(yǎng)產油微生物，有可能大幅度降低原料成本，簡化操作工藝，提高效率，改善微生物油脂的技術經濟性。因此，發(fā)明人對產油微生物的培養(yǎng)條件進行了研究，發(fā)現(xiàn)纖維素懸浮液和纖維素酶共存的環(huán)境中，加入產油微生物活菌體、孵育一定時間后，細胞內可以積累大量油脂，并且纖維素同時被消耗。進而，發(fā)明人對培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出一種產油微生物的培養(yǎng)新方法，其特征在于培養(yǎng)基的碳源為碳水化合物聚合物，并且培養(yǎng)基中存在水解碳源的酶，產油微生物接種量為0.05 0.50克干菌體/克碳水化合物聚合物，培養(yǎng)溫度20 45°C，pH 3 7，通空氣液體懸浮培養(yǎng)。該方法使產油微生物培養(yǎng)直接以生物質為原料，提高微生物油脂生產的技術經濟性，具有廣闊應用前景。該方法獲得的微生物油脂含有一種或多種脂肪酸及其衍生物，可用于制備生物柴油或其他高附加值產品。本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn):1、制備產油培養(yǎng)基。將碳水化合物聚合物或含有碳水化合物聚合物的材料、碳水化合物聚合物水解酶和水混合，制成懸浮液，為產油培養(yǎng)基。2、制備產油微生物種子。采用營養(yǎng)相對豐富的培養(yǎng)基，在20 37°C，pH 3 8，通氣培養(yǎng)產油微生物，培養(yǎng)結束后，采用離心分離或過濾的方法收集濕菌體，得到產油微生物活細胞，為產油微生物種子。3、培養(yǎng)產油微生物積累油脂。將產油微生物種子按相當于0.05 0.5克干菌體/克碳水化合物聚合物的接種量添加到產油培養(yǎng)基中，在20 45°C，pH 3.0 7.5，通氣培養(yǎng)，當培養(yǎng)基中碳源含 量低于5g/L時,終止培養(yǎng)。4、生物量和油脂量的測定。參照文獻(Li YH, et al.Enzyme Microb Technol,2007,41 =312-317)的方法，發(fā)酵液經離心、洗滌，收集沉淀。沉淀在105°C干燥至恒重，參照文獻(Updegraff DM.Anal Biochem, 1969, 32:420-424)的方法,測定發(fā)酵液中殘留的纖維素，計算得到生物量；參照文獻(李植峰，等.微生物學通報，2001，28 ￠):72-75)使用酸熱-有機溶劑法抽提獲得油脂，計算菌體油脂量。本發(fā)明制備產油微生物種子參照常用的微生物培養(yǎng)方法，使用營養(yǎng)豐富、有利于菌體快速增殖的培養(yǎng)基。在菌體增殖階段后期，在波長600納米處測量發(fā)酵醪液的光吸收，即得到0D600nm值，采用離心或膜過濾的方法從發(fā)酵醪液中分離收集產油微生物細胞。發(fā)酵醪液在800g以上的離心力作用下離心，得到濕菌體；發(fā)酵醪液也可用孔徑小于5um的膜過濾,得到濕菌體,用于接種產油培養(yǎng)基。接種時依據(jù)產油培養(yǎng)基的體積和液體種子后期的0D600nm值,可以計算得到接種密度。本發(fā)明所適用的碳水化合物聚合物為纖維素、半纖維素、木聚糖、淀粉、主要成份為纖維素和半纖維素的生物質材料、主要成份為淀粉的生物質材料或者它們中幾種的混合物。其中主要成份為纖維素和半纖維素的生物質材料為玉米秸桿、麥桿、稻草、甘蔗渣、玉米芯、林業(yè)生產下腳料、松木、云杉中的一種或二種以上組合；主要成份為淀粉的生物質材料為玉米、稻谷、高粱、小麥、大麥、木薯、甘薯中的一種或二種以上組合。本發(fā)明所述水解碳源的酶為具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶、生淀粉糖化酶、淀粉酶、糖化酶的一種或它們的必要組合。其中，纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖苷酶、淀粉酶和糖化酶從寧夏和氏璧生物技術有限公司購得，比活力分別為5萬U/g、120萬U/g、15萬U/g、120萬U/g、3萬U/g和3萬U/g。生淀粉糖化酶參照文獻方法(李或娜，等.應用與環(huán)境生物學報，2010，16(5):714-718)制備，比活力為8萬U/g。在活力測試條件下，Ig酶制劑水解碳水化合物聚合物施放出相當于Img葡萄糖的還原糖量，定義為I個酶活力單位(U)。本發(fā)明每克碳水化合物聚合物添加酶活力為5 100U的碳水化合物聚合物的水解酶，使聚合物在培養(yǎng)過程中水解成可被產油微生物利用的產物。依據(jù)碳水化合物聚合物材料的理化性質和產油微生物的性狀特征，本發(fā)明制備產油培養(yǎng)基可使用多種酶制劑的組合。例如，以預處理過的秸桿為碳源時，為了更好地利用碳源，需要同時使用纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶和葡萄糖苷酶。本發(fā)明所述產油微生物液體培養(yǎng)基除含有碳水化合物聚合物和水解酶制劑外，還可含有其他微生物培養(yǎng)常用營養(yǎng)物質，其他微生物培養(yǎng)常用營養(yǎng)物質包括質量為碳源總質量0.1 % 20%的氮源、質量為碳源總質量0.01 % 15%的磷源、或質量為碳源總質量
0.01% 5%的硫源或它們中的二種或三種的組合。本發(fā)明所述的氮源為銨鹽及經在水溶液中可釋放形成銨離子的物質。本發(fā)明所述的磷源為磷酸鹽及經水解可釋放出磷酸根的物質。本發(fā)明所述產油微生物為經發(fā)酵培養(yǎng)后菌體油脂含量可超過細胞干重20%的真核微生物，它們包括但不限于，油脂酵母，如斯達油脂酵母Lipomyces starkeyi ;紅酵母,如圓紅冬抱酵母Rhodosporidi um toruloides、粘紅酵母Rhodotorula glutinis和擲抱酵母Sporobolomyces roseus ;絲抱酵母，如皮狀絲抱酵母Trichosporon cutaneum和發(fā)酵性絲抱酵母Trichosporon fermentans ;隱球酵母，如白色隱球酵母Cryptococcus albidus和彎曲隱球酵母Cryptococcus curvatus ;霉菌，如伯頓擬內抱霉Endomycopsis burtoni1、健強地霉 Geotrichum robustum、深黃被抱霉 Mortierella isabellina 和卷枝毛霉 Mucorcircinelloides ;產油細菌中的棒桿菌Croynebacterium、諾卡菌Nocardia和紅球菌Rhodococcusο這些菌株可以直接從中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)、美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)或中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)等菌種保藏機構購買或從自然界中分離，也可使用與原菌株性狀不同的人工或自然突變菌株。本發(fā)明所述的微生物油脂主要為長鏈脂肪酸及其衍生物的甘油酯。參照文獻(LiuB,Zhao Z B.J Chem Technol Biotechnol, 2007,82 (8):775-780)的方法，直接利用產油微生物菌體為原料，可在酸催化條件下轉酯化制備生物柴油；或參照文獻(里偉，等.過程工程學報，2007,7(1):137-140)的方法，利用提取的微生物油脂，可在酶催化條件下轉酯化制備生物柴油。本發(fā)明所述的微生物油脂還可用于制備其他高附加值產品或油脂化工產品。本發(fā)明的有益效果是:I)本發(fā)明直接利用碳水化合物聚合物進行油脂發(fā)酵，為培養(yǎng)產油微生物并制備微生物油脂提供了一種新方法；
2)與將碳水化合物聚合物首先降解為可發(fā)酵性糖，再培養(yǎng)產油微生物的傳統(tǒng)技術相比，本發(fā)明將碳水化合物聚合物的酶解糖化和油脂發(fā)酵過程耦合，簡化了工藝，提高了酶解和發(fā)酵效率；3)木質纖維素資源水解得到以葡萄糖和木糖為主的混合糖水解產物，而產油微生物利用混合糖發(fā)酵時，往往存在葡萄糖效應，發(fā)酵周期長，木糖利用率低。本發(fā)明直接利用木質纖維素進行油脂發(fā)酵，水解和發(fā)酵同時進行，培養(yǎng)基中無水溶性糖積累，避免了葡萄糖效應，纖維素和半纖維素均得到有效利用，提高了資源利用度，底物對油脂的轉化率高。4)由于本發(fā)明碳水化合物聚合物酶解糖化釋放的產物迅速被產油微生物利用，避免了水解產物對水解酶的抑制，酶活力維持時間長，因此，酶用量少；而且，由于培養(yǎng)過程條件溫和，含酶的發(fā)酵上清可重復利用。因此，本發(fā)明不僅可降低酶成本，還可減少廢水排放。5)木質纖維素資源在預處理過程中不可避免的產生許多抑制劑，如糠醛、羥甲基糠醛、乙酸、乙酰丙酸、對羥基苯甲醛、丁香醛和香蘭素等，它們對產油微生物的生長繁殖有著顯著的抑制效果，從而影響發(fā)酵效果。乙酸、甲酸、糠醛和香蘭素對產油酵母的發(fā)酵具有較強的抑制作用(Chen X, et al.Appl Biochem Biotechnol, 2009,159:591-604) ;lmM的糖醒及其衍生物對產油酵母Rhodosporidium toruloides Y4的生長抑制了 45% (Hu CM, etal.Bioresour Technol, 2009,100 =4843-4847);對玉米秸桿經過生物脫毒后培養(yǎng)產油酵母Trichosporon cutaneum CXl,油脂含量顯著提高(Huang X, et al.Bioresour Technol,2011，102 =9705-9709)。傳統(tǒng)的油脂發(fā)酵必須對預處理過程中產生的抑制性化合物進行脫毒處理。本發(fā)明中產油微生物種子接種量較大，菌體基本不增殖，主要進行油脂積累，油脂積累階段，菌對抑制劑耐受性強，可不對預處理過的木質纖維素原料進行脫毒處理。6)本發(fā)明由于產油微生物種子接種量較大，發(fā)酵培養(yǎng)基中可溶性有機物濃度低，培養(yǎng)過程中無水溶性糖積累，雜菌難以生長。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基不需滅菌處理，可簡化工藝，降低生產成本。

總之，本發(fā)明將碳水化合物聚合物轉化為微生物油脂，總體上具有工藝流程簡短、原料利用效率高、油脂得率高、成本低的技術優(yōu)勢，可顯著改善微生物油脂的技術經濟性，對生物能源產業(yè)和生物煉制具有重要意義。
具體實施例以下實施例選取了應用典型碳水化合物聚合物為材料培養(yǎng)典型產油微生物的例子，有助于了解本專利，但不以任何形式限制將本發(fā)明應用于其他材料或產油菌株。對比例I(I)發(fā)酵培養(yǎng)基:將纖維素40g/L、纖維素酶320U/L和葡萄糖苷酶600U/L的懸浮液在 pH 4.8、501:酶水解7211，調整？!1 5.5。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自美國典型微生物菌種保藏管理中心)，30°C培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液于8000rpm離心5min，得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 15 (相當于干菌體0.27g/L)，在30°C下通空氣培養(yǎng)52h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，確定干菌體含量為13.5g/L，發(fā)酵液中殘?zhí)菫?.lg/L。參照文獻(李植峰等.微生物學通報，2001，28 (6):72-75)使用酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂6.5g/L，菌體油脂含量為48.1%。實施例1(I)發(fā)酵培養(yǎng)基:于水中，纖維素40g/L，纖維素酶320U/L，葡萄糖苷酶600U/L，pH
5.2o(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自美國典型微生物菌種保藏管理中心)，30°C培養(yǎng)24h，離心收集濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 15 (相當于干菌體0.27g/L)，在37°C下通空氣培養(yǎng)52h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀測纖維素含量，確定干菌體含量為13.2g/L，殘留纖維素1.9g/L。參照文獻(李植峰等.微生物學通報，2001，28 ￠):72-75)使用酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂7.6g/L，菌體油脂含量為57.6%。比較對比例I和實施例1的結果發(fā)現(xiàn)，使用質量相等的碳水化合物聚合物和活力相同的酶制劑，按本發(fā)明的技術方案油脂產量提高了 19%。更重要的是，對比例I為了獲得葡萄糖，將纖維素在pH 4.8、50°C下酶水解72h ;而實施例1則完全免除了該水解過程。因此，同以對比例I為代表的現(xiàn)有技術方案比，本發(fā)明具有提高油脂產量和生產效率、降低成本、減少設備投資的顯著優(yōu)勢。

實施例2(I)發(fā)酵培養(yǎng)基:于水中，纖維素50g/L，磷酸二氫鉀7g/L，磷酸氫二鈉0.5g/L，纖維素酶 750FPU/L, pH 4.8。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Rhodosporidium toruloides AS 2.1389 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，30°C通氣培養(yǎng)24h,于8000rpm離心5min,得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 10 (干菌體0.18g/L)，在34°C下通空氣培養(yǎng)72h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀測纖維素含量，確定干菌體含量為12.9g/L，殘留的纖維素9.2g/L。按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂8.3g/L，油脂含量為64.3%。實施例3(I)發(fā)酵培養(yǎng)基:于水中，甘薯淀粉30g/L，硫酸銨1.0g/L,生淀粉糖化酶900U/L，pH 3.0。(2)種子制備:PDA液體培養(yǎng)基中，接入卷枝毛霉Mucor circinelloides AS
3.2208 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，28°C通氣培養(yǎng)24h，離心收集濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟⑴所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 10 (干菌體0.18g/L)，在40°C下通空氣培養(yǎng)60h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，確定干菌體含量為8.9g/L。按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂5.0g/L,油脂含量為56.1%。實施例4(I)發(fā)酵培養(yǎng)基:于水中，纖維素30g/L，酵母粉0.01g/L，纖維素酶3000FPU，pH
5.5o(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 5.5，121。。滅菌20min后,粘紅酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，26°C，200rpm振蕩培養(yǎng)28h，膜過濾得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 42 (干菌體0.75g/L)，在40°C下通空氣培養(yǎng)24h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，確定干菌體含量為20.9g/L。按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂5.2g/L，油脂含量為24.9%。

實施例5(I)發(fā)酵培養(yǎng)基:于水中，木聚糖36g/L，酵母粉1.0g/L，磷酸二氫鉀0.8g/L，木聚糖酶 180U/L, pH 7.5。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Trichosporon cutaneum AS 2.571 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，30°C通氣培養(yǎng)20h，將培養(yǎng)液于8000rpm離心5min，得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟⑴所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 5 (干菌體0.09g/L)，在30°C下通空氣培養(yǎng)36h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀測纖維素含量，確定干菌體含量為8.4g/L，殘留木聚糖4.2g/L。按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂4.lg/L，油脂含量為48.8%。實施例6(I)發(fā)酵培養(yǎng)基:于水中，纖維素120g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二氫鉀7.0g/L，磷酸氫二鈉2.0g/L,纖維素酶7200U/L，葡萄糖苷酶1200U/L，pH 5.0。(2)種子制備:在麥芽汁液體培養(yǎng)基中接入擲孢酵母Sporobolomyces roseus IAM13481 (購自日本JCM菌株保藏中心)，25°C通氣培養(yǎng)24h，離心收集濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向1.0L步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 40 (干菌體15.6g/L)，在28°C，通空氣量0.8vvm下培養(yǎng)84h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀測纖維素含量，確定干菌體含量為36.7g/L，殘留的纖維素2.9g/L。按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂19.7g/L，油脂含量為53.7%。實施例7(I)發(fā)酵培養(yǎng)基:于水中，纖維素40g/L，重懸于實施例1步驟(4)菌體分離后的含酶發(fā)酵上清中，調PH 5.2。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自美國典型微生物菌種保藏管理中心)，30°C通氣培養(yǎng)24h，離心收集濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 20 (干菌體0.36g/L)，在37°C下通空氣培養(yǎng)66h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，另取一定量的沉淀測纖維素含量，確定干菌體含量為15.lg/L，殘留的纖維素6.2g/L。按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂7.2g/L，油脂含量為47.7%。本實施例的結果表明，碳水化合物聚合物的水解酶可以回收重復利用。這是因為，油脂積累培養(yǎng)階段條件溫和，有利于酶活力保持。實施例8(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:參照文獻(Zhang J, et al.Bioresour Technol, 2011,102:4480-4488)，以稻草為原料，洗凈，干燥，粉碎過60目篩，并用2.5%的硫酸浸潰18h，190°C蒸汽處理3min后，冷卻至50°C時,加水至固形物濃度為80g/L,調pH 5.2,加入纖維素酶1000U/L,木聚糖酶800U/L，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Lipomyces starkeyi AS 2.1560 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，25°C通氣培養(yǎng)40h，將培養(yǎng)液于8000rpm離心5min，得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 15 (干菌體0.27g/L)，在30°C下通空氣培養(yǎng)80h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂8.3g/L。實施例9(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:參照文獻(Krishnan C, et al.Biotechnol Bioeng, 2010,107:441-450)，以云杉為原料，洗凈，干燥，粉碎過60目篩，2: I (w/w)的氨水和云杉，140°C氨膨脹處理30min，冷卻至50°C時，加水至固形物濃度為50g/L，調pH 4.8，加入纖維素酶600U/L，木聚糖酶500U/L，葡萄糖苷酶300U/L。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖80g/L，尿素3g/L，酵母粉lg/L，磷酸氫二鉀 lg/L, 121°C滅菌 15min 后，接入 Mortierella isabellina AS 3.3410 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，25°C, 200rpm振蕩培養(yǎng)36h,離心收集濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 10 (干菌體0.2g/L)，在30°C下通空氣培養(yǎng)52h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂6.lg/L。對比例2(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:參照文獻(Kim S, et al.Bioresour Technol, 2005,96:1994-2006),以玉米稻桿為原料,洗凈,干燥,粉碎至2.5mm,按0.073g/g干稻桿添加氫氧化鈣后混勻，于55°C通氣處理4周，脫除80%以上的木質素后，加水至固形物濃度為70g/L，調pH 4.8，加入纖維素酶1050U/L，木聚糖酶700U/L，葡萄糖苷酶300U/L，于50°C條件下酶水解72h，得到水解液中葡萄糖 為32g/L，木糖為14g/L。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自美國典型微生物菌種保藏管理中心)，28°C通氣培養(yǎng)24h,于8000rpm離心5min,得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟⑴所述步驟⑴所述水解液中添加步驟⑵所得菌體至接種密度達到0D600nm = 15 (干菌體0.29g/L)，在30°C下通空氣培養(yǎng)65h，發(fā)酵結束時葡萄糖為1.5g/L，木糖為8g/L。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂6.9g/L。實施例10(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:參照文獻(Kim S, et al.Bioresour Technol, 2005,96:1994-2006),以玉米稻桿為原料,洗凈,干燥,粉碎至2.5mm,按0.073g/g干稻桿添加氫氧化鈣后混勻，于55°C通氣處理4周，脫除80%以上的木質素后，加水至固形物濃度為70g/L，調pH 4.8，加入纖維素酶1050U/L，木聚糖酶700U/L，葡萄糖苷酶300U/L。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自美國典型微生物菌種保藏管理中心)，28°C通氣培養(yǎng)24h,于8000rpm離心5min,得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 15 (干菌體0.29g/L)，在37°C下通空氣培養(yǎng)65h。發(fā)酵65h后培養(yǎng)基中檢測不到葡萄糖，木糖為0.8g/L。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂8.lg/L。比較對比例2和實施例1 0的結果發(fā)現(xiàn)，使用質量相等的玉米秸桿和活力相同的酶制劑，按本發(fā)明的技術方案油脂產量提高了 17%。對比例2將處理過的玉米秸桿在pH 4.8、50°C下酶水解72h，水解液中葡萄糖和木糖濃度分別為32g/L和14g/L，在產油培養(yǎng)階段，木糖利用速度慢，發(fā)酵65h后殘留木糖為8g/L。實施例9由于將水解和發(fā)酵過程耦合，免除了單獨的水解工藝；更重要的是，發(fā)酵65h后培養(yǎng)基中未檢測到葡萄糖，木糖為0.8g/L，說明本發(fā)明的技術方案顯著提高了碳源利用率。因此，本發(fā)明具有提高碳源利用率、油脂產量和生產效率的顯著優(yōu)勢。實施例11(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:參照文獻(Tucker MP, et al.Appl Biochem Biotechnol,2003，105:165-178),以鋸末為原料，洗凈，干燥，粉碎過80目篩，用0.98%的硫酸浸潰4h，然后自然風干至含水量50% (w/w)，硫酸濃度達到1.0%，190°C處理90s后，冷卻至50°C時，加水至固形物濃度為100g/L，調pH 4.5，加入纖維素酶1500U/L，木聚糖酶500U/L。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉20，蛋白胨10，pH 5.5，121。。滅菌20min后,粘紅酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，30°C, 200rpm振蕩培養(yǎng)28h,于8000rpm離心5min,得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟⑴所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 24 (干菌體0.42g/L)，在35°C下通空氣培養(yǎng)72h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂9.lg/L。
實施例12(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:于水中，粉碎玉米30g/L，高溫滅菌，待溫度冷卻至30°C時，加入淀粉酶450U/L，糖化酶300U/L，調pH 6.5。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉20，蛋白胨10，ρΗ 5.5，121。。滅菌20min后，白色隱球酵母Cryptococcus albidus ATCC56298 (購自美國典型微生物菌種保藏管理中心)，22°C, 200rpm振蕩培養(yǎng)28h，離心收集濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 10 (干菌體0.22g/L)，在20°C下通空氣培養(yǎng)48h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂5.4g/L。實施例13(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:于水中，40g/L粉碎的木薯，高溫滅菌，待溫度冷卻至40°C時，加入淀粉酶800U/L，糖化酶400U/L，調pH 7.0。(2)種子制備:菌體增殖階段培養(yǎng)及菌體細胞收集:MSM基本培養(yǎng)基，以糖蜜作為碳源，121°C滅菌15min后,接入不透明紅球菌Rhodococcus opacus Η)630 (德國微生物菌種保藏中心)，30°C通氣培養(yǎng)20h，將培養(yǎng)液于IOOOOrpm離心15min，得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟⑴所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 13 (干菌體0.25g/L)，在45°C下通空氣培養(yǎng)40h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂5.lg/L。實施例14(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:參照文獻(Krishnan C, et al.Biotechnol.Bioeng.2010,107:441-450)，以甘蔗渣為原料，粉碎過20目篩，加水成150% (w/w)甘蔗渣，按2: l(w/w)混合氨水和甘蔗渣，140°C氨膨脹處理30min，冷卻至50°C時，調整至固形物濃度為70g/L，調pH 5.3，加入纖維素酶3500U/L，木聚糖酶300U/L，葡萄糖苷酶2100U/L。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖80，尿素3，酵母粉1，磷酸氫二鉀1，121°C滅菌15min后,接入健強地霉Geotrichum robustum CICC 1256 (購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)，28°C振蕩培養(yǎng)24h，離心收集濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向1.0L步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 45 (干菌體16.2g/L)，在34°C下，通空氣培養(yǎng)，通氣量1.0vvmJt甘蔗渣的量降至2g/L以下，分3次補加120g預處理過的甘蔗渣，到142h發(fā)酵結束；(4)油脂提取:步驟⑶所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂15.7g/L。實施例15(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:參照文獻(Zhang J, et al.Bioresour Technol, 2011,102:4480-4488)，以稻草為 原料，洗凈，干燥，粉碎過60目篩，并用2.5%的硫酸浸潰18h，190°C蒸汽處理3min后，加水至固形物濃度為80g/L，參照文獻(湯琪.重慶交通大學學報，2008，27(1):148-151)的方法對預處理過的稻草進行脫磷處理后，使磷源含量降至碳源總質量的0.1 %以下，冷卻至50°C時，調pH 5.2，加入纖維素酶1000U/L，木聚糖酶2400U/L。
(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Lipomyces starkeyiAS 2.1560 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，30°C通氣培養(yǎng)40h，離心收集濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟⑴所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 15 (干菌體0.27g/L)，在30°C下通空氣培養(yǎng)80h。(4)油脂提取:步驟⑶所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂8.7g/L。實施例16(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:參照文獻(Kim S, et al.Bioresour Technol, 2005,96:1994-2006),以玉米稻桿為原料,洗凈,干燥,粉碎至2.5mm,按0.073g/g干稻桿添加氫氧化鈣后混勻，于55°C通氣處理4周，脫除80%以上的木質素后，加水至固形物濃度為70g/L，參照文獻(李柱，等.天然氣化工.2009，(34):24-26)采用化學沉淀法對原料進行脫氮處理后，使氮源含量降至碳源總質量的0.1 %以下，冷卻至50°C時，調pH 4.8,加入纖維素酶1400U/L，木聚糖酶 1400U/L。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自美國典型微生物菌種保藏管理中心),28°C通氣培養(yǎng)24h，離心收集濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟(I)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 15 (干菌體0.29g/L)，在37°C下通空氣培養(yǎng)72h。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂8.3g/L。

實施例17(I)發(fā)酵培養(yǎng)基制備:參照文獻(Tucker MP, et al.Appl Biochem Biotechnol,2003，105:165-178),以玉米株(包括玉米、玉米芯和玉米秸桿等)為原料，洗凈，干燥，粉碎過40目篩，用0.98%的硫酸浸潰4h，然后自然風干至含水量50% (w/w)，硫酸濃度達到1.0%，190°C處理90s后，冷卻至50°C時，加水至固形物濃度為80g/L，調pH 4.8，加入纖維素酶1600U/L，木聚糖酶800U/L，淀粉酶800U/L，糖化酶400U/L。(2)種子制備:培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 6.0，121。。滅菌15min后,接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自美國典型微生物菌種保藏管理中心)，28°C通氣培養(yǎng)24h,于8000rpm離心5min,得到濕菌體。(3)油脂積累培養(yǎng):向50mL步驟⑴所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加步驟(2)所得菌體至接種密度達到0D600nm = 15 (干菌體0.29g/L)，在35°C下通空氣培養(yǎng)80h。發(fā)酵80h后培養(yǎng)基中檢測不到葡萄糖和木糖。(4)油脂提取:步驟(3)所得發(fā)酵液離心，收集沉淀，在105°C下烘干至恒重，按酸熱-有機溶劑法提取油脂，得到油脂9.0g/L。實施例18參照文獻(LiYH, et al.Enzyme Microb Technol, 2007,41:312-317)的方法，從實施例1獲得菌體中提取微生物油脂。參照文獻(里偉，等.過程工程學報，2007，7(1)，137-140)的方法，取0.3g油脂在酶催化條件下轉酯化制備和純化生物柴油，得到0.28g，生物柴油收率93%，所得生物柴油的辛烷值為58，適合作為柴油的替代品。實施例19參照文獻(LiuB, Zhao Z B.J Chem Technol Biotechnol, 2007,82 (8):775-780)的方法，以實施例6獲得的干物質2.0g為材料，制備生物柴油，得生物柴油1.0g,收率為94%，所得生物柴油的辛烷值 為57，適合作為柴油的替代品。
權利要求
1.一種產油微生物的培養(yǎng)方法,其特征在于:以碳水化合物聚合物為液體培養(yǎng)基的碳源，按每克碳水化合物聚合物添加酶活力為5 IOOU的碳水化合物聚合物的水解酶和干菌體質量為0.05 0.50克的產油微生物活菌體，在溫度20 45°C，pH 3.0 7.5，通空氣條件下，液體懸浮培養(yǎng)。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征還在于:所述碳水化合物聚合物為纖維素、半纖維素、木聚糖、淀粉、主要成份為纖維素和半纖維素的生物質材料、或者主要成份為淀粉的生物質材料、或者它 們中二種以上的混合物。
3.按照權利要求1或2所述的方法，其特征還在于:所述碳水化合物聚合物的水解酶為具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶、生淀粉糖化酶、淀粉酶、糖化酶的一種或它們中二種以上的組合。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征還在于:所述產油微生物液體培養(yǎng)基中還可含有其他微生物培養(yǎng)常用營養(yǎng)物質，其他微生物培養(yǎng)常用營養(yǎng)物質包括質量為碳水化合物聚合物總質量0.1% 20%的氮源、質量為碳水化合物聚合物總質量0.01% 15%的磷源、或質量為碳水化合物聚合物總質量0.01% 5%的硫源或它們中的二種或三種的組合。
5.按照權利要求2所述的方法，其特征還在于:所述主要成份為纖維素和半纖維素的生物質材料為玉米秸桿、麥桿、稻草、甘蔗渣、玉米芯、林業(yè)生產下腳料、松木、云杉中的一種或二種以上組合。
6.按照權利要求2所述的方法，其特征還在于:所述主要成份為淀粉的生物質材料為玉米、稻谷、高粱、小麥、大麥、木薯、甘薯中的一種或二種以上組合。
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述產油微生物為經發(fā)酵培養(yǎng)后菌體油脂含量可超過細胞干重20 %的微生物，包括下述微生物中的一種或二種以上，油脂酵母中的斯達油脂酵母Lipomyces starkeyi ;紅酵母中的圓紅冬抱酵母Rhodosporidiumtoruloides、粘紅酵母 Rhodotorula glutinis 和擲抱酵母 Sporobolomyces roseus ;絲抱酵母中的皮狀絲抱酵母Trichosporon cutaneum和發(fā)酵性絲抱酵母Trichosporonfermentans ;隱球酵母中的白色隱球酵母Cryptococcus albidus和彎曲隱球酵母Cryptococcus curvatus ;霉菌中的伯頓擬內抱霉 Endomycopsis burtoni1、健強地霉 Geotrichum robustum、深黃被抱霉 Mortierella isabellina 和卷枝毛霉 Mucorcircinelloides ;產油細菌中的棒桿菌Croynebacterium、諾卡氏菌Nocardia和紅球菌Rhodococcus ο
8.按照權利要求1所述的方法，其特征還在于:所述產油微生物經培養(yǎng)后得到的菌體積累含有一種或多種長鏈脂肪酸及其衍生物的油脂，并且油脂含量占細胞干重的20%以上；所述產油微生物菌體內積累的油脂，可以作為制備生物柴油的原料。
全文摘要
本發(fā)明公開一種產油微生物培養(yǎng)的新方法，即以碳水化合物聚合物為微生物培養(yǎng)的碳源，添加相應聚合物水解酶和產油微生物種子，在適宜溫度、pH條件下通空氣液體懸浮培養(yǎng)，積累含有長鏈脂肪酸及其衍生物的微生物油脂。微生物油脂可作為制備生物柴油和油脂化工產品的原料。本發(fā)明的方法將產油微生物培養(yǎng)的碳源由傳統(tǒng)的水溶性有機化合物拓展為碳水化合物聚合物，整合了生物質水解和產油發(fā)酵過程，降低了原料成本，簡化了工藝，提高了效率，具有顯著的經濟效益。
文檔編號C12N1/00GK103224884SQ20121002054
公開日2013年7月31日 申請日期2012年1月29日 優(yōu)先權日2012年1月29日
發(fā)明者趙宗保, 龔志偉, 沈宏偉 申請人:中國科學院大連化學物理研究所