專利名稱：前原條和中內(nèi)胚層細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學和細胞生物學領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及包含前原條和/或中內(nèi)胚層細胞的組合物，以及制備、分離和使用這些細胞的方法。
背景技術(shù)：
人多能性干細胞(pluripotent stem cell),如胚胎干細胞(ES)和胚胎生殖細胞(EG)，于1994年首先從無成纖維細胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)物中分離(Bongso et al.，1994)， 1997年從含成纖維細胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)物中分離(Hogan, 1997)。隨后Thomson、Reubinoff 和Shamblott建立了采用有絲分裂失活的小鼠飼養(yǎng)層連續(xù)培養(yǎng)人ES和EG細胞的方法 (Reubinoff et al. , 2000 ；Shamblott et al. , 1998 ；Thomson et al. ,1998)。人ES和EG細胞(hESC)為研究人類早期發(fā)育和為治療性干預(yù)一些疾病狀態(tài)(如糖尿病和帕金森氏癥)提供了極難得的機會。例如，在采用細胞療法治療糖尿病的過程中，使用衍生自hSEC的產(chǎn)生胰島素的β細胞會比目前利用來自供者胰腺的細胞治療糖尿病有很大進步。但目前還不知道如何從hSEC得到產(chǎn)生胰島素的β細胞。因此，目前利用來自供者胰腺的胰島細胞治療糖尿病的細胞療法受限于缺乏移植所需的高質(zhì)量胰島細胞。對單一 I型糖尿病人的細胞治療需要移植大約8 X IO8胰島細胞(Shapiro et al. ,2000 ；Shapiro et al.，2001a ;Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰島細胞至少需要兩個健康供者的器官提供。而人胚胎干細胞為開發(fā)用于人類細胞治療的大量的高質(zhì)量分化細胞提供了起始材料的來源。多能性和能夠維持hSEC細胞較長時間培養(yǎng)這兩個性質(zhì)使其特別適合用于細胞治療。多能性是指hESC能夠分化為所有3種主要胚層(內(nèi)胚層，中胚層和外胚層)的衍生物，進而在除胚胎外組織(如胎盤)和生殖細胞外還形成成熟器官的所有體細胞類型的能力。盡管多能性賦予了 hSEC特殊的用途，但這個性質(zhì)也給這些細胞及其衍生物的研究和控制帶來挑戰(zhàn)。由于在分化hSEC培養(yǎng)基中會產(chǎn)生大量細胞類型，所以大部分細胞類型產(chǎn)生效率很低。而且，成功評價任一指定細胞類型的產(chǎn)生關(guān)鍵取決于定義合適的標志物。高效、定向的分化對hESC的治療應(yīng)用非常重要。由此，除完成hESC的高效定向分化外，鑒定可以用于鑒定和/或分離特定細胞的標志物是有利的，該特定細胞處于其從hESC分化出來的最早期階段。此外，還有利的是鑒定促進這些源自hESC的早期前體細胞向可用于細胞治療的細胞類型分化的因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實施方案涉及包含人細胞的細胞培養(yǎng)物。這些細胞培養(yǎng)物中，至少約 5%的人細胞是前原條細胞(preprimitive streak),其中該前原條細胞是可以分化為中內(nèi)胚層細胞的專能細胞(multipotent cell)。其它實施方案中，培養(yǎng)物中至少約10%到至少約90 %的人細胞是前原條細胞。本文所述的某些實施方案中，人飼養(yǎng)細胞也存在于細胞培養(yǎng)物中。這些實施方案中，除飼養(yǎng)細胞外，至少約5%到至少約75%的人細胞是前原條細胞。一些實施方案中，該前原條細胞表達標志物，例如FGF8和/或核定位的β-連接素(β-catenin)。某些實施方案中，這些標志物中的一種或兩種的表達高于brachyury、 FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7和/或SOXl的表達。本文所述的其它實施方案中，該細胞培養(yǎng)物基本上不含有內(nèi)臟內(nèi)胚層細胞、體壁內(nèi)胚層細胞、原始內(nèi)胚層細胞、定形內(nèi)胚層細胞 (definitive endodermal cell)、外胚層細胞和/或中胚層細胞。關(guān)于本發(fā)明的某些實施方案，前原條細胞培養(yǎng)物包含多能性人細胞，如人胚胎干細胞(hESC)。這些實施方案中，細胞培養(yǎng)物中對應(yīng)每I個hESC存在至少約2個到至少約 10個前原條細胞。一些實施方案中，該hESC源自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團(ICM)和胚胎生殖嵴。一些實施方案中，含有人前原條細胞的細胞培養(yǎng)物包含的培養(yǎng)基含有少于約2% (v/v) 到少于約O. 2% (v/v)的血清。優(yōu)選實施方案中，該細胞培養(yǎng)物包含不含血清或血清替代物的培養(yǎng)基。其它實施方案中，含有人前原條細胞的細胞培養(yǎng)物包含TGFii超家族的Nodal/ 活化素(Activin)亞組的生長因子。優(yōu)選實施方案中，該生長因子是活化素A。本文所述的其它實施方案涉及包含中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物，其中該中內(nèi)胚層細胞是可以分化為中胚層或定形內(nèi)胚層細胞的專能細胞。這些實施方案中，該細胞培養(yǎng)物包含人細胞，其中至少約5%的人細胞是中內(nèi)胚層細胞。其它實施方案中，培養(yǎng)物中至少約 10%到至少約90%的人細胞是中內(nèi)胚層細胞。本文所述的某些實施方案中，人飼養(yǎng)細胞也存在于細胞培養(yǎng)物中。這些實施方案中，至少約5%到至少約75%的除飼養(yǎng)細胞外的人細胞是中內(nèi)胚層細胞。一些實施方案中，中內(nèi)胚層細胞表達標志物，如brachyury、FGF4、和 /或SNAI1。某些實施方案中，這些標志物中一種或多種的表達高于0CT4、S0X17、CXCR4、 F0XA2、S0X7和/或SOXl的表達。本文所述的其它實施方案中，該細胞培養(yǎng)物基本上不含有內(nèi)臟內(nèi)胚層細胞、體壁內(nèi)胚層細胞、原始內(nèi)胚層細胞、定形內(nèi)胚層細胞、外胚層細胞和/或中胚層細胞。關(guān)于本發(fā)明的某些實施方案，中內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物包含多能性人細胞，如人胚胎干細胞(hESC)。這些實施方案中，細胞培養(yǎng)物中對應(yīng)每I個hESC存在至少約2個到至少約 10個中內(nèi)胚層細胞。一些實施方案中，該hESC源自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團(ICM)和胚胎生殖嵴。一些實施方案中，含有人中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物包含的培養(yǎng)基含有少于約2% (v/v)到少于約O. 2% (v/v)的血清。優(yōu)選實施方案中，該細胞培養(yǎng)物包含不含血清或血清替代物的培養(yǎng)基。其它實施方案中，含有人中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物包含TGFii超家族的Nodal/活化素亞組的生長因子。優(yōu)選實施方案中，該生長因子是活化素A。本文所述其它實施方案涉及包含特定細胞的細胞群，該特定細胞中至少約90%是人前原條細胞。這些實施方案中，該前原條細胞是可以分化為中內(nèi)胚層細胞的專能細胞。 其它實施方案中，該細胞群中至少約95%到至少約98%的人細胞是前原條細胞。一些實施方案中，前原條細胞表達標志物，如FGF8和/或核定位的β-連接素。某些實施方案中，這兩個標志物中一種或兩種的表達高于brachyury、FGF4、SNAIU S0X17、F0XA2、S0X7和/或 SOXl的表達。本文所述的其它實施方案中，該細胞群基本上不含有內(nèi)臟內(nèi)胚層細胞、體壁內(nèi)胚層細胞、原始內(nèi)胚層細胞、定形內(nèi)胚層細胞、外胚層細胞和/或中胚層細胞。本文所述其它實施方案涉及包含特定細胞的細胞群，該特定細胞中至少約90%是人中內(nèi)胚層細胞。這些實施方案中，該中內(nèi)胚層細胞是可以分化為中胚層細胞和/或定形內(nèi)胚層細胞的專能細胞。其它實施方案中，該細胞群中至少約95%到至少約98%的人細胞是中內(nèi)胚層細胞。一些實施方案中，中內(nèi)胚層細胞表達標志物，如brachyury、FGF4、和/或 SNAI1。某些實施方案中，這些標志物中一種或多種的表達高于0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、 S0X7和/或SOXl的表達。本文所述的其它實施方案中，該細胞培養(yǎng)物基本上不含有內(nèi)臟內(nèi)胚層細胞、體壁內(nèi)胚層細胞、原始內(nèi)胚層細胞、定形內(nèi)胚層細胞、外胚層細胞和/或中胚層細胞。本文所述其它實施方案涉及生產(chǎn)前原條細胞的方法。這些方法中，獲得包含諸如 hESC的多能性人細胞的細胞群。該細胞群中的多能性人細胞在包含少于約2%血清和至少一種TGFii超家族的生長因子的培養(yǎng)基中分化，其中培養(yǎng)基中存在的生長因子的量足以促進至少一部分所述多能性細胞向前原條細胞分化，該前原條細胞是專能的并且可以分化為中內(nèi)胚層細胞。一些實施方案包括其它步驟，其包含給予足夠的時間使前原條細胞形成，其中通過檢測所述細胞群中前原條細胞的存在來確定所述足夠使前原條細胞形成的時長。一些實施方案中，該足夠時長是至少約6小時。其它實施方案中，檢測細胞群中前原條細胞的存在包括檢測細胞群的細胞中至少一種選自FGF8和核定位的β-連接素的標志物和至少一種選自brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、S0X7和SOXl的標志物的表達，其中所述前原條細胞中，選自FGF8和核定位的-β連接素中的標志物的表達高于選自brachyury、 FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7和SOXl中的標志物的表達。這些實施方案中，標志物檢測可以通過定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Q-PCR)、免疫細胞化學或其它類似方法。關(guān)于本文所述的某些方法，培養(yǎng)物中至少約5%到至少約90%的人細胞分化為前原條細胞。本文所述方法的一些實施方案中，培養(yǎng)基中存在的生長因子是TGFii超家族的 Nodal/活化素亞組的生長因子。優(yōu)選實施方案中，該生長因子是活化素A。其它優(yōu)選的實施方案中，該生長因子在培養(yǎng)基中存在的濃度范圍為從至少約10ng/ml到至少約IOOOng/ ml。某些實施方案中，約6小時、12小時或18小時后撤除該生長因子。其它實施方案中，培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)到少于約O. 2% (v/v)的血清。其它實施方案中，培養(yǎng)基是低血清RPMI。其它實施方案中，細胞群在缺乏血清或缺乏血清替代物下分化。本文所述其它方法是生產(chǎn)中內(nèi)胚層細胞的方法。這些方法中，獲得包含諸如hESC 的多能性人細胞的細胞群。該細胞群中的多能性人細胞在包含少于約2%血清和至少一個 TGF^超家族的生長因子的培養(yǎng)基中分化，其中培養(yǎng)基中存在的生長因子的量足以促進至少一部分所述多能性細胞向中內(nèi)胚層細胞分化，該中內(nèi)胚層細胞是專能的并且可以分化為中胚層細胞和/或定形內(nèi)胚層細胞。一些實施方案包括其它步驟，其包含給予足夠的時間使中內(nèi)胚層細胞形成，其中通過檢測所述細胞群中中內(nèi)胚層細胞的存在來確定所述使中內(nèi)胚層細胞形成的足夠時長。一些實施方案中，該足夠時長是至少約24小時。其它實施方案中，檢測細胞群中中內(nèi)胚層細胞的存在包含檢測細胞群的細胞中至少一種選自brachyury、 FGF4 和 / 或 SNAIl 的標志物和至少一種選自 0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7 和 / 或 SOXl 的標志物的表達,其中所述中內(nèi)胚層細胞中,選自brachyury、FGF4和/或SNAIl中的標志物的表達高于選自0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl中的標志物的表達。這些實施方案中，標志物檢測可以通過定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Q-PCR)、免疫細胞化學或其它類似方法。
關(guān)于本文所述的某些方法，培養(yǎng)物中至少約5%到至少約90%的人細胞分化為中內(nèi)胚層細胞。本文所述方法的一些實施方案中，培養(yǎng)基中存在的生長因子是TGFii超家族的Nodal/活化素亞組的生長因子。優(yōu)選實施方案中，該生長因子是活化素A。其它優(yōu)選的實施方案中，該生長因子在培養(yǎng)基中存在的濃度范圍為從至少約10ng/ml到至少約IOOOng/ ml。某些實施方案中，約24小時、36小時或48小時后撤除該生長因子。其它實施方案中， 培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)到少于約O. 2% (v/v)的血清。其它實施方案中，培養(yǎng)基是低血清RPMI。其它實施方案中，細胞群在缺乏血清或血清替代物下分化。本文所述的其它實施方案涉及產(chǎn)生富集前原條細胞的細胞群的方法。這些方法包括步驟(a)獲得諸如hESC的多能性細胞群，其中該多能細胞群中至少一個細胞包含置于 FGF8啟動子控制下的編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸序列或其生物活性片段的拷貝，(b) 分化該多能性細胞以便生產(chǎn)前原條細胞，該前原條細胞為可以分化為中內(nèi)胚層細胞的專能細胞，以及(c)從不表達GFP的細胞中分離前原條細胞。一些實施方案中，該細胞群包含至少約95%到至少約98%的前原條細胞。一些實施方案中,本文所述方法的分化步驟包含向多能細胞群提供至少一種TGFii超家族的生長因子，如活化素A?；罨谹的優(yōu)選濃度范圍從至少約50ng/ml到至少約500ng/ml。其它實施方案中，該細胞群在包含少于約1% (v/v) 到少于約0.1% (v/v)的血清的培養(yǎng)基中分化。其它實施方案中，該培養(yǎng)基是低血清RPMI。 其它實施方案中，該細胞群在缺乏血清或血清替代物下分化。本文所述其它實施方案涉及生產(chǎn)富集中內(nèi)胚層細胞的細胞群的方法。這些方法包括步驟(a)獲得諸如hESC的多能性細胞群，其中該多能細胞群中至少一個細胞包含置于 brachyury、FGF4和/或SNAIl啟動子控制下的編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸序列的拷貝或生物活性片段，(b)分化該多能細胞以便生產(chǎn)中內(nèi)胚層細胞，該中內(nèi)胚層細胞為可以分化為中胚層細胞和/或定形內(nèi)胚層細胞的專能細胞，以及(c)從不表達GFP的細胞中分離中內(nèi)胚層細胞。一些實施方案中，該細胞群包含至少約95%到至少約98%的中內(nèi)胚層細胞。 一些實施方案中，本文所述方法的分化步驟包含向多能細胞群提供至少一個TGFii超家族的生長因子,如活化素A?；罨谹的優(yōu)選濃度范圍從至少約50ng/ml到至少約500ng/ml。 其它實施方案中，該細胞群在包含少于約I % (v/v)到少于約0.1% (v/v)的血清的培養(yǎng)基中分化。其它實施方案中，該培養(yǎng)基是低血清RPMI。其它實施方案中，該細胞群在缺乏血清或血清替代物下分化。本發(fā)明的一些實施方案是鑒定分化因子的篩選方法，該分化因子能夠促進包含人細胞的細胞群中的前原條細胞的分化。這些方法包括步驟(a)獲得包含人前原條細胞的細胞群，(b)向該細胞群提供候選分化因子，(c)確定細胞群中標志物在第一時間點的表達， 確定該細胞群中相同標志物在第二時間點的表達，其中第二時間點在第一時間點之后，并且第二時間點在向該細胞群提供候選分化因子之后，(d)以及確定與該標志物在細胞群中第一時間點的表達相比，其在細胞群中第二時間點的表達是否增加或減少，其中標志物在細胞群中的表達的增加或減少表明該候選分化因子能夠促進前原條細胞的分化。某些實施方案中，第一時間點在向細胞群提供候選分化因子之前或大致同時。其它實施方案中，第一時間點在向細胞群提供候選分化因子之后。本文所述篩選方法的一些實施方案中，該人前原條細胞響應(yīng)候選分化因子分化為特定細胞，如中內(nèi)胚層細胞、中胚層細胞和/或定形內(nèi)胚層細胞。一些實施方案中，中內(nèi)胚層由諸如brachyury、FGF4和/或SNAIl的標志物的表達表明。其它實施方案中，中胚層由諸如FOXFl、FLKl、BMP4、MOXl和SDFl的標志物的表達表明。其它實施方案中，定形內(nèi)胚層由諸如CXCR4和/或S0X17的標志物的表達表明。關(guān)于本文所述篩選方法，某些實施方案涉及提供候選分化因子，如至少一種TGF β 超家族的生長因子，如活化素Α。其它實施方案中，該候選分化因子是小分子或多肽。其它實施方案中，該候選分化因子不是TGFii超家族的因子。其它實施方案中，該候選分化因子是未知能造成前原條細胞分化的因子。本文所述的其它實施方案是鑒定能夠促進包含人細胞的細胞群中中內(nèi)胚層細胞分化的分化因子的篩選方法。此類方法包含步驟(a)獲得包含人中內(nèi)胚層細胞的細胞群， (b)向該細胞群提供候選分化因子，(C)確定該細胞群中標志物在第一時間點的表達，確定該細胞群中相同標志物在第二時間點的表達，其中第二時間點在第一時間點之后，并且第二時間點在向該群提供候選分化因子之后，(d)以及確定與該標志物在細胞群中第一時間點的表達相比，其在細胞群中第二時間點的表達是否增加或減少，其中標志物在細胞群中的表達的增加或減少表明該候選分化因子能夠促進中內(nèi)胚層細胞的分化。某些實施方案中，第一時間點在向細胞群提供候選分化因子之前或大致同時。其它實施方案中，第一時間點在向細胞群提供候選分化因子之后。本文所述篩選方法的一些實施方案中，該人中內(nèi)胚層細胞響應(yīng)候選分化因子分化為特定細胞，如中胚層細胞和/或定形內(nèi)胚層細胞。一些實施方案中，中胚層由諸如FOXFl、FLKl、BMP4、MOXl和SDFl的標志物的表達表明。其它實施方案中，定形內(nèi)胚層由諸如CXCR4和/或S0X17的標志物的表達表明。關(guān)于本文所述篩選方法，某些實施方案涉及提供候選分化因子，如至少一種TGF β 超家族的生長因子，如活化素Α。其它實施方案中，該候選分化因子是小分子或多肽。其它實施方案中，該候選分化因子不是TGFii超家族的因子。其它實施方案中，該候選分化因子是未知能造成中內(nèi)胚層細胞分化的因子。其它實施方案涉及在體外提高人胚胎干細胞(hESC)中FGF8基因產(chǎn)物的表達的方法。該方法包括在包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得hESC，并且使該hESC接觸特定量的分化因子，該特定量足以增加FGF8基因產(chǎn)物的表達。一些實施方案中，該分化因子是至少一種TGFf3超家族的生長因子，如活化素A。一些實施方案中，該培養(yǎng)基不包含血清替代物。其它實施方案涉及在體外提高人胚胎干細胞(hESC)中選自brachyury、FGF4和 SNAIl的基因產(chǎn)物的表達的方法。所述方法包括在包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得hESC，并且使該hESC接觸特定量的分化因子，該特定量足以增加選自brachyury、FGF4 和SNAIl的基因產(chǎn)物的表達。一些實施方案中，該分化因子是至少一種TGFii超家族的生長因子，如活化素A。一些實施方案中，該培養(yǎng)基不包含血清替代物。本文所述的一些實施方案涉及包含人胚胎干細胞(hESC)和含有少于約2% (v/v) 血清的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物，其中該hESC從特定參考時間點開始分化，與該hESC的基線 FGF8 mRNA表達相比，距所述參考時間點約6小時時FGF8 mRNA的表達顯著上調(diào)。一些實施方案中，距該參考時間點約17小時β-連接素多肽的表達開始向細胞核定位。其它實施方案中，距該參考時間點約24小時brachyury、FGF4和/或SNAIl mRNA的表達顯著上調(diào)。 其它實施方案中，距該參考時間點約12小時時E-鈣粘著素(E-cadherin)mRNA的表達開始下調(diào)。此外，一些實施方案中，距該參考時間點約48小時時S0X17 mRNA的表達顯著上調(diào)和/或距該參考時間點約96小時時F0XA2 mRNA的表達顯著上調(diào)。本文所述細胞培養(yǎng)物的某些實施方案中，該培養(yǎng)基包含少于約I % (v/v)到少于約O. 2% (v/v)的血清。其它實施方案中，該培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。其它實施方案中，該培養(yǎng)基不包含血清替代物。本文所述的其它實施方案涉及包含人胚胎干細胞、TGF^超家族的分化因子和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物，其中第一套標志物基因在第二套和/或第三套標志物基因的上調(diào)或峰值表達之前或大致同時上調(diào)或下調(diào)。其它實施方案涉及分化細胞培養(yǎng)物中細胞的方法，通過使包含人胚胎干細胞的細胞培養(yǎng)物與包含少于約2%血清的培養(yǎng)基接觸、向該hESC提供TGF0超家族的分化因子、以及允許hESC分化的發(fā)生。一些實施方案中，該方法產(chǎn)生特定細胞，該細胞中第一套標志物基因在第二套和/或第三套標志物基因的上調(diào)或峰值表達之前或大約同時上調(diào)或下調(diào)。一些實施方案中，該培養(yǎng)基不包含血清或血清替代物。一些權(quán)限中，術(shù)語“包含”可能不具有任何通常所接受的定義。此處使用的術(shù)語“包含”是開放式的，可以包括任何其他元素?？紤]到這一點，本發(fā)明的其他實施方案參考以下編號的段落進行描述I.包含人細胞的細胞培養(yǎng)物,其中至少約5%的所述人細胞是前原條細胞,所述前原條細胞是能分化為中內(nèi)胚層細胞的專能細胞。2.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中至少約10%的所述人細胞是前原條細胞。3.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中至少約20%的所述人細胞是前原條細胞。4.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中至少約30%的所述人細胞是前原條細胞。5.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中至少約40%的所述人細胞是前原條細胞。6.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中至少約50%的所述人細胞是前原條細胞。7.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中至少約60%的所述人細胞是前原條細胞。8.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中至少約70%的所述人細胞是前原條細胞。9.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中至少約80%的所述人細胞是前原條細胞。10.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中至少約90%的所述人細胞是前原條細胞。11.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約 5 %的除所述人飼養(yǎng)細胞外的人細胞是前原條細胞。12.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約 25%的除所述人飼養(yǎng)細胞外的人細胞是前原條細胞。13.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約 50 %的除所述人飼養(yǎng)細胞外的人細胞是前原條細胞。14.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約 75 %的除所述人飼養(yǎng)細胞外的人細胞是前原條細胞。15.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細胞表達選自FGF8和核定位的β -連接素的標志物。16.段落15的細胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細胞中選自FGF8和核定位的β -連接素的標志物的表達高于選自brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、S0X7和SOXl的標志物的表達。17.段落15的細胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細胞不顯著表達選自brachyury、FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的標志物。18.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細胞表達FGF8和核定位的β -連接素。19.段落18的細胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細胞中FGF8和細胞核定位的β連接素的表達高于 brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的表達。20.段落18的細胞培養(yǎng)物，其中所述前原條細胞不顯著表達brachyury、FGF4、 SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl。21.段落I的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物基本上不含有選自內(nèi)臟內(nèi)胚層細胞、體壁內(nèi)胚層細胞、原始內(nèi)胚層細胞、定形內(nèi)胚層細胞、外胚層細胞和中胚層細胞的細胞。22.段落I的細胞培養(yǎng)物，還包含人胚胎干細胞(hESC)。23.段落22的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物中對應(yīng)約每一個hESC存在至少約 2個前原條細胞。24.段落22的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物中對應(yīng)約每一個hESC存在至少約 10個前原條細胞。25.段落22的細胞培養(yǎng)物，其中所述hESC源自選自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團(ICM) 和胚胎生殖嵴的組織。26.段落I的細胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。27.段落I的細胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基。28.段落I的細胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約O. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基。29.段落I的細胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約O. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。30.段落I的細胞培養(yǎng)物，還包含不含血清或血清替代物的培養(yǎng)基。31.段落I的細胞培養(yǎng)物，還包含TGFP超家族的Nodal/活化素亞組的生長因子。32.段落31的細胞培養(yǎng)物，其中所述TGF0超家族的Nodal/活化素亞組的生長因子包括活化素A。33.包含人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中至少約5%的所述人細胞是中內(nèi)胚層細胞，所述中內(nèi)胚層細胞是能分化為中胚層細胞或定形內(nèi)胚層細胞的專能細胞。34.段落
35.段落
36.段落
37.段落
38.段落
39.段落
40.段落
41.段落
42.段落
43.段落
5%的除所述人飼養(yǎng)細胞外的人細胞是中內(nèi)胚層細胞。44.段落33的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約 25%的除所述人飼養(yǎng)細胞外的人細胞是中內(nèi)胚層細胞。45.段落33的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約50%的除所述人飼養(yǎng)細胞外的人細胞是中內(nèi)胚層細胞。46.段落33的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約 75%的除所述人飼養(yǎng)細胞外的人細胞是中內(nèi)胚層細胞。47.段落33的細胞培養(yǎng)物,其中所述中內(nèi)胚層細胞表達選自brachyury、FGF4和 SNAIl的標志物。48.段落47的細胞培養(yǎng)物,其中所述中內(nèi)胚層細胞中選自brachyury、FGF4和 SNAIl的標志物的表達高于選自0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和SOXl的標志物的表達。49.段落47的細胞培養(yǎng)物，其中所述中內(nèi)胚層細胞不顯著表達選自0CT4、S0X17、 CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的標志物。50.段落33的細胞培養(yǎng)物，其中所述中內(nèi)胚層細胞表達brachyury、FGF4和 SNAII。51.段落51的細胞培養(yǎng)物，其中所述中內(nèi)胚層細胞中brachyury、FGF4和SNAIl的表達高于 0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的表達。52.段落51的細胞培養(yǎng)物，其中所述中內(nèi)胚層細胞不顯著表達0CT4、S0X17、 CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl。53.段落33的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物基本上不含選自內(nèi)臟內(nèi)胚層細胞、體壁內(nèi)胚層細胞、原始內(nèi)胚層細胞、定形內(nèi)胚層細胞、外胚層細胞和中胚層細胞的細胞。54.段落33的細胞培養(yǎng)物，還包含人胚胎干細胞(hESC)。55.段落54的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物中對應(yīng)約每一個hESC存在至少約 2個中內(nèi)胚層細胞。56.段落54的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物中對應(yīng)約每一個hESC存在至少約 10個中內(nèi)胚層細胞。57.段落54的細胞培養(yǎng)物，其中所述hESC源自選自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團(ICM) 和胚胎生殖嵴的組織。58.段落33的細胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。59.段落33的細胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基。60.段落33的細胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約O. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基。61.段落33的細胞培養(yǎng)物，還包含含有少于約O. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。62.段落33的細胞培養(yǎng)物，還包含不含血清或血清替代物的培養(yǎng)基。63.段落33的細胞培養(yǎng)物，還包含TGF β超家族的Nodal/活化素亞組的生長因子。64.段落63的細胞培養(yǎng)物，其中所述TGFP超家族的Nodal/活化素亞組的生長因子包含活化素A。65.包含細胞的細胞群,其中至少約90%的所述細胞是人前原條細胞,所述前原條細胞是能分化為中內(nèi)胚層細胞的專能細胞。66.段落65的細胞群，其中至少約95%的所述細胞是人前原條細胞。67.段落65的細胞群，其中至少約98%的所述細胞是人前原條細胞。68.段落65的細胞群，其中所述人前原條細胞表達選自FGF8和核定位的β -連接素的標志物。
69.段落68的細胞群，其中所述人前原條細胞中選自FGF8和核定位的β -連接素的標志物的表達高于選自brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、S0X7和SOXl的標志物的表達。70.段落68的細胞群,其中所述人前原條細胞不顯著表達選自brachyury、FGF4、 SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的標志物。71.段落65的細胞群，其中所述人前原條細胞表達FGF8和核定位的β-連接素。72.段落71的細胞群，其中所述人前原條細胞中FGF8和核定位的β-連接素的表達高于 brachyury、FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的表達。73.段落71的細胞群，其中所述人前原條細胞不顯著表達brachyury、FGF4、 SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7 和 SOXl。74.包含細胞的細胞群，其中至少約90%的所述細胞是人中內(nèi)胚層細胞，所述中內(nèi)胚層細胞是能分化為中胚層細胞或定形內(nèi)胚層細胞的專能細胞。75.段落74的細胞群，其中至少約95%的所述細胞是人中內(nèi)胚層細胞。76.段落74的細胞群，其中至少約98%的所述細胞是人中內(nèi)胚層細胞。77.段落74的細胞群,其中所述人中內(nèi)胚層細胞表達選自brachyury、FGF4和 SNAIl的標志物。78.段落77的細胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細胞中選自1^1(*71^7、？6 4和5嫩11 的標志物的表達高于選自0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和SOXl的標志物的表達。79.段落77的細胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細胞不顯著表達選自0CT4、S0X17、 CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的標志物。80.段落74的細胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細胞表達brachyury、FGF4和SNAII。81.段落77的細胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細胞中brachyury、FGF4和SNAIl的表達高于 0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7 和 SOXl 的表達。82.段落77的細胞群，其中所述人中內(nèi)胚層細胞不顯著表達0CT4、S0X17、CXCR4、 F0XA2、S0X7 和 SOXl。83.產(chǎn)生前原條細胞的方法，所述方法包括獲得含有多能性人細胞的細胞群和在含有少于約2%的血清和至少一種TGFii超家族的生長因子的培養(yǎng)基中分化所述多能性人細胞的步驟，其中所述生長因子以足以促進至少一部分所述多能性細胞分化為前原條細胞的量存在于所述培養(yǎng)基中，所述前原條細胞是能分化為中內(nèi)胚層細胞的專能細胞。84.段落83的方法，還包括給予足夠時間讓前原條細胞形成，其中所述讓前原條細胞形成的足夠時間通過檢測前原條細胞在所述細胞群中的存在來確定。85.段落84的方法，其中足夠時間為最少約6小時。86.段落84的方法，其中檢測前原條細胞在所述細胞群中的存在包括檢測所述細胞群細胞中至少一種選自FGF8和核定位的β-連接素的標志物和至少一種選自 brachyury、FGF4、SNAII、F0XA2、S0X7和SOXl的標志物的表達，其中所述前原條細胞中選自FGF8和核定位的β -連接素的標志物的表達高于選自brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、 F0XA2、S0X7和SOXl的標志物的表達。87.段落86的方法，其中通過定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Q-PCR)確定至少一種所述標志物的表達。
88.段落86的方法，其中通過免疫細胞化學確定至少一種所述標志物的表達。89.段落83的方法，其中至少約5%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。90.段落83的方法，其中至少約10%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。91.段落83的方法，其中至少約20%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。92.段落83的方法，其中至少約30%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。93.段落83的方法，其中至少約40%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。94.段落83的方法，其中至少約50%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。95.段落83的方法，其中至少約60%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。96.段落83的方法，其中至少約70%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。97.段落83的方法，其中至少約80%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。98.段落83的方法，其中至少約90%的所述多能性人細胞分化為前原條細胞。99.段落83的方法，其中所述至少一種生長因子屬于TGFP超家族的Nodal/活化 素亞組。100.段落99的方法，其中所述至少一種屬于TGFP超家族的Nodal/活化素亞組 的生長因子包含活化素A。101.段落83的方法，其中所述至少一種生長因子以至少約10ng/ml的濃度提供。102.段落83的方法，其中所述至少一種生長因子以至少約100ng/ml的濃度提供。103.段落83的方法，其中所述至少一種生長因子以至少約500ng/ml的濃度提供。104.段落83的方法，其中所述至少一種生長因子以至少約1000ng/ml的濃度提供。105.段落83的方法，其中在約6小時后撤除所述至少一種生長因子。106.段落83的方法，其中在約12小時后撤除所述至少一種生長因子。107.段落83的方法，其中在約18小時后撤除所述至少一種生長因子。108.段落83的方法，其中所述細胞群在含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中分 化。109.段落83的方法，其中所述細胞群在含有少于約0. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。110.段落83的方法，其中所述細胞群在含有少于約0. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。111.段落83的方法，其中所述細胞群在含有少于約0. 1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。112.段落83的方法，其中所述細胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分化。113.段落83的方法，其中所述細胞群在特定血清含量的培養(yǎng)基中分化，所述培養(yǎng) 基在加入所述至少一種生長因子后的約第一天含有約0% (v/v)血清，在加入所述至少一 種生長因子后的約第二天含有約0.2% (v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一種生長 因子后的約第三天含有約2% (v/v)或更少血清。114.段落83的方法，其中所述細胞群在低血清RPMI培養(yǎng)基中分化。115.段落83的方法，其中所述多能性人細胞包含人胚胎干細胞(hESC)。116.段落115的方法，其中所述人胚胎干細胞源自選自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團(ICM)和胚胎生殖嵴的組織。117.通過段落83的方法制備的前原條細胞。118.制備中內(nèi)胚層細胞的方法，所述方法包括獲得含有多能性人細胞的細胞群和在含有少于約2%的血清和至少一種TGFii超家族的生長因子的培養(yǎng)基中分化所述多能性人細胞的步驟，其中所述生長因子以足以促進至少一部分所述多能性細胞分化為中內(nèi)胚層細胞的量存在于所述培養(yǎng)基中，所述中內(nèi)胚層細胞是能分化為中內(nèi)胚層細胞的專能細胞。119.段落118的方法，還包括給予足夠時間讓中內(nèi)胚層細胞形成的步驟，其中所述讓中內(nèi)胚層細胞形成的足夠時間通過檢測中內(nèi)胚層細胞在所述細胞群中的存在來確定。120.段落119的方法，其中足夠時間為最少約24小時。121.段落118的方法，其中檢測中內(nèi)胚層細胞在所述細胞群中的存在包括檢測所述細胞群中至少一種選自brachyury、FGF4和SNAII的標志物和至少一種選自0CT4、S0X17、 CXCR4、F0XA2、S0X7和SOXl的標志物的表達，其中在所述中內(nèi)胚層細胞中選自brachyury、 FGF4和SNAIl的標志物的表達高于選自0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和SOXl的標志物的表達。122.段落121的方法，其中通過定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Q-PCR)確定至少一種所述標志物的表達。
123.段落121的方法，其中通過免疫細胞化學確定至少一種所述標志物的表達。
124.段落118的方法，其中至少約5%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細胞。
125.段落118的方法，其中至少約10%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細
126.段落118的方法，其中至少約20%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細
127.段落118的方法，其中至少約30%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細
128.段落118的方法，其中至少約40%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細
129.段落118的方法，其中至少約50%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細
130.段落118的方法，其中至少約60%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細
131.段落118的方法，其中至少約70%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細
132.段落118的方法，其中至少約80%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細
133.段落118的方法，其中至少約90%的所述多能性人細胞分化為中內(nèi)胚層細的生長因子包含活化素A。
136.段落118的方法，其中所述至少一種生長因子以至少約10ng/ml的濃度提供。
的方法，其中所述至少一種生長因子以至少約100ng/ml的濃度提
的方法，其中所述至少一種生長因子以至少約500ng/ml的濃度提
的方法，其中所述至少一種生長因子以至少約1000ng/ml的濃度提
的方法，其中在約24小時后撤除所述至少一種生長因子。
的方法，其中在約36小時后撤除所述至少一種生長因子。
的方法，其中在約48小時后撤除所述至少一種生長因子。
的方法，其中所述細胞群在含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中
的方法，其中所述細胞群在含有少于約O. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基
的方法，其中所述細胞群在含有少于約O. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基
的方法，其中所述細胞群在含有少于約O. 1% (v/v)血清的培養(yǎng)基
的方法，其中所述細胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分供。供。供。分化。
中分化^
中分化^
中分化^化。148.段落118的方法，其中所述細胞群在特定血清含量的培養(yǎng)基中分化，所述培養(yǎng)基在加入所述至少一種生長因子后的約第一天含有約0% (v/v)血清，在加入所述至少一種生長因子后的約第二天含有約0.2% (v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一種生長因子后的約第三天含有約2% (v/v)或更少血清。149.段落118的方法，其中所述細胞群在低血清RPMI培養(yǎng)基中分化。150.段落118的方法，其中所述細胞群包含人胚胎干細胞(hESC)。151.段落150的方法，其中所述人胚胎干細胞源自選自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團 (ICM)和胚胎生殖嵴的組織。152.通過段落118方法制備的中內(nèi)胚層細胞。153.產(chǎn)生富集前原條細胞的細胞群方法，所述方法包括以下步驟獲得多能性細胞的群，其中所述多能性細胞群的至少一個細胞含有至少一個拷貝的受FGF8啟動子控制的核酸，所述核酸含有編碼綠色熒光蛋白(GFP)或其生物活性片段的序列；分化所述多能性細胞以制備前原條細胞，所述前原條細胞是能分化為中內(nèi)胚層細胞的專能細胞；以及從不表達GFP的細胞中分離所述前原條細胞。154.段落153的方法，其中所述富集細胞群包含至少約95%的前原條細胞。155.段落153的方法，其中所述富集細胞群包含至少約98%的前原條細胞。156.段落153的方法，其中所述分化步驟包括以特定量向所述多能性細胞群提供至少一種來自TGFii超家族的生長因子，該特定量足以促進所述多能性細胞向前原條細胞
137.段落118138.段落118139.段落118140.段落118141.段落118142.段落118143.段落118144.段落118145.段落118146.段落118147.段落118148.段落118分化。157.段落156的方法，其中所述至少一種TGFP超家族的生長因子是活化素A。158.段落157的方法，其中所述活化素A以至少約50ng/ml的濃度提供。159.段落157的方法，其中所述活化素A以至少約100ng/ml的濃度提供。160.段落157的方法，其中所述活化素A以至少約500ng/ml的濃度提供。161.段落153的方法，其中所述細胞群在含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。162.段落153的方法，其中所述細胞群在含有少于約0. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基 中分化。163.段落153的方法，其中所述細胞群在含有少于約0. 2% (v/v)血清的培養(yǎng)基 中分化。164.段落153的方法，其中所述細胞群在含有少于約0. 1% (v/v)血清的培養(yǎng)基 中分化。165.段落153的方法，其中所述細胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分 化。166.段落153的方法，其中所述細胞群在特定血清含量的培養(yǎng)基中分化，所述培 養(yǎng)基在加入所述至少一種生長因子后的約第一天含有約0% (v/v)血清，在加入所述至少 一種生長因子后的約第二天含有約0.2% (v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一種生 長因子后的約第三天含有約2% (v/v)或更少血清。167.段落153的方法，其中所述細胞群在低血清RPMI培養(yǎng)基中分化。168.通過段落153的方法產(chǎn)生的前原條細胞的富集群。169.產(chǎn)生富集中內(nèi)胚層細胞的細胞群的方法，所述方法包括以下步驟獲得多能 性細胞群，其中所述多能性細胞群的至少一個細胞含有至少一個拷貝的受選自brachyury 啟動子、FGF4啟動子和SNAI1啟動子的啟動子控制的核酸，所述核酸含有編碼綠色熒光蛋 白(GFP)或其生物活性片段的序列；分化所述多能性細胞以產(chǎn)生中內(nèi)胚層細胞，所述中內(nèi) 胚層細胞是能分化為中胚層細胞或定形內(nèi)胚層細胞的專能細胞；以及從不表達GFP的細胞 中分離所述中內(nèi)胚層細胞。170.段落169的方法，其中所述富集細胞群包含至少約95%的中內(nèi)胚層細胞。171.段落169的方法，其中所述富集細胞群包含至少約98%的中內(nèi)胚層細胞。172.段落169的方法，其中所述分化步驟包括以特定量向所述多能性細胞群提供 至少一種來自TGFP超家族的生長因子，該特定量足以促進所述多能性細胞向中內(nèi)胚層細 胞分化。173.段落172的方法，其中所述至少一種TGF0超家族的生長因子是活化素A。174.段落173的方法，其中所述活化素A以至少約50ng/ml的濃度提供。175.段落173的方法，其中所述活化素A以至少約100ng/ml的濃度提供。176.段落173的方法，其中所述活化素A以至少約500ng/ml的濃度提供。177.段落169的方法，其中所述細胞群在含有少于約1% (v/v)血清的培養(yǎng)基中 分化。178.段落169的方法，其中所述細胞群在含有少于約0. 5% (v/v)血清的培養(yǎng)基
179.段落169的方法，其中所述細胞群在含有少于約O.2% (v/v)血清的培養(yǎng)基
180.段落169的方法，其中所述細胞群在含有少于約O.1% (v/v)血清的培養(yǎng)基
181.段落169的方法，其中所述細胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分
中分化
中分化
中分化化。182.段落169的方法，其中所述細胞群在特定血清含量的培養(yǎng)基中分化，所述培養(yǎng)基在加入所述至少一種生長因子后的約第一天含有約0% (v/v)血清，在加入所述至少一種生長因子后的約第二天含有約O. 2% (v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一種生長因子后的約第三天含有約2% (v/v)或更少血清。183.段落169的方法，其中所述細胞群在低血清RPMI培養(yǎng)基中分化。184.通過段落169的方法產(chǎn)生的中內(nèi)胚層細胞的富集群。185.鑒定能夠促進包含人細胞的細胞群中前原條細胞的分化的分化因子的方法， 所述方法包含以下步驟獲得包含人前原條細胞的細胞群，向所述細胞群提供候選分化因子，確定所述細胞群中標志物在第一時間點的表達、確定所述細胞群中相同標志物在第二時間點的表達，其中所述第二時間點在所述第一時間點之后，并且其中所述第二時間點在向所述細胞群提供所述候選分化因子之后，以及確定所述細胞群中該標志物在所述第二時間點的表達與所述細胞群中該標志物在所述第一時間點的表達相比是否增加或減少，其中所述細胞群中所述標志物表達的增加或減少表明所述候選分化因子能夠促進所述前原條細胞的分化。186.段落185的方法，其中在所述細胞群中所述人前原條細胞占所述人細胞的至少約10%o187.段落185的方法，其中所述細胞群中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約10% 的除所述飼養(yǎng)細胞外的人細胞是前原條細胞。188.段落185的方法，其中在所述細胞群中所述人前原條細胞占所述人細胞的至少約50%。189.段落185的方法，其中所述細胞群中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約50% 的除所述飼養(yǎng)細胞外的人細胞是前原條細胞。190.段落185的方法，其中所述人前原條細胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為選自中內(nèi)胚層、中胚層和定形內(nèi)胚層的細胞。191.段落185的方法，其中所述人前原條細胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為中內(nèi)胚層細胞。
層細胞。
192.段落191的方法，其中所述標志物選自brachyury、FGF4和SNAII。
193.段落185的方法，其中所述人前原條細胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為中胚
194.段落193的方法，其中所述標志物選自FOXFl、FLKl、BMP4、MOXl和SDFl。
195.段落185的方法，其中所述人前原條細胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為定形
內(nèi)胚層細胞。
197.段落185子之前。
198.段落185子大致同時。
199.段落185子之后。
200.段落185
201.段落185
202.段落185確定。
203.段落185
204.段落185因子。
205.段落204
206.段落185
207.段落185
208.段落185
209.段落185
的方法，其中所述標志物選自CXCR4和SOXl7。
的方法，其中所述第一時間點在向所述細胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述第一時間點與向所述細胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述第一時間點在向所述細胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述標志物的表達增加。
的方法，其中所述標志物的表達減少。
的方法，其中所述標志物的表達通過定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Q-PCR)
的方法，其中所述標志物的表達通過免疫細胞化學確定。
的方法，其中所述候選分化因子包括至少一種TGFii超家族的生長
的方法，其中所述至少一種TGFii超家族的生長因子是活化素A。 的方法，其中所述候選分化因子包括小分子。
的方法，其中所述候選分化因子包括多肽。
的方法，其中所述候選分化因子不是TGFii超家族的生長因子。
.85的方法,其中以約O. lng/ml至約10mg/ml的濃度向所述細胞群提供所述候選分化因子。210.段落185的方法，其中以約lng/ml至約lmg/ml的濃度向所述細胞群提供所述候選分化因子。211.段落185的方法，其中以約10ng/ml至約100 μ g/ml的濃度向所述細胞群提供所述候選分化因子。212.段落185的方法，其中以約100ng/ml至約10 μ g/ml的濃度向所述細胞群提供所述候選分化因子。213.段落185的方法，其中以約I μ g/ml的濃度向所述細胞群提供所述候選分化因子。214.鑒定能夠促進包含人細胞的細胞群中中內(nèi)胚層細胞的分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步驟獲得包含人中內(nèi)胚層細胞的細胞群，向所述細胞群提供候選分化因子，確定所述細胞群中標志物在第一時間點的表達，確定所述細胞群中相同標志物在第二時間點的表達，其中所述第二時間點在所述第一時間點之后，并且其中所述第二時間點在向所述細胞群提供所述候選分化因子之后，以及確定所述細胞群中該標志物在所述第二時間點的表達與所述細胞群中該標志物在所述第一時間點的表達相比是否增加或減少， 其中所述細胞群中所述標志物表達的增加或減少表明所述候選分化因子能夠促進所述中內(nèi)胚層細胞的分化。215.段落214的方法，其中所述細胞群中所述人中內(nèi)胚層細胞占所述人細胞的至少約10%o216.段落214的方法，其中所述細胞群中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約10%的除所述飼養(yǎng)細胞外的所述人細胞是中內(nèi)胚層細胞。217.段落214的方法，其中所述細胞群中所述人中內(nèi)胚層細胞占所述人細胞的至少約50%。218.段落214的方法，其中所述細胞群中存在人飼養(yǎng)細胞，并且其中至少約50% 的除所述飼養(yǎng)細胞外的所述人細胞是中內(nèi)胚層細胞。219.段落214的方法，其中所述人中內(nèi)胚層細胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為選自中胚層細胞和定形內(nèi)胚層的細胞。
的方法，其中所述人中內(nèi)胚層細胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為中
的方法，其中所述標志物選自FOXFl、FLKl、BMP4、MOXl和SDFl。 的方法，其中所述人中內(nèi)胚層細胞響應(yīng)所述候選分化因子分化為定
的方法，其中所述標志物選自CXCR4和SOXl7。
的方法，其中所述第一時間點在向所述細胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述第一時間點與向所述細胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述第一時間點在向所述細胞群提供所述候選分化因
的方法，其中所述標志物的表達增加。
的方法，其中所述標志物的表達減少。
的方法，其中所述標志物的表達通過定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Q-PCR)
的方法，其中所述標志物的表達通過免疫細胞化學確定。
的方法，其中所述候選分化因子包括至少一種TGFii超家族的生長
的方法，其中所述至少一種TGFii超家族的生長因子是活化素A。 的方法，其中所述候選分化因子包括小分子。
的方法，其中所述候選分化因子包括多肽。
的方法，其中所述候選分化因子不是TGFii超家族的生長因子。 段落214的方法,其中以約O. lng/ml至約10mg/ml的濃度向所述細胞群提供
的方法，其中以約lng/ml至約lmg/ml的濃度向所述細胞群提供所
的方法，其中以約10ng/ml至約100 μ g/ml的濃度向所述細胞群提
的方法，其中以約100ng/ml至約10 μ g/ml的濃度向所述細胞群提
的方法，其中以約I μ g/ml的濃度向所述細胞群提供所述候選分化220.段落214胚層細胞。
221.段落220
222.段落214形內(nèi)胚層細胞。
223.段落222
224.段落214子之前。
225.段落214子大致同時。
226.段落214子之后。
227.段落214
228.段落214
229.段落214確定。
230.段落214
231.段落214因子。
232.段落231
233.段落214
234.段落214
235.段落214
236.段落214丨所述候選分化因子。
237.段落214述候選分化因子。
238.段落214供所述候選分化因子。
239.段落214供所述候選分化因子。
240.段落214因子。241.在體外提高人胚胎干細胞(hESC)中FGF8基因產(chǎn)物的表達的方法，所述方法包括在含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得所述hESC，并且使所述hESC接觸足以增加FGF8基因產(chǎn)物的表達的量的分化因子。242.段落241的方法，其中所述分化因子包括至少一種TGF β超家族的生長因子。243.段落242的方法，其中所述分化因子包括活化素Α。244.段落241的方法，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。245.在體外提高人胚胎干細胞(hESC)或前原條細胞中選自brachyury、FGF4 和SNAIl的基因產(chǎn)物的表達的方法，所述方法包括在包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得所述hESC或前原條細胞，并且使所述hESC或所述前原條細胞接觸足以增加選自 brachyury、FGF4和SNAIl的基因產(chǎn)物的表達的量的細胞因子。246.段落245的方法，其中所述分化因子包括至少一種TGF0超家族的生長因子。247.段落246的方法，其中所述分化因子包括活化素A。248.段落245的方法，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。249.包含人胚胎干細胞(hESC)和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物，其中所述hESC在參考時間點開始分化，以至于與所述hESC中基線FGF8 mRNA表達相比，距所述參考時間點約6小時時FGF8 mRNA的表達顯著上調(diào)。250.段落249的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約24小時時FGF8 mRNA的表達顯著下調(diào)。251.段落250的細胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時間點約6小時至約24小時之間 FGF8 mRNA的表達達到峰值。252.段落249的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約17小時時β -連接素多肽開始向細胞核定位。253.段落249的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約24小時時brachyury mRNA 的表達顯著上調(diào)。254.段落253的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約48小時時brachyury mRNA 的表達顯著下調(diào)。255.段落254的細胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時間點約12小時至約48小時之間brachyury mRNA的表達達到峰值。256.段落255的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約72小時時brachyury mRNA 不顯著表達。257.段落249的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約24小時時FGF4 mRNA的表達顯著上調(diào)。258.段落257的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約48小時時FGF4 mRNA的表達顯著下調(diào)。259.段落258的細胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時間點約12小時至約48小時之間FGF4 mRNA的表達達到峰值。260.段落259的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約72小時時FGF4 mRNA不顯著表達。
261.段落249的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約24小時時brachyury和 FGF4 mRNA的表達顯著上調(diào)。262.段落261的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約48小時時brachyury和 FGF4 mRNA的表達顯著下調(diào)。263.段落262的細胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時間點約12小時至約48小時之間brachyury和FGF4 mRNA的表達達到峰值。264.段落263的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約72小時時brachyury和 FGF4 mRNA不顯著表達。265.段落249的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約24小時時SNAIl mRNA的表達顯著上調(diào)。266.段落265的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約48小時時SNAIl mRNA的表達顯著下調(diào)。267.段落266的細胞培養(yǎng)物，其中在距所述參考時間點約12小時至約48小時之間SNAIl mRNA的表達達到峰值。268.段落249的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約12小時時E-鈣粘著素 mRNA的表達開始下調(diào)。269.段落 249 mRNA的表達顯著下調(diào)。270.段落 249 表達顯著上調(diào)。271.段落249的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約96小時時F0XA2 mRNA的表達顯著上調(diào)。272.段落 249273.段落 249274.段落 249275.段落 249276.段落 249277.段落 276278.段落 277
的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約48小時時E-鈣粘著素的細胞培養(yǎng)物，其中距所述參考時間點約48小時時SOX17 mRNA的
的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約I % (v/v)的血清。 的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約O. 2% (v/v)的血清。 的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。
的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。 的細胞培養(yǎng)物，還包含TGFii超家族的分化因子。
的細胞培養(yǎng)物，其中所述分化因子包括活化素A。
的細胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。279.包含人胚胎干細胞(hESC)、TGFP超家族的分化因子和含有少于約2% (v/ V)血清的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物。280.段落279的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因的表達上調(diào)之
前上調(diào)。281.段落280的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因的峰值表達之
前上調(diào)。
282.段落281的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自HEY1、GATA2、 BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、DKK4、NET01、 T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標志物基因的峰值表達之前或大約同時下調(diào)。283.段落279的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEY1、GATA2、BIK和IDl的標志物基因的表達在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之如上調(diào)。284.段落283的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自brachyury、 FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因的表達在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之前或大致同時上調(diào)。285.段落284的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自brachyury、 FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之前或大致同時達到其
峰值表達。286.段落283的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因的表達上調(diào)之
前上調(diào)。287.段落279的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)的血清。288.段落279的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約0. 2% (v/v)的血清。289.段落279的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。290.段落279的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。291.段落279的細胞培養(yǎng)物，其中所述TGF β超家族的分化因子包括活化素A。292.段落291的細胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)基中。293.在細胞培養(yǎng)物中分化細胞的方法，所述方法包括(a)使包含人胚胎干細胞 (hESC)的細胞培養(yǎng)物與含有少于約2%血清的培養(yǎng)基接觸，(b)向所述hESC提供TGFii超家族的分化因子，以及(c)允許所述hESC的分化發(fā)生。294.段落283的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、 DKK4、NET01、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。295.段落294的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、 DKK4、NET01、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標志物基因的峰值表達之前上調(diào)。296.段落295的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自HEYl、GATA2、BIK和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、Τ、 DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標志物基因的峰值表達之前或大致同時下調(diào)。297.段落293的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK和IDl的標志物基因的表達在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之如上調(diào)。298.段落297的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自brachyury、FGF4、 SNAIl、Wnt3、MIXLl、DKK4、NET01、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因的 表達在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXL1的標志物基因的表達上調(diào)之前或大致同時上調(diào)。299.段落298的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自brachyury、FGF4、 SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NET01、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1 和 GRM4 的標志物基因 在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXL1的標志物基因的表達上調(diào)之前或大致同時達到其峰值 表達。300.段落297的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK 和 ID1 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、 DKK4、NET01、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。301.段落293的方法，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1 % (v/v)的血清。302.段落293的方法，其中所述培養(yǎng)基包含少于約0. 2% (v/v)的血清。303.段落293的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。304.段落293的方法，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。305.段落293的方法，其中所述TGF0超家族的分化因子包括活化素A。306.段落305的方法，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在于所述培養(yǎng)基 中。307.包含人胚胎干細胞(hESC)和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基的細胞培 養(yǎng)物，其中所述hESC在參考時間點開始分化，以至于距所述參考時間點約2小時時所述 hESC中選自FZD10、FGF5和0CT4的mRNA的表達與選自FZD10、FGF5和0CT4的相應(yīng)mRNA 的基線表達相比顯著上調(diào)。308.段落307的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)的血清。309.段落307的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約0. 2% (v/v)的血清。310.段落307的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。311.段落307的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。312.段落307的細胞培養(yǎng)物，還包含TGF0超家族的分化因子。313.段落312的細胞培養(yǎng)物，其中所述分化因子包括活化素A。314.段落313的細胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。315.包含人胚胎干細胞(hESC)和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基的細胞培 養(yǎng)物，其中所述hESC在參考時間點開始分化，以至于距所述參考時間點約2小時時所述 hESC中選自GBX2、ZFP42和S0X2的mRNA的表達與選自GBX2、ZFP42和S0X2的相應(yīng)mRNA 的基線表達相比顯著下調(diào)。316.段落315的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)的血清。317.段落315的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約0. 2% (v/v)的血清。318.段落315的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。319.段落315的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。320.段落315的細胞培養(yǎng)物，還包含TGF0超家族的分化因子。321.段落320的細胞培養(yǎng)物，其中所述TGF 0超家族的分化因子包括活化素A。
322.段落321的細胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。323.包含人胚胎干細胞(hESC)、TGFP超家族的分化因子和含有少于約2% (v/ V)血清的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，在選自FGF8、Nodal、HEG、 HEY1、GATA2、BIK和IDl的標志物基因的表達上調(diào)之前選自FZD10、FGF5、Nanog和0CT4的標志物基因的表達上調(diào)，或者選自GBX2、ZFP42和S0X2的標志物基因的表達下調(diào)。324.段落 323 的細胞培養(yǎng)物，其中在選自 brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXLl、 DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACI1、FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標志物基因的表達上調(diào)之前選自 FZD10、FGF5、Nanog和0CT4的標志物基因的表達上調(diào)，或者選自GBX2、ZFP42和S0X2的標志物基因的表達下調(diào)。325.段落323的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約1% (v/v)的血清。326.段落323的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含少于約O. 2% (v/v)的血清。327.段落323的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。328.段落323的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。329.段落323的細胞培養(yǎng)物，還包含TGFβ超家族的分化因子。330.段落329的細胞培養(yǎng)物，其中所述TGF β超家族的分化因子包括活化素A。331.段落330的細胞培養(yǎng)物，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。332.分化細胞培養(yǎng)物中細胞的方法，所述方法包括(a)使包含人胚胎干細胞 (hESC)的細胞培養(yǎng)物與包含少于約2%血清的培養(yǎng)基接觸，(b)向所述hESC提供TGFii超家族的分化因子，以及(c)允許所述hESC分化的發(fā)生，其中所述細胞培養(yǎng)物的細胞中，在選自FGF8、Nodal、HEG、HEYl、GATA2、BIK和IDl的標志物基因的表達上調(diào)之前選自FZD10、 FGF5、Nanog和0CT4的標志物基因的表達上調(diào)，或者選自GBX2、ZFP42和S0X2的標志物基因的表達下調(diào)。333.段落 332 所述的方法，其中在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、MIXLU DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標志物基因的表達上調(diào)之前選自 FZD10、FGF5、Nanog和0CT4的標志物基因的表達上調(diào)，或者選自GBX2、ZFP42和S0X2的標志物基因的表達下調(diào)。334.段落332的方法，其中所述培養(yǎng)基包含少于約I % (v/v)的血清。335.段落332的方法，其中所述培養(yǎng)基包含少于約O. 2% (v/v)的血清。336.段落332的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約0% (v/v)的血清。337.段落332的方法，其中所述培養(yǎng)基缺乏血清或缺乏血清替代物。338.段落332的方法，還包含TGFβ超家族的分化因子。339.段落338的方法，其中所述分化因子包括活化素Α。340.段落339的方法，其中所述活化素A以約100ng/ml的濃度存在。應(yīng)理解上述方法和組合物涉及體外培養(yǎng)的細胞。但是，上述的體外分化的細胞組合物可用于體內(nèi)應(yīng)用。本發(fā)明的其他實施方案也可參見以下專利申請于2003年12月23日提交的題為 DEFINITIVE END0DERM(定形內(nèi)胚層)的第60/532，004號美國臨時專利申請；于2004年4 月27日提交的題為PDXl EXPRESSING END0DERM (表達PDXl的內(nèi)胚層)的第60/566，293 號美國臨時專利申請；于2004年7月9日提交的題為CHEM0KINE CELL SURFACE RECEPTORFOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM(用于分離定形內(nèi)胚層的趨化因子細胞表面受體)的第60/586，566號美國臨時專利申請；于2004年7月14日提交的題為CHEM0KINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE END0DERM(用于分離定形內(nèi)胚層的趨化因子細胞表面受體)的第60/587，942號美國臨時專利申請；于2004年12月23 日提交的題為DEFINITIVE END0DERM(定形內(nèi)胚層)的第11/021，618號美國專利申請；于 2005年4月26日提交的題為TOXl EXPRESSING END0DERM(表達TOXl的定形內(nèi)胚層)的第 11/115，868號美國專利申請；于2005年6月23日提交的題為METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DEFFERENTIATING DEFINITIVE END0DERM(鑒定用于分化定形內(nèi)胚層的因子的方法)的第11/165，305號美國專利申請和于2005年6月23日提交的題為PREPRMITIVE STREAK CELLS AND MESEND0DERM CELLS (前原條細胞和中內(nèi)胚層細胞)的第60/693，364號美國臨時專利申請，其公開在此整體并入以供參考。附圖簡要說明圖I是描述在活化素存在下、在BMP4和SU5402組合存在下、和不存在任何分化因子時胚胎干細胞(ESC)的分化的示意圖。還列出了一些對鑒定和/或檢測每種細胞類型有用的標志物基因。圖2A-M是顯示可用于鑒定定形內(nèi)胚層細胞的標志物基因的表達模式的條形圖。 圖G-L依次顯示了定形內(nèi)胚層標志物FGF17、VWF、CALCR、F0XQ1、CMK0R1和CRIPl的表達分析。圖A-F依次顯示了前述細胞系標志基因S0X17、S0X7、S0X17/S0X7、TM、ZIC1和MOXl的表達分析。圖M顯不了 CXCR4的表達分析。對于圖A-M的每一圖,標注hESC的列表不來自純化的人胚胎干細胞的基因表達；2NF表示細胞經(jīng)過2% FBS處理，不添加活化素；0. 1A100 表示細胞經(jīng)0. 1% FBS和100ng/ml活化素A處理；1A100表示細胞經(jīng)過1% FBS和IOOng/ ml活化素A處理；2A100表示細胞經(jīng)過2% FBS和100ng/ml活化素A處理。圖3是顯示了某些標志物基因在㈧前原條細胞，(B-D)原條(中內(nèi)胚層)細胞， (E-F)中內(nèi)胚層和定形內(nèi)胚層細胞，(G)定形內(nèi)胚層細胞,和(H-L)滋養(yǎng)外胚層和原始內(nèi)胚層細胞中表達的條形圖。分化過程中，在向細胞培養(yǎng)物中加入100ng/ml活化素A(用“A” 表明)或 100ng/mlBMP4 和 2. 5 μ M SU5402 的組合(用“B/SU” 表明)后的 0、6、12、24、48、 72和96小時時，通過Q-PCR確定標志物的表達。所有細胞都生長在在第一天(最初24小時)含有0% (v/v)FBS、在第二天(24-48小時)含有0.2% (v/v)FBS和在第三和第四天 (48-96小時)含有2% (v/v)FBS的RPMI培養(yǎng)基中。表I提供了每種標志物基因的全稱。圖4A-C是顯示在100ng/ml活化素A和0. 1% (v/v) FBS存在下，在hESC (用“ESC” 表明)分化的最初48小時中(A)中內(nèi)胚層的Brachyury標志物(BRACH)，(B) hESC的E-鈣粘著素標志物，和(C)中內(nèi)胚層的SNAII標志物的mRNA表達模式的條形圖。圖5A和B是依次顯示了 100ng/ml活化素A和O. 1% (v/v)FBS (用“ESC”表明) 存在下，在hESC分化的最初48小時中，中內(nèi)胚層的Brachyury標志物(BRACH)和定形內(nèi)胚層的性別決定區(qū)Y-Box 17 (S0X17)標志物的mRNA表達模式的條形圖。圖6A-D是顯微圖片，顯示了在100ng/ml活化素A和0. 1% (v/v)FBS存在下， 從hESC分化48小時后的細胞。圖A顯示了用DAPI染色的細胞區(qū)域。圖B-D顯示了用抗 Brachyury (B)、抗SOX17 (C)或抗Brachyury和S0X17 二者(D)的抗體染色的相同細胞區(qū)域。圖7是描述了低血清條件下，存在100ng/ml活化素A(AlOO)或不存在活化素A(NF)時胚胎干細胞(ESC)的分化的示意圖。PS表示原條細胞(中內(nèi)胚層細胞)；DE表示定形內(nèi)胚層細胞；并且M表示中胚層細胞。圖8A-F是描述特定條件下細胞培養(yǎng)物中中胚層標志物基因(A)BRACH，(B)FOXFl, (C)FLKl, (D)BMP4, (E)MOXl和(F)SDFl表達的條形圖，該特定條件為在100ng/ml活化素A 連續(xù)存在下孵育4天后(AlOO)，或孵育4天后但在第一天后撤除活化素A (NF)。通過Q-PCR 確定標志物基因的表達。圖9A-C是描述特定條件下細胞培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層標志物基因(A)GSC，(B) S0X17和(C) F0XA2表達的條形圖，該特定條件為在100ng/ml活化素A連續(xù)存在下孵育4天后(AlOO),或孵育4天后但在第一天后撤除活化素A(NF)。通過Q-PCR確定標志物基因的表達。

圖10A-I是描述可用于鑒定和/或檢測定形內(nèi)胚層細胞的某些標志物基因表達的條形圖。在含有O. 5%、2%或10%小牛血清(FBS)和100ng/ml活化素A (A100)或沒有活化素A (NF)的五天的細胞培養(yǎng)物中，通過Q-PCR確定標志物基因的表達。圖IlA和B是描述了在100ng/ml活化素A存在下分化了 4天的細胞培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層標志物(A)S0X17和(B)F0XA2表達的條形圖。通過Q-PCR確定分化過程中，加入活化素A后0、6、24、30、48和96小時時標志物基因的表達。圖12A-D顯示了移植到免疫妥協(xié)小鼠的腎包膜下的定形內(nèi)胚層細胞的體內(nèi)分化。 各圖A-蘇木精-伊紅染色顯示腸管樣結(jié)構(gòu)；B-抗肝細胞特異性抗原(肝)的抗體免疫反應(yīng)性；C-抗絨毛蛋白(腸)的抗體免疫反應(yīng)性；和D-抗CDX2 (腸)的抗體免疫反應(yīng)性。詳細描述稱為原腸胚形成的早期人發(fā)育中的重要階段發(fā)生于受精后2-3周。原腸胚形成非常重要，因為在這個階段三種主要胚層第一次特異化和組織化(Lu et al. ,2001； Schoenwolf和Smith，2000)。外胚層負責身體外表和整個神經(jīng)系統(tǒng)的最終形成，而中胚層衍生出心、血、骨、骨骼肌和其他結(jié)締組織。定形內(nèi)胚層被定義為負責整個腸管(包括食道、 胃、小腸和大腸)以及腸管衍生的器官(如肺、肝、胸腺、甲狀旁腺、甲狀腺、膽囊和胰腺)形成的胚層(Grapin-Botton 和 Melton, 2000 ;Kimelman 和 Griff in, 2000 ；Tremblay et al.， 2000 ;Wells和Melton，1999 ;Wells和Melton，2000))。定形內(nèi)胚層細胞與稱為原始內(nèi)胚層的完全分離細胞系有重要區(qū)別。原始內(nèi)胚層主要負責胚外組織的形成，主要是胎盤卵黃囊的腔壁和內(nèi)臟內(nèi)胚層部分和Reichert’ s膜的胞外基質(zhì)物質(zhì)。在原腸胚形成期，定形內(nèi)胚層形成過程起始于細胞遷移，其中中內(nèi)胚層細胞(有形成中胚層或內(nèi)胚層能力的細胞)遷移穿過稱為原條的結(jié)構(gòu)。當中內(nèi)胚層進入原條，它們經(jīng)歷表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，成為中胚層或定形內(nèi)胚層。定形內(nèi)胚層源自遷移穿過原條前部及節(jié)(在原條最前部區(qū)域的特化結(jié)構(gòu))的細胞。當遷移發(fā)生時，定形內(nèi)胚層首先集中于最前部腸管，隨后以腸管后端的形成而終止。原條前體細胞(前原條細胞)和原條細胞(中內(nèi)胚層細胞)是產(chǎn)生中胚層和定形內(nèi)胚層的早期階段前體細胞。事實上，前原條細胞和中內(nèi)胚層細胞可能是從多能性向由中胚層和定形內(nèi)胚層細胞系形成的終分化的細胞、組織和/或器官的發(fā)育過程中最早的前體。直到目前，尚未獲得富集人前原條細胞的細胞群或富集人中內(nèi)胚層細胞的細胞群。而且，該細胞群的細胞之前未在體外被表征過。
考慮以上所述，本發(fā)明的一些實施方案涉及包含人前原條細胞的細胞培養(yǎng)物和/ 或富集細胞群，以及包含人中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和/或富集細胞群。這些實施方案中，前原條細胞和中內(nèi)胚層細胞能夠進一步分化為中胚層細胞和/或定形內(nèi)胚層細胞以及源自這些細胞系的細胞、組織和/或器官。本發(fā)明的其它實施方案涉及制備包含人前原條細胞的細胞培養(yǎng)物和/或富集細胞群，以及制備包含人中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和/或富集細胞群的方法。本文所述其它實施方案涉及鑒定可用于使包含前原條細胞或中內(nèi)胚層細胞的細胞群中細胞分化的一種或多種分化因子的篩選方法。這些因子可用于促進這些細胞類型向中胚層和/或定形內(nèi)胚層細胞以及源自這些細胞系的細胞、組織和/或器官的分化。本發(fā)明的某些其它方面涉及提高某些早期階段細胞標志物表達的方法。其它方面涉及包含在分化過程中表達某些標志物的細胞的細胞組合物。定義貫穿本申請的某些術(shù)語和短語具有以下所描述的意義此處使用的“胚胎的”指有機體的一系列發(fā)育階段，開始于單一受精卵，結(jié)束于多細胞結(jié)構(gòu)，這種多細胞結(jié)構(gòu)除了發(fā)育的配子生殖細胞外不再包含多能性或全能細胞。除了來自配子融合的胚胎，術(shù)語“胚胎的”也指來自體細胞核轉(zhuǎn)移的胚胎。本文使用的“專能的(multipotent) ”或“專能細胞(multipotent cell)”指能產(chǎn)生有限數(shù)量的其它具體細胞類型的細胞類型。本文使用的“表達”指材料或物質(zhì)的產(chǎn)生以及材料或物質(zhì)產(chǎn)生的水平或數(shù)量。因此，檢測特定標志物的表達指測定表達標志物的相對或絕對量,或僅僅檢測標志物的存在或缺失。此處使用的“標志物”指能夠被觀察或檢測到的任何分子。例如，標志物可包括但不局限于核酸，如特異基因的轉(zhuǎn)錄本、基因的多肽產(chǎn)物、非基因多肽產(chǎn)物、糖蛋白、糖、糖脂、 脂質(zhì)、脂蛋白或小分子(例如，分子量小于10，OOOamu的分子)。當涉及細胞培養(yǎng)物和/或細胞群時，術(shù)語“部分”表示細胞培養(yǎng)物或細胞群任意不為零的數(shù)量，范圍從單個細胞到整個細胞培養(yǎng)物或細胞群。關(guān)于細胞培養(yǎng)物或細胞群中的細胞，術(shù)語“基本上不含”表示細胞培養(yǎng)物或細胞群不含的特異細胞類型在細胞培養(yǎng)物或細胞群的所有細胞中占有的比例少于5%。關(guān)于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，此處使用的“低血清RPMI ”指含有低血清的培養(yǎng)基，其中血清濃度在限定的時間段內(nèi)逐漸增強。例如，在一個實施方案中，低血清RPMI在細胞生長的第一天包含濃度為約O. 2%的小牛血清(FBS)，在細胞生長的第二天包含濃度為約O. 5% 的小牛血清(FBS)，在細胞生長的第三天到第五天包含濃度為約2%的小牛血清(FBS)。另一實施方案中，低血清RPMI在第一天包含濃度為約O %的，在第二天包含濃度為約O. 2% 的，以及在第三天及以后包含約2%的。本文使用的“血清替代物”指包含IGF或胰島素的血清替代物。hESC向定形內(nèi)胚層細胞分化中早期事件的模型圖I顯示了總結(jié)在體外人胚胎干細胞(hESC)早期轉(zhuǎn)變的模型?？梢酝ㄟ^在低血清添加情況下使用高劑量的活化素A組織hESC通過接近重演原腸胚形成的過程的分化。約 24小時(前原條細胞)之前FGF8和核定位的β -連接素的表達(其為原條形成之前發(fā)生在最接近的上胚層的事件)明顯。原條表達基因(brachyury和FGF4)的高水平表達發(fā)生在約24小時。如果保持在高劑量活化素A中，該原條細胞(中內(nèi)胚層細胞)有效地轉(zhuǎn)化為定形內(nèi)胚層。相反，缺乏活化素時，這些中內(nèi)胚層前體成為中胚層。用BMP4和SU5402處理 hESC誘導與原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)外胚層相關(guān)的基因表達。前原條細胞和中內(nèi)胚層細胞及其相關(guān)過程本發(fā)明的實施方案涉及在培養(yǎng)物中生成前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞的新的確定方法，其通過將諸如干細胞的多能性細胞分化為前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞來實現(xiàn)。如上所述，前原條細胞能夠分化中內(nèi)胚層細胞以及源于它們的細胞、組織和/或器官。 中內(nèi)胚層細胞能夠分化中胚層細胞和/或定形內(nèi)胚層細胞以及源于這些細胞系中任一種的細胞、組織和/或器官。一些實施方案中，前原條細胞經(jīng)過中內(nèi)胚層中間體轉(zhuǎn)化為中胚層或定形內(nèi)胚層細胞系的終末分化的細胞。如以下將要進一步詳細描述的，這些方法可以提供有效生成多種人內(nèi)胚層和中胚層衍生組織的基礎(chǔ)。例如，這些方法可以提供有效生成人內(nèi)胚層衍生的組織，如胰、肝、肺、胃、腸、甲狀腺、胸腺、咽、膽囊和膀胱的基礎(chǔ)。重要地，前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞的產(chǎn)生是干細胞向功能性的產(chǎn)生胰島素的β細胞分化的早期步驟。作為另一例子，前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞可以提供有效生成人中胚層衍生的組織，如血細胞、心血管組織、骨組織和其它結(jié)構(gòu)和結(jié)締組織的基礎(chǔ)。為了獲得有用量的任何上述的細胞或組織類型，在達到終末分化的細胞命運之前，期望發(fā)生的每個分化步驟都是高效的。因為干細胞分化為前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞代表著生成功能性中胚層和定形內(nèi)胚層細胞系的終末分化細胞的最初步驟(如圖I所示)，特別需要此步分化高效。鑒于分化多能性細胞至前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞的需要，本發(fā)明一些方面涉及體外方法學，將約5-90%的多能性細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榍霸瓧l細胞和/或中內(nèi)胚層細胞。典型地，這些方法包括以已確定及暫時指定的方式使用培養(yǎng)物及生長因子。通過基于差異熒光標志物表達揀選細胞，從細胞群中將前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞與其它細胞分離和/ 或純化，可獲得前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞細胞群的更大富集。這樣，本文所述一些實施方案涉及前原條細胞及制備和分離和/或純化這些細胞的方法。其它實施方案涉及中內(nèi)胚層細胞及制備和分離和/或純化這些細胞的方法。為了確定細胞培養(yǎng)物或細胞群內(nèi)前原條細胞細胞的數(shù)量,需要從培養(yǎng)物或細胞群中區(qū)分這類細胞與其它細胞的方法。因此，本發(fā)明實施方案涉及細胞標志物，其存在、缺失和/或相對表達水平對前原條細胞是特異的，以及檢測確定這些標志物表達的方法。本發(fā)明的一些實施方案中，標志物表達的存在與否和/或其水平由定量 PCR(Q-PCR)確定。例如，一些遺傳標志物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本量，例如0CT4、ECAD、FGF8、β-連接素、brachyury、FGF4、SNA 11、SOX17、CXCR4、GSC、MI XL I、F0XA2、S0X7、FOXF UFLKU BML4、 MOXUSDFl及本文所述的其它標志物，由定量Q-PCR確定。其它實施方案中，免疫組化技術(shù)用于檢測上述基因表達的蛋白。其它實施方案中，免疫組化技術(shù)/免疫細胞化學用于檢測例如核定位的連接素的某些多肽標志物的細胞區(qū)室定位。其它實施方案中，Q-PCR及免疫組化技術(shù)用于識別及確定這些標志物的量或相對比例。通過使用如上述的確定一種或多種合適的標志物表達的方法，在細胞培養(yǎng)物或細胞群內(nèi)識別前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞以及確定前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞的比例是可能的。例如，本發(fā)明的一些實施方案中，產(chǎn)生的前原條細胞或細胞群表達FGF8標志物和/或核定位的β_連接素的水平比非前原條細胞類型或細胞群高約2個數(shù)量級。在其它實施方案中，產(chǎn)生的前原條細胞或細胞群表達FGF8標志物和/或核定位的β -連接素的水平比非前原條細胞細胞類型或細胞群高2個數(shù)量級以上。在本發(fā)明的其它實施方案中， 產(chǎn)生的中內(nèi)胚層細胞或細胞群表達brachyury、FGF4和/或SNAIl標志物的水平比非中內(nèi)胚層細胞類型或細胞群高約2個數(shù)量級。其它實施方案中，產(chǎn)生的中內(nèi)胚層細胞或細胞群表達brachyury、FGF4和/或SNAIl標志物的水平比非中內(nèi)胚層細胞類型或細胞群高2個數(shù)量級以上。本文所述實施方案還涉及前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞組合物。例如，一些實施方案涉及包括前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物，然而其它的涉及富集了前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞的細胞群。一些優(yōu)選的實施方案涉及包括前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中至少約5-90%的細胞為前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞。特別優(yōu)選的實施方案涉及包括人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約 5-90%的人細胞為前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞。由于分化方法的效果可以通過改變一些參數(shù)進行調(diào)節(jié)，這些參數(shù)包括但不限于細胞生長條件、生長因子濃度及培養(yǎng)步驟的時間安排，本發(fā)明所述的分化方法可使約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約95%、或大于95%的多能性細胞轉(zhuǎn)化為前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞。在其它優(yōu)選的實施方案中，考慮將諸如干細胞群體的多能性細胞群轉(zhuǎn)化為基本純的前原條細胞和 /或中內(nèi)胚層細胞群。本發(fā)明所述的組合物及方法具有幾個有用的特征。例如，包括前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物及細胞群，以及制備這些細胞培養(yǎng)物及細胞群的方法可用于模建人發(fā)育的早期階段。此外，本發(fā)明所述的組合物及方法也可用于諸如糖尿病的疾病的治療性干預(yù)。例如，由于前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞僅為有限數(shù)量的組織的來源，因而其可用于發(fā)育純的組織或細胞類型。從多能件細胞產(chǎn)牛前原條細胞產(chǎn)生前原條細胞的一些方法中，作為起始材料的多能性細胞是干細胞。某些方法中，從胚胎干細胞產(chǎn)生包含前原條細胞的細胞培養(yǎng)物和富集的細胞群。優(yōu)選的衍生前原條細胞的方法利用人胚胎干細胞作為制備前原條細胞的起始材料。這些多能性細胞可以是衍生于桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團或從胚胎生殖嵴獲得的細胞。使用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法，人胚胎干細胞可在培養(yǎng)基中保持多能性狀態(tài)而基本不分化。所述的方法在諸如第5，453，357、 5，670，372,5, 690，926,5, 843，780,6, 200，806 及 6，251，671 號美國專利中有所描述，其公開在此整體并入以供參考。在產(chǎn)生前原條細胞的一些方法中，hESC維持在滋養(yǎng)層。在這些方法中，任何能夠使hESC保持在多能性狀態(tài)的滋養(yǎng)層都可使用。一種常用的培養(yǎng)人胚胎干細胞的滋養(yǎng)層為一層小鼠成纖維細胞。最近，人成纖維細胞滋養(yǎng)層也已開發(fā)出來用于培養(yǎng)hESC(參見第 2002/0072117號美國專利申請中公開的方法，其公開在此整體并入以供參考)。產(chǎn)生前原條細胞的其它方法允許不使用滋養(yǎng)層而保持多能性hESC。在沒有滋養(yǎng)層條件下保持多能 hESC的方法已在第2003/0175956號美國專利申請中有描述，其公開在此整體并入以供參考。
本發(fā)明所述的人胚胎干細胞可以保持在具有或不具有血清的培養(yǎng)基中。在一些胚胎干細胞保持方法中，使用血清替代品。在其它方法中，使用無血清培養(yǎng)技術(shù)，如美國專利申請?zhí)?003/0190748所述，其公開在此全部引入，以供參考。在培養(yǎng)基中保持多能性狀態(tài)的干細胞按照常規(guī)傳代，直到分化為前原條細胞。在一些實施方案中，分化至前原條細胞的完成是通過向干細胞培養(yǎng)基中加入分化因子，如 TGF^超家族的生長因子，其加入的量足以促進至前原條細胞的分化。用于制備前原條細胞的TGFii超家族生長因子選自Nodal/活化素亞群。一些優(yōu)選的分化方法中，生長因子選自 Nodal、活化素A和活化素B。在某些分化方法中，使用生長因子活化素A。關(guān)于從多能性干細胞向前原條細胞分化的一些方法，向細胞中加入的上述生長因子，使其在培養(yǎng)基中的濃度足以促進至少一部分干細胞分化至前原條細胞。一些方法中，培養(yǎng)基中上述生長因子的濃度至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ ml、至少約500ng/ml、至少約1000ng/ml、至少約2000ng/ml、至少約3000ng/ml、至少約 4000ng/ml、至少約 5000ng/ml 或大于 5000ng/ml。在使多能干細胞向前原條細胞分化的某些方法中，上述生長因子加入培養(yǎng)基后需要被從細胞培養(yǎng)物中除去。例如，生長因子的除去時間約I小時之內(nèi)、約2小時之內(nèi)、約3小時之內(nèi)、約4小時之內(nèi)、約5小時之內(nèi)、約6小時之內(nèi)、約7小時之內(nèi)、約8小時之內(nèi)、約9小時之內(nèi)、約10小時之內(nèi)、約11小時之內(nèi)、約12小時之內(nèi)、約13小時之內(nèi)、約14小時之內(nèi)、 約15小時之內(nèi)、約16小時之內(nèi)、約17小時之內(nèi)、約18小時之內(nèi)、約19小時之內(nèi)、約20小時之內(nèi)、約21小時之內(nèi)、約22小時之內(nèi)、約23小時之內(nèi)、約24小時之內(nèi)或約多于24小時之內(nèi)。前原條細胞的培養(yǎng)物可生長在包含少量血清或無血清的培養(yǎng)基中。在某些培養(yǎng)條件下，血清的濃度范圍為約0% (v/v)至約10% (ν/ν) ο例如，在一些分化方法中，培養(yǎng)基中血清的濃度可以低于約0.05% (v/v)、低于約0. 1% (v/v)、低于約0.2% (v/v)、低于約 0. 3% (v/v)、低于約 0.4% (v/v)、低于約 0. 5% (v/v)、低于約 0.6% (v/v)、低于約 0. 7% (v/v)、低于約0.8% (v/v)、低于約0.9% (v/v)、低于約1% (v/v)、低于約2% (v/v)、低于約3% (v/v)、低于約4% (v/v)、低于約5% (v/v)、低于約6% (v/v)、低于約7% (v/v)、低于約8% (v/v)、低于約9% (v/v)或低于約10% (ν/ν) ο在一些方法中，前原條細胞在無血清或無血清替代物下生長。在其它方法中，前原條細胞在B27存在下生長。在這些方法中， B27添加物的濃度范圍為約O. 1% (v/v)至約20% (v/v)。監(jiān)測多能件細胞向前原條細胞的分化hESC培養(yǎng)物至前原條細胞的進程可以通過確定前原條細胞特征性標志物的時間性表達來監(jiān)測。在一些方法中，一些標志物的表達可通過標志物的存在或缺失來確定。 或者，某些標志物的表達可通過測定標志物在細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞中，在加入分化因子之后的一個或多個時間點的水平來確定。在這些方法中，可以定性或定量測定標志物的表達。定量標志物基因產(chǎn)生的標志物表達的一種方法可以使用定量聚合酶鏈式反應(yīng) (Q-PCR)。進行Q-PCR的方法為現(xiàn)有技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)已知的其它方法也可用于定量標志物基因的表達。例如，標志物基因產(chǎn)物的表達可以通過使用針對感興趣的特異標志物基因產(chǎn)物的抗體來檢測。某些方法中，測定前原條細胞的特征性標志物基因的表達，以及缺乏hESC及其它細胞類型的特征標志物基因的顯著表達。其它方法中，確定前原條細胞的特征性標志物基因在加入分化因子后的一個或多個時間點的表達的時間性和量。如以下實施例的進一步所述，前原條細胞的標志物為FGF8和β-連接素。這樣， 本發(fā)明所述方法制備的前原條細胞表達FGF8和β -連接素標志物基因，由此產(chǎn)生FGF8和 β連接素標志物基因產(chǎn)物。在一些實施方案中，F(xiàn)GF8 mRNA在前原條細胞但不在hESC中大量表達。FGF8 mRNA的顯著上調(diào)，直至接近峰值水平，可以在hESC接觸諸如活化素A的合適的分化因子后6小時時在分化中的hESC培養(yǎng)物中觀察到。此時，指示諸如中內(nèi)胚層、原始內(nèi)胚層、定形內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的其它細胞類型的標志物(參見表I)的表達依然相對較低。一些實施方案中，指示中內(nèi)胚層、原始內(nèi)胚層、定形內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的標志物在hESC接觸分化因子后6小時時不顯著表達。FGF8 mRNA的表達在hESC接觸分化因子后至少約24小時維持高水平，但是其后開始下降。此外，hESC接觸諸如活化素A的合適的分化因子后17小時，通過免疫細胞化學觀察到β_連接素多肽的細胞核定位(細胞核定位的連接素的表達)。hESC中，該β-連接素多肽存在于細胞外周但不在細胞核中。應(yīng)當理解，根據(jù)分化條件，在前原條細胞內(nèi)誘導不同水平范圍的FGF8和細胞核定位的β連接素的表達。這樣，在本發(fā)明一些實施方案中，在hESC分化的最初6至18小時內(nèi),FGF8標志物和/或核定位的β -連接素標志物在前原條細胞或細胞群的表達比這些標志物在非前原條細胞或細胞群中的表達至少高約2倍至至少高約10，000倍。其它實施方案中，在hESC分化的最初6至18小時內(nèi)，F(xiàn)GF8標志物和/或核定位的β -連接素標志物在前原條細胞或細胞群的表達比FGF8標志物和/或核定位的β -連接素標志物在非前原條細胞或細胞群中的表達高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15 倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍、 至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約7500 倍或至少約10，000倍。一些實施方案中，在hESC分化的最初6至18小時內(nèi)，F(xiàn)GF8標志物和/或核定位的β -連接素標志物在前原條細胞或細胞群的表達無限地高于FGF8標志物和/或細胞核定位的β連接素標志物在非前原條細胞或細胞群中的表達。還應(yīng)當理解，在前原條細胞內(nèi)，F(xiàn)GF8標志物的表達水平與brachyury、FGF4、 SNAI1、S0X17、F0XA2、S0X7和/或SOXl標志物的表達水平存在差異范圍。類似地，在前原條細胞內(nèi)，核定位的β -連接素標志物的表達水平與brachyury、FGF4、SNAI1、S0X17、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標志物的表達水平存在差異范圍。類似地，在本發(fā)明一些實施方案中，F(xiàn)GF8 標志物和/或核定位的β -連接素標志物的表達比brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標志物的表達高至少約2倍至至少約10，000倍。其它實施方案中，F(xiàn)GF8 標志物和/或核定位的β -連接素標志物的表達比brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標志物的表達高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約 200倍、至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約 7500 倍或至少約 10，000 倍。一些實施方案中，brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標志物在前原條細胞內(nèi)不顯著表達。前原條細胞的富集、分離和/或純化關(guān)于本發(fā)明方法的其它方面，前原條細胞可被富集、分離和/或純化。一些實施方案中，通過從細胞培養(yǎng)物中分離此類細胞制備富集前原條細胞的細胞群。本文所述方法的一些實施方案中，前原條細胞被熒光標記，然后通過熒光活化細胞分選器(FACS)將其從未標記細胞中分離。這些實施方案中，編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸或編碼可表達突光標志物的其它核酸被用于標記前原條細胞。例如，一些實施方案中， 至少一個拷貝的編碼GFP或其生物活性片段的核酸被引入多能性細胞中，優(yōu)選為人胚胎干細胞，該核酸位于FGF8啟動子下游，使得GFP基因產(chǎn)物或其生物活性片段的表達處于FGF8 啟動子的控制之下。一些實施方案中，編碼FGF8的核酸的全部編碼區(qū)被編碼GFP或其生物活性片段的核酸替換。其它實施方案中，編碼GFP或其生物活性片段的核酸與至少部分 FGF8的核酸同框融合，因而提供融合蛋白。這些實施方案中，該融合蛋白保持與GFP類似的熒光活性。熒光標記的細胞，如上述的多能性細胞，分化為如之前所述的前原條細胞。因為前原條細胞表達熒光標志物基因，而非前原條細胞不表達，因此這兩種細胞類型可被分開。一些實施方案中，包含熒光標記的前原條細胞和未標記的非前原條細胞的懸浮培養(yǎng)物用FACS 分選。前原條細胞被從非前原條細胞分離收集，因而造成所述細胞類型的分離。如果需要的話，分離的細胞組合物可通過更多輪的分選被進一步純化，該分選使用特異針對前原條細胞的相同或不同標志物。除所述方法之外，可通過其它細胞分離技術(shù)分離前原條細胞。此外，可通過在特定生長條件下連續(xù)次培養(yǎng)(subculture)的方法富集或分離前原條細胞，該特定生長條件促進前原條細胞的選擇性存活或選擇性生長。應(yīng)該理解，上述的富集、分離和純化方法可用于任何分化階段的培養(yǎng)物。使用本文所述方法，前原條細胞和/或組織的富集的、分離的和/或純化的群可體外自hESC培養(yǎng)物或細胞群制備，該hESC培養(yǎng)物或細胞群經(jīng)歷約I小時至約24小時的分化。 一些實施方案中，所述細胞進行隨機分化。但在優(yōu)選實施方案中，所述細胞被定向主要分化為前原條細胞。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外產(chǎn)生始于人胚胎干細胞的前原條細胞。使用本文所述方法，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，細胞群或細胞培養(yǎng)物中前原條細胞的含量可被富集至少約2倍至約1000倍。在一些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，前原條細胞可被富集至少約5倍至約500倍。在其它實施方案中， 與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，前原條細胞可被富集至少約10倍至約200倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，前原條細胞可被富集至少約20倍至約100倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，前原條細胞可被富集至少約40倍至約80倍。在某些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，前原條細胞可被富集至少約2倍至約20倍。包含前原條細胞的組合物上述方法產(chǎn)生的細胞組合物包括包含前原條細胞的細胞培養(yǎng)物和富集前原條細胞的細胞群。例如，能夠產(chǎn)生包含前原條細胞的細胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約5-90% 的細胞是前原條細胞。因為可通過調(diào)整某些參數(shù)(這些參數(shù)包括但不限于，細胞生長條件、 生長因子濃度和培養(yǎng)步驟的時間安排)來調(diào)整分化方法的效率，本文所述的分化方法可導致約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或超過約95%的
多能性細胞向前原條細胞的轉(zhuǎn)化。在使用分離前原條細胞的方法中，可回收基本上純的前原條細胞群。本發(fā)明的一些實施方案涉及包含諸如干細胞的多能性細胞和前原條細胞的組合物，例如細胞群和細胞培養(yǎng)物。例如，用本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生包含hESC和前原條細胞的混合物的組合物。一些實施方案中，產(chǎn)生包含約每95個多能性細胞對應(yīng)至少約5個前原條細胞的組合物。其它實施方案中，產(chǎn)生包含約每5個多能性細胞對應(yīng)至少約95個前原條細胞的組合物。此外，預(yù)期可以得到包含前原條細胞和多能性細胞其他比例的組合物。例如， 預(yù)期可以得到包含至少約I個前原條細胞對應(yīng)約每1，000, 000個多能性細胞、至少約I個前原條細胞對應(yīng)約每100，000個多能性細胞、至少約I個前原條細胞對應(yīng)約每10，000個多能性細胞、至少約I個前原條細胞對應(yīng)約每1000個多能性細胞、至少約I個前原條細胞對應(yīng)約每500個多能性細胞、至少約I個前原條細胞對應(yīng)約每100個多能性細胞、至少約I個前原條細胞對應(yīng)約每10個多能性細胞、至少約I個前原條細胞對應(yīng)約每5個多能性細胞、 至少約I個前原條細胞對應(yīng)約每2個多能性細胞、至少約2個前原條細胞對應(yīng)約每I個多能性細胞、至少約5個前原條細胞對應(yīng)約每I個多能性細胞、至少約10個前原條細胞對應(yīng)約每I個多能性細胞、至少約20個前原條細胞對應(yīng)約每I個多能性細胞、至少約50個前原條細胞對應(yīng)約每I個多能性細胞、至少約100個前原條細胞對應(yīng)約每I個多能性細胞、至少約 1000個前原條細胞對應(yīng)約每I個多能性細胞、至少約10，000個前原條細胞對應(yīng)約每I個多能性細胞、至少約100，000個前原條細胞對應(yīng)約每一個多能性細胞、以及至少約1，000, 000 個前原條細胞對應(yīng)約每I個多能性細胞的組合物。一些實施方案中，該多能性細胞是人多能干細胞。某些實施方案中，該干細胞衍生自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團或胚胎生殖嵴。某些其他實施方案中，該多能性細胞衍生自發(fā)育已經(jīng)越過胚胎期的多細胞結(jié)構(gòu)的性腺組織或生殖組織。本發(fā)明的一些實施方案涉及包含從至少約5%前原條細胞到至少約99%前原條細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群。一些實施方案中，該細胞培養(yǎng)物或細胞群包含哺乳動物細胞。 優(yōu)選實施方案中，該細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人細胞。例如，某些特定實施方案涉及含有人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中從至少約5%到至少約99%的人類細胞是前原條細胞。其它實施方案涉及含有人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約 20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或多于99 %的人細胞是前原條細胞。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的人飼養(yǎng)細胞。本發(fā)明的其它實施方案涉及包含諸如人前原條細胞的人細胞的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中至少約5%的人細胞中FGF8標志物和/或核定位的β -連接素標志物的表達高于brachyury、FGF4、SNAIl、S0X17、F0XA2、S0X7和/或SOXl標志物的表達。其他實施方案中，至少約10%的人細胞中、至少約15%的人細胞中、至少約20%的人細胞中、 至少約25%的人細胞中、至少約30%的人細胞中、至少約35%的人細胞中、至少約40%的人細胞中、至少約45%的人細胞中、至少約50%的人細胞中、至少約55%的人細胞中、至少約60 %的人細胞中、至少約65%的人細胞中、至少約70%的人細胞中、至少約75 %的人細胞中、至少約80%的人細胞中、至少約85%的人細胞中、至少約90%的人細胞中、至少95% 的人細胞中、至少98 %的人細胞中、至少99 %的人細胞中或多于99 %的人細胞中，F(xiàn)GF8或核定位的β -連接素標志物的表達高于brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、F0XA2、S0X7和/ 或SOXl標志物的表達。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的人飼養(yǎng)細胞。本發(fā)明的其它實施方案涉及包含人hESC和人前原條細胞的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中在細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞中，F(xiàn)GF8mRNA表達的顯著上調(diào)發(fā)生在使培養(yǎng)物中的hESC與諸如活化素A的適當分化因子接觸后約I小時、約2小時、約3小時、約 4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20 小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時或晚于約24小時。這些實施方案中， FGF8 mRNA表達的顯著上調(diào)發(fā)生在至少約5%的人細胞中、至少約10%的人細胞中、至少約 15%的人細胞中、至少約20%的人細胞中、至少約25%的人細胞中、至少約30%的人細胞中、至少約35%的人細胞中、至少約40%的人細胞中、至少約45%的人細胞中、至少約50% 的人細胞中、至少約55%的人細胞中、至少約60%的人細胞中、至少約65%的人細胞中、至少約70%的人細胞中、至少約75%的人細胞中、至少約80%的人細胞中、至少約85%的人細胞中、至少約90%的人細胞中、至少95%的人細胞中、至少98%的人細胞中、至少99%的人細胞中或多于99%的人細胞中。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞， 計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的人飼養(yǎng)細胞。本發(fā)明的其它實施方案涉及包含人hESC和人前原條細胞的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中在細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞中，連接素多肽的顯著細胞核定位 (核定位的β_連接素標志物的表達)發(fā)生在使培養(yǎng)物中的hESC與諸如活化素A的適當分化因子接觸后約I小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8 小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16 小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約 24小時或晚于約24小時。這些實施方案中，核定位的連接素的表達發(fā)生在至少約5% 的人細胞中、至少約10%的人細胞中、至少約15%的人細胞中、至少約20%的人細胞中、至少約25%的人細胞中、至少約30%的人細胞中、至少約35%的人細胞中、至少約40%的人細胞中、至少約45%的人細胞中、至少約50%的人細胞中、至少約55%的人細胞中、至少約 60%的人細胞中、至少約65%的人細胞中、至少約70%的人細胞中、至少約75%的人細胞中、至少約80%的人細胞中、至少約85%的人細胞中、至少約90%的人細胞中、至少95%的人細胞中、至少98%的人細胞中、至少99%的人細胞中或多于99%的人細胞中。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的人飼養(yǎng)細胞。使用本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生包含基本上不含其它細胞類型的前原條細胞的組合物。本發(fā)明的一些實施方案中，通過本發(fā)明方法制備的前原條細胞群或細胞培養(yǎng)物基本上不含顯著表達brachyury、FGF4、SNAII、S0X17、F0XA2、S0X7和/或SOXl標志物基因的細胞。
—個實施方案中，基于標志物基因表達的前原條細胞的描述是FGF8高、核定位的 β -連接素高、brachyury 低、FGF4 低、SNAIl 低、SOX17 低、F0XA2 低、S0X7 低和 SOXl 低。從多能細胞產(chǎn)生中內(nèi)胚層細胞一些產(chǎn)生中內(nèi)胚層細胞的方法中，作為起始材料的多能性細胞是干細胞。某些方法中，從胚胎干細胞產(chǎn)生包含中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和富集的細胞群。優(yōu)選的衍生中內(nèi)胚層細胞的方法利用人胚胎干細胞作為產(chǎn)生中內(nèi)胚層細胞的起始材料。這些多能性細胞可以是起源于桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團或從胚胎生殖嵴獲得的細胞。使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，人胚胎干細胞可在培養(yǎng)基中保持多能性狀態(tài)而基本不分化。所述的方法在諸如美國專利第 5，453，357,5, 670，372,5, 690，926,5, 843，780,6, 200，806 及 6，251，671 號中有所描述，其公開在此整體引入，以供參考。在產(chǎn)生中內(nèi)胚層細胞的一些方法中，將hESC維持在滋養(yǎng)層上。在這些方法中，可以使用任何能夠使hESC保持在多能性狀態(tài)的滋養(yǎng)層。一種常用的培養(yǎng)人胚胎干細胞的滋養(yǎng)層為一層小鼠成纖維細胞。最近，人成纖維細胞滋養(yǎng)層也已開發(fā)出來用于培養(yǎng)hESC(參見第2002/0072117號美國專利申請，其公開在此整體引入，以供參考)。制備中內(nèi)胚層細胞的其它方法允許不使用滋養(yǎng)層保持多能hESC。在沒有滋養(yǎng)層的條件下保持多能性hESC的方法已在第2003/0175956號美國專利申請中有描述，其公開在此整體引入，以供參考。本發(fā)明使用的人胚胎干細胞可以保持在含有或不含有血清的培養(yǎng)基中。在一些胚胎干細胞保持方法中，使用血清替代品。其它方法中，使用無血清培養(yǎng)技術(shù)，例如美國專利申請第2003/0190748號所述的方法，其公開在此整體引入，以供參考。在培養(yǎng)物中保持多能性狀態(tài)的干細胞按照常規(guī)傳代，直到分化為中內(nèi)胚層細胞。 在一些實施方案中，通過向干細胞培養(yǎng)物中加入諸如TGFβ超家族生長因子的分化因子完成向中內(nèi)胚層細胞的分化，其加入的量足以促進向中內(nèi)胚層細胞的分化。用于制備中內(nèi)胚層細胞的TGFii超家族生長因子選自Nodal/活化素亞組。在一些優(yōu)選的分化方法中，生長因子選自Nodal、活化素A和活化素B。某些分化方法中，使用生長因子活化素A。關(guān)于從多能性干細胞向中內(nèi)胚層細胞分化的一些方法，向細胞提供上述生長因子，使其在培養(yǎng)基中的濃度足以促進至少一部分干細胞分化為中內(nèi)胚層細胞。在一些方法中，上述生長因子在細胞培養(yǎng)物中存在的濃度為至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約 300ng/ml、至少約 400ng/ml、至少約 500ng/ml、至少約 1000ng/ml、至少約 2000ng/ml、至少約 3000ng/ml、至少約 4000ng/ml、至少約 5000ng/ml 或大于 5000ng/ml。在使多能性干細胞向中內(nèi)胚層細胞分化的某些方法中，上述生長因子加入細胞培養(yǎng)物后從細胞培養(yǎng)物中除去。例如，可以在約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、 約22小時、約23小時、約24小時、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約37 小時、約38小時、約39小時、約40小時、約41小時、約42小時、約43小時、約44小時、約 45小時、約46小時、約47小時、約48小時或約多于48小時之內(nèi)除去生長因子?？稍诤袦p量血清或不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)中內(nèi)胚層細胞的培養(yǎng)物。在某些培養(yǎng)條件下,血清的濃度范圍為約0% (v/v)至約10% (ν/ν) ο例如，在一些分化方法中，培養(yǎng)基中血清的濃度可以低于約0.05% (v/v)、低于約0. I % (v/v)、低于約0. 2% (v/v)、低于約 O. 3% (v/v)、低于約 O. 4% (v/v)、低于約 O. 5% (v/v)、低于約 O. 6% (v/v)、低于約 O. 7% (v/v)、低于約O. 8% (v/v)、低于約O. 9% (v/v)、低于約1% (v/v)、低于約2% (v/v)、低于約3% (v/v)、低于約4% (v/v)、低于約5% (v/v)、低于約6% (v/v)、低于約7% (v/v)、低于約8% (v/v)、低于約9% (v/v)或低于約10% (ν/ν) ο 一些方法中，中內(nèi)胚層細胞在無血清或無血清替代物下生長。在其它方法中，中內(nèi)胚層細胞在B27存在下生長。在這些方法中，B27添加物的濃度范圍為約O. 1% (v/v)至約20% (v/v)。監(jiān)測多能性細胞向中內(nèi)胚層細胞的分化可以通過確定中內(nèi)胚層細胞特征性標志物的時間性表達來監(jiān)測hESC培養(yǎng)物向中內(nèi)胚層細胞的進行。一些方法中，某些標志物的表達可通過檢測是否存在該標志物來確定。 或者，某些標志物的表達可通過測量該標志物在加入分化因子后的一個或多個時間點在細胞培養(yǎng)物或細胞群細胞中存在的水平來確定。在這些方法中，可以定性或定量測定標志物的表達。定量標志物基因產(chǎn)生的標志物表達的一種方法是通過使用Q-PCR。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法定量標志物基因的表達。例如，可以通過使用對所關(guān)注的標志物基因產(chǎn)物特異的抗體來檢測標志物基因產(chǎn)物的表達。某些方法中，確定中內(nèi)胚層細胞的特征性標志物基因的表達以及hESC和其它細胞類型的特征性標志物基因的顯著表達的缺乏。其它方法中，測定加入分化因子后的一個或多個時間點時，中內(nèi)胚層細胞的特征性標志物基因表達的時間性和數(shù)量。如以下實施例進一步所述，中內(nèi)胚層細胞的標志物為brachyury、FGF4和SNAI1。 同樣地，用本發(fā)明所述方法制備的中內(nèi)胚層細胞表達brachyury、FGF4和SNAIl標志物基因，因此產(chǎn)生brachyury、FGF4和SNAIl標志物基因產(chǎn)物。一些實施方案中,brachyury、FGF4 和SNAIlmRNA在中內(nèi)胚層細胞中但不在hESC中顯著表達。在使hESC與諸如活化素A的適當分化因子接觸后24小時，可在分化中的hESC培養(yǎng)物中觀察到brachyury、FGF4和SNAIl mRNA的顯著上調(diào)，直至接近峰值。這時，指示諸如原始內(nèi)胚層、定形內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的其它細胞類型(參見表I)的某些標志物的表達依然相對較低。一些實施方案中，指示原始內(nèi)胚層、定形內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的某些標志物在使hESC與分化因子接觸后24小時不顯著表達。一些實施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl mRNA的表達在使hESC與分化因子接觸后24小時之后開始下降。一些實施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl mRNA的表達在使hESC與分化因子接觸后約30小時、約36小時、約42小時、約48小時或晚于約48小時之后開始下降。應(yīng)當理解,可根據(jù)分化條件誘導不同水平的brachyury、FGF4和/或SNAIl在中內(nèi)胚層細胞中的表達。由此，本發(fā)明的一些實施方案中，在從hESC開始分化約24小時之后， brachyury、FGF4和/或SNAIl標志物在中內(nèi)胚層細胞或細胞群中的表達比這些標志物在非中內(nèi)胚層細胞或細胞群中的表達高至少約2倍至至少約10，000倍。其它實施方案中，在從hESC開始分化約24小時之后，brachyury、FGF4和/或SNAIl標志物在中內(nèi)胚層細胞或細胞群中的表達比這些標志物在非中內(nèi)胚層細胞或細胞群中的表達高至少約4倍、高至少約6倍、高至少約8倍、高至少約10倍、高至少約15倍、高至少約20倍、高至少約40倍、高至少約80倍、高至少約100倍、高至少約150倍、高至少約200倍、高至少約500倍、高至少約750倍、高至少約1000倍、高至少約2500倍、高至少約5000倍、高至少約7500倍或高至少約10，000倍。一些實施方案中，在從hESC開始分化約24小時之后，brachyury、FGF4和/或SNAIl標志物在中內(nèi)胚層細胞或細胞群中的表達無限地高于brachyury、FGF4和/或 SNAIl標志物在非中內(nèi)胚層細胞或細胞群中的表達。另外，應(yīng)當理解,在中內(nèi)胚層細胞內(nèi)，brachyury、FGF4和/或SNAIl標志物的表達水平與0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標志物的表達水平存在差異范圍。 類似地，在本發(fā)明一些實施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl標志物的表達比0CT4、 S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標志物的表達高至少約2倍至至少約10，000倍。其它實施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl標志物的表達比0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、 S0X7和/或SOXl標志物的表達高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約 200倍、至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約7500倍或至少約10，000倍。在一些實施方案中，0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/ 或SOXl標志物在中內(nèi)胚層細胞中不顯著表達。中內(nèi)胚層細胞的富集、分離和/或純化關(guān)于本發(fā)明方法的其它方面，可以富集、分離和/或純化中內(nèi)胚層細胞。在一些實施方案中，通過從細胞培養(yǎng)物中分離中內(nèi)胚層細胞產(chǎn)生富集中內(nèi)胚層細胞的細胞群。本發(fā)明方法的一些實施方案中，突光標記中內(nèi)胚層細胞，然后使用FACS從未標記的細胞中將其分離。這些實施方案中，使用編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸或編碼可表達的突光標志物基因的另一核酸標記中內(nèi)胚層細胞。例如，在一些實施方案中，向優(yōu)選為人胚胎干細胞的多能性細胞中引入編碼GFP或其生物活性片段的至少一個拷貝的核酸，該編碼GFP或其生物活性片段的至少一個拷貝的核酸位于brachyury、FGF4和SNAIl啟動子的下游，使得其處于brachyury、FGF4和SNAIl啟動子的控制之下。在一些實施方案中，編碼 brachyury、FGF4或SNAIl的核酸的全部編碼區(qū)被編碼GFP或其生物活性片段的核酸替代。 在其它實施方案中，編碼GFP或其生物活性片段的核酸與至少部分編碼brachyury、FGF4或 SNAIl的核酸同框融合，從而產(chǎn)生融合蛋白。這些實施方案中，該融合蛋白保留了與GFP相似的熒光活性。例如上述多能性細胞的熒光標記的細胞如前所述地分化為中內(nèi)胚層細胞。因為中內(nèi)胚層細胞表達熒光標志物基因而非中內(nèi)胚層細胞不表達，這兩類細胞可被分開。在一些實施方案中，使用FACS分選包含突光標記的中內(nèi)胚層細胞和未標記的非中內(nèi)胚層細胞混合物的細胞懸浮培養(yǎng)物。中內(nèi)胚層細胞被從非中內(nèi)胚層細胞中分離收集，從而導致這些細胞類型的分離。如果需要的話，分離的細胞組合物可通過更多輪的分選被進一步純化，該分選使用特異針對中內(nèi)胚層細胞的相同或不同標志物。除上述的方法之外，還可以通過細胞分離的其它技術(shù)分離中內(nèi)胚層細胞。另外，還可以通過特定生長條件下連續(xù)次培養(yǎng)的方法富集或分離中內(nèi)胚層細胞，該特定生長條件促進中內(nèi)胚層細胞的選擇性存活或選擇性生長。
應(yīng)該理解，上述的富集、分離和純化方法可用于任何分化階段的培養(yǎng)物。使用本文所述方法，富集的、分離的和/或純化的中內(nèi)胚層細胞群和/或組織可體外自hESC培養(yǎng)物或細胞群制備，該hESC培養(yǎng)物或細胞群經(jīng)歷約18小時至約48小時的分化。一些實施方案中，所述細胞進行隨機分化。但在優(yōu)選的實施方案中，所述細胞被定向為主要分化為中內(nèi)胚層細胞。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外產(chǎn)生始于人胚胎干細胞的中內(nèi)胚層細胞。使用本文所述方法，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，細胞群或細胞培養(yǎng)物中中內(nèi)胚層細胞的含量可被富集至少約2倍至約1000倍。在一些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細胞可被富集至少約5倍至約500倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細胞可被富集至少約10倍至約200 倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細胞可被富集至少約20倍至約100倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細胞可被富集至少約40倍至約80倍。在某些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，中內(nèi)胚層細胞可被富集至少約2倍至約20倍。包含中內(nèi)胚層細胞的組合物上述方法產(chǎn)生的細胞組合物包括包含中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和富集中內(nèi)胚層細胞的細胞群。例如，能夠產(chǎn)生包含中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約 5-90%的細胞是中內(nèi)胚層細胞。因為可通過調(diào)整某些參數(shù)(這些參數(shù)包括但不限于，細胞生長條件、生長因子濃度和培養(yǎng)步驟的時間安排)來調(diào)整分化方法的效率，本文所述的分化方法可導致約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、 約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%或超過約95 %的多能性細胞向中內(nèi)胚層細胞的轉(zhuǎn)化。在使用分離中內(nèi)胚層細胞的方法中，可回收基本上純的中內(nèi)胚層細胞群。本發(fā)明的一些實施方案涉及包含諸如干細胞的多能性細胞和中內(nèi)胚層細胞的組合物，例如細胞群和細胞培養(yǎng)物。例如，用本發(fā)明的方法可以制備包含hESC和中內(nèi)胚層細胞的混合物的組合物。一些實施方案中,產(chǎn)生包含至少約5個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每95個多能性細胞的組合物。其它實施方案中，產(chǎn)生包含至少約95個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每5個多能性細胞的組合物。此外，預(yù)期可以得到包含中內(nèi)胚層細胞和多能細胞其他比例的組合物。例如，預(yù)期可以得到包含至少約I個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每1，000, 000個多能性細胞、 至少約I個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每100,000個多能性細胞、至少約I個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每10，000個多能性細胞、至少約I個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每1000個多能性細胞、至少約
I個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每500個多能細胞、至少約I個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每100個多能細胞、至少約I個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每10個多能細胞、至少約I個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每5個多能細胞、至少約I個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每2個多能細胞、至少約2個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I個多能細胞、至少約5個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I個多能細胞、至少約10個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I個多能細胞、至少約20個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I個多能細胞、 至少約50個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I個多能細胞、至少約100個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I 個多能細胞、至少約1000個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I個多能細胞、至少約10，000個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I個多能細胞、至少約100，000個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I個多能細胞、以及至少約1，000，000個中內(nèi)胚層細胞對應(yīng)約每I個多能細胞的組合物。一些實施方案中， 該多能性細胞是人多能性干細胞。某些實施方案中，該干細胞衍生自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團或胚胎生殖嵴。某些其他實施方案中，該多能性細胞衍生自發(fā)育已經(jīng)越過胚胎期的多細胞結(jié)構(gòu)的性腺組織或生殖組織。本發(fā)明的一些實施方案涉及包含從至少約5%的中內(nèi)胚層細胞到至少約99%的中內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群。一些實施方案中，該細胞培養(yǎng)物或細胞群包含哺乳動物細胞。優(yōu)選實施方案中，該細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人細胞。例如，某些特定實施方案涉及含有人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中從至少約5%到至少約99%的人細胞是中內(nèi)胚層細胞。其它實施方案涉及含有人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中至少約5%、至少約10%、至少約 15%,至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或多于99%的人類細胞是中內(nèi)胚層細胞。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的人飼養(yǎng)細胞。本發(fā)明的其它實施方案涉及包含諸如人中內(nèi)胚層細胞的人細胞的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中至少約5%的人細胞中brachyury、FGF4和/或SNAIl標志物的表達高于0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標志物的表達。其他實施方案中，至少約10%的人細胞中、至少約15%的人細胞中、至少約20%的人細胞中、至少約25%的人細胞中、至少約30%的人細胞中、至少約35%的人細胞中、至少約40%的人細胞中、至少約 45%的人細胞中、至少約50%的人細胞中、至少約55%的人細胞中、至少約60%的人細胞中、至少約65%的人細胞中、至少約70%的人細胞中、至少約75%的人細胞中、至少約80% 的人細胞中、至少約85%的人細胞中、至少約90%的人細胞中、至少95%的人細胞中、至少 98%的人細胞中、至少99%的人細胞中或多于99%的人細胞中，brachyury、FGF4和/或 SNAIl標志物的表達高于0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標志物的表達。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的人飼養(yǎng)細胞。本發(fā)明的其它實施方案涉及包含人hESC和人中內(nèi)胚層細胞的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中在細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞中，brachyury, FGF4和/或SNAIl mRNA表達的顯著上調(diào)發(fā)生在使培養(yǎng)物中的hESC與諸如活化素A的適當分化因子接觸后約 18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、約25小時、 約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約37小時、約38小時、約39小時、約40小時、約41 小時、約42小時、約43小時、約44小時、約45小時、約46小時、約47小時、約48小時或晚于約48小時。這些實施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAIl mRNA表達的顯著上調(diào)發(fā)生在至少約5%的人細胞中、至少約10%的人細胞中、至少約15%的人細胞中、至少約20% 的人細胞中、至少約25%的人細胞中、至少約30%的人細胞中、至少約35%的人細胞中、至少約40%的人細胞中、至少約45%的人細胞中、至少約50%的人細胞中、至少約55%的人細胞中、至少約60%的人細胞中、至少約65%的人細胞中、至少約70%的人細胞中、至少約 75 %的人細胞中、至少約80 %的人細胞中、至少約85%的人細胞中、至少約90 %的人細胞中、至少95%的人細胞中、至少98%的人細胞中、至少99%的人細胞中或多于99%的人細胞中。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的人飼養(yǎng)細胞。使用本發(fā)明的方法，可以制備包含基本上不含其它細胞類型的中內(nèi)胚層細胞的組合物。本發(fā)明的一些實施方案中，通過本發(fā)明方法制備的中內(nèi)胚層細胞群或細胞培養(yǎng)物基本上不含顯著表達0CT4、S0X17、CXCR4、F0XA2、S0X7和/或SOXl標志物基因的細胞。—個實施方案中，基于標志物基因表達的中內(nèi)胚層細胞的描述是brachyury高、 FGF4 高、SNAIl 高、S0X17 低、CXCR4 低、F0XA2 低、S0X7 低和 SOXl 低。定形內(nèi)胚層細胞的產(chǎn)生下文簡述分化多能性細胞產(chǎn)生包含定形內(nèi)胚層的細胞培養(yǎng)物和富集的細胞群的方法，在于2004年12月23日提交的題為DEFINITIVE END0DERM(定形內(nèi)胚層)的第 11/021，618號美國專利中詳細描述了該方法，其公開內(nèi)容在此整體并入以供參考。一些制備定形內(nèi)胚層細胞的方法中，作為起始材料的多能性細胞是干細胞。某些方法中，從胚胎干細胞產(chǎn)生包含定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和富集的細胞群。優(yōu)選的衍生定形內(nèi)胚層細胞的方法利用人胚胎干細胞作為產(chǎn)生定形內(nèi)胚層的起始材料。這些多能性細胞可以是起源于桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團或從胚胎生殖嵴獲得的細胞。使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，人胚胎干細胞可在培養(yǎng)基中保持多能性狀態(tài)而基本不分化。所述的方法在諸如美國專利第 5，453，357,5, 670，372,5, 690，926,5, 843，780,6, 200，806 及 6，251，671 號中有所描述，其公開在此整體引入，以供參考。在產(chǎn)生定形內(nèi)胚層細胞的一些方法中，將hESC保持在滋養(yǎng)層上。在這些方法中，可以使用任何能夠使hESC保持在多能性狀態(tài)的滋養(yǎng)層。一種常用的培養(yǎng)人胚胎干細胞的滋養(yǎng)層為一層小鼠成纖維細胞。最近，人成纖維細胞滋養(yǎng)層也已開發(fā)出來用于培養(yǎng) hESC(參見第2002/0072117號美國專利申請，其公開在此整體引入，以供參考)。制備定形內(nèi)胚層細胞的其它方法允許不使用滋養(yǎng)層保持多能性hESC。在沒有滋養(yǎng)層的條件下保持多能性hESC的方法已在第2003/0175956號美國專利申請中有描述，其公開在此整體引入，以供參考。本發(fā)明使用的人胚胎干細胞可以保持在含有或不含有血清的培養(yǎng)基中。在一些胚胎干細胞保持方法中，使用血清替代品。其它方法中，使用無血清培養(yǎng)技術(shù)，例如美國專利申請第2003/0190748號所述的方法，其公開在此整體引入，以供參考。在培養(yǎng)物中保持多能性狀態(tài)的干細胞按照常規(guī)傳代，直到分化為定形內(nèi)胚層。在一些方法中，通過向干細胞培養(yǎng)物中加入諸如TGFii超家族生長因子的分化因子完成向定形內(nèi)胚層的分化，其加入的量足以促進向定形內(nèi)胚層細胞的分化。可用于制備定形內(nèi)胚層的TGFii超家族生長因子選自Nodal/活化素亞組。在一些優(yōu)選的分化方法中，生長因子選自Nodal、活化素A和活化素B。某些分化方法中，可以使用任何上述生長因子的組合。關(guān)于從多能性干細胞向定形內(nèi)胚層細胞分化的一些方法，向細胞提供上述生長因子，使其在培養(yǎng)基中的濃度足以促進至少一部分干細胞分化為定形內(nèi)胚層細胞。在一些方法中，上述生長因子在細胞培養(yǎng)物中存在的濃度為至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約 300ng/ml、至少約 400ng/ml、至少約 500ng/ml、至少約 1000ng/ml、至少約 2000ng/ml、至少約 3000ng/ml、至少約 4000ng/ml、至少約 5000ng/ml 或大于約 5000ng/ml。在使多能性干細胞向定形內(nèi)胚層細胞分化的某些方法中，上述生長因子加入細胞培養(yǎng)物后從細胞培養(yǎng)物中除去。例如，可以在加入后約I天、約2天、約3天、約4天、約5 天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天除去生長因子。在優(yōu)選的方法中，在加入后約 4天除去生長因子。
可在含有減量血清或不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)定形內(nèi)胚層細胞的培養(yǎng)物。在某些培養(yǎng)條件下，血清的濃度范圍為約O. 05% (v/v)至約20% (v/v)。例如，在一些分化方法中，培養(yǎng)基中血清的濃度可以低于約O. 05% (v/v)、低于約O. I % (v/v)、低于約O. 2% (v/ V)、低于約 O. 3% (v/v)、低于約 O. 4% (v/v)、低于約 O. 5% (v/v)、低于約 O. 6 % (v/v)、低于約O. 7% (v/v)、低于約O. 8% (v/v)、低于約O. 9% (v/v)、低于約1% (v/v)、低于約2% (v/v)、低于約3% (v/v)、低于約4% (v/v)、低于約5% (v/v)、低于約6% (v/v)、低于約7% (v/v)、低于約8% (v/v)、低于約9% (v/v)、低于約10% (v/v)、低于約15% (v/v)或低于約20% (v/v) 0 一些方法中，定形內(nèi)胚層細胞在無血清或無血清替代物下生長。一些實施方案中，定形內(nèi)胚層細胞在有血清替代物下生長。在其它方法中，定形內(nèi)胚層細胞在B27存在下生長。在這些方法中，B27添加物的濃度范圍為約O. 1% (v/v)至約20% (v/v)。監(jiān)測多能性細胞向定形內(nèi)胚層細胞的分化 可以通過測定定形內(nèi)胚層特征性標志物的表達來監(jiān)測hESC培養(yǎng)物向定形內(nèi)胚層的進行。一些方法中，某些標志物的表達可通過檢測是否存在該標志物來確定?；蛘?，某些標志物的表達可通過測量該標志物在細胞培養(yǎng)物或細胞群細胞中存在的水平來確定。在這些方法中，可以定性或定量測定標志物的表達。定量標志物基因產(chǎn)生的標志物表達的一種方法是通過使用Q-PCR。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法定量標志物基因的表達。例如， 可以通過使用對所關(guān)注的標志物基因產(chǎn)物特異的抗體來檢測標志物基因產(chǎn)物的表達。某些方法中，確定定形內(nèi)胚層的特征性標志物基因的表達以及hESC和其它細胞類型的特征性標志物基因的顯著表達的缺乏。如以下實施例進一步所述，定形內(nèi)胚層的可靠標志物為S0X17基因。這樣，用本發(fā)明所述方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細胞表達S0X17標志物基因，因此產(chǎn)生S0X17基因產(chǎn)物。定形內(nèi)胚層的其它標志物為 MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQU CMKORl 和 CRIPl0因為定形內(nèi)胚層細胞表達S0X17標志物基因的水平高于表達S0X7標志物基因的水平，所以在一些方法中，既監(jiān)測S0X17又監(jiān)測S0X7的表達，S0X7是原始內(nèi)胚層和內(nèi)臟內(nèi)胚層的特征性標志物基因。其它方法中，既監(jiān)測S0X17標志物基因又監(jiān)測0CT4標志物基因的表達，0CT4是hESC的特征性標志物基因。另外，因為定形內(nèi)胚層細胞表達S0X17標志物基因的水平高于表達AFP、SPARC或血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)標志物基因的水平，所以還可以監(jiān)測這些基因的表達。定形內(nèi)胚層的另一標志物是CXCR4基因。CXCR4基因編碼配體為趨化吸引劑 SDF-I的細胞表面趨化因子受體。成體中具有CXCR4受體的細胞的主要作用被認為有造血細胞向骨髓的遷移、淋巴細胞傳輸以及各種B細胞和巨噬細胞血細胞譜系的分化[Kim， C.，and Broxmeyer, H. J. Leukocyte Biol. 65，6-15 (1999) ]。CXCR4 受體還作為 HIV-1 進入 T 細胞的共同受體[Feng, Y.，et al. Science, 272，872-877 (1996)]。在[McGrath, K.E.et al. Dev. Biology 213,442-456(1999)]進行的一系列廣泛研究中，描述了小鼠中趨化因子受體 CXCR4 及其獨特的配體 SDF-1 [Kim, C. , and Broxmeyer, H. J. Leukocyte Biol. 65,6-15(1999)]在早期發(fā)育和成體生活期間的表達。當證實轉(zhuǎn)基因小鼠中，CXCR4 和 SDF-1 的任意一個被破壞[Nagasawa et al. Nature, 382,635-638 (1996) ；Ma, Q.，et al Immunity, 10,463-471 (1999)]都導致晚期胚胎死亡時，發(fā)育中CXCR4/SDF-1的相互作用變得明顯。McGrath等人使用RNase保護和原位雜交方法證實CXCR4是在早期原腸胚(E7. 5)期間檢測到的最大量的趨化因子受體信使RNA。在原腸胚中，CXCR4/SDF-1信號看來主要涉及誘導原條胚層細胞的遷移，并且其在此時存在的定形內(nèi)胚層、中胚層和胚外中胚層表達。在E7. 2-7. 8小鼠胚胎中，CXCR4和甲胎蛋白互相排斥，表明其在內(nèi)臟內(nèi)胚層缺乏表達 [McGrath, K. E. et al. Dev. Biology 213,442-456(1999)]。因為通過分化多能性細胞制備的定形內(nèi)胚層細胞表達CXCR4標志物基因，所以為了追蹤定形內(nèi)胚層細胞的產(chǎn)生可以監(jiān)測CXCR4的表達。另外，用本發(fā)明方法制備的定形內(nèi)胚層細胞表達定形內(nèi)胚層的其它標志物，包括但不限于S0X17、MIXLU GATA4、HNF3b、GSC、 FGF17、VWF、CALCR、FOXQU CMKORl和CRIP1。因為定形內(nèi)胚層細胞表達CXCR4標志物基因的水平高于表達S0X7標志物基因的水平，所以可以既監(jiān)測CXCR4又監(jiān)測S0X7的表達。其它方法中，監(jiān)測CXCR4標志物基因和0CT4標志物基因的表達。另外，因為定形內(nèi)胚層細胞表達CXCR4標志物基因的水平高于表達AFP、SPARC或血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)標志物基因的水平，所以還可以監(jiān)測這些基因的表達。應(yīng)當理解，CXCR4在內(nèi)胚層細胞中的表達不排除S0X17的表達。由此，用本發(fā)明方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細胞將顯著表達S0X17和CXCR4，但不會顯著表達AFP、TM、SPARC或 PDXl。定形內(nèi)胚層細胞的富集、分離和/或純化可以使用對該細胞特異的親和標簽富集、分離和/或純化通過任何上述方法制備的定形內(nèi)胚層細胞。對定形內(nèi)胚層細胞特異的親和標簽的實例是對諸如多肽的標志物分子特異的抗體、配體或其它結(jié)合劑，該標志物分子存在于定形內(nèi)胚層細胞的細胞表面，但不在可在通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞培養(yǎng)物中找到的其它細胞類型上顯著存在。在一些方法中，結(jié)合CXCR4的抗體被用做富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細胞的親和標簽。在其它方法中，趨化因子SDF-I或基于SDF-I的其它分子也可以被用做親和標簽。這樣的分子包括但不限于SDF-I片段、SDF-I融和物或SDF-I模擬物。本領(lǐng)域已知制備抗體以及使用它們分離細胞的方法，這些方法可用于本文所述的抗體和定形內(nèi)胚層細胞。一種方法中，結(jié)合CXCR4的抗體被連接到磁珠上，然后使其在細胞培養(yǎng)物中與定形內(nèi)胚層細胞結(jié)合，該細胞培養(yǎng)物已經(jīng)過酶處理以減少細胞間及與基質(zhì)間的粘附。然后將該細胞/抗體/珠子復合體暴露于用于從未結(jié)合細胞中分離珠子結(jié)合的定形內(nèi)胚層細胞的活動磁場中。一旦定形內(nèi)胚層細胞與培養(yǎng)物的其它細胞物理分離，就破壞所述抗體結(jié)合，并且將定形內(nèi)胚層細胞再次接種在適當?shù)慕M織培養(yǎng)培養(yǎng)基中。也可以使用其它方法獲得富集的、分離的或純化的定形內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物或群。 例如，在一些實施方案中，CXCR4抗體與含有定形內(nèi)胚層的細胞培養(yǎng)物一起孵育，該細胞培養(yǎng)物已經(jīng)過酶處理以減少細胞間及與基質(zhì)間的粘附。然后清洗、離心并且再次懸浮這些細胞。然后該細胞懸浮物與諸如能夠結(jié)合所述初級抗體的FITC-偶聯(lián)抗體等二級抗體一起孵育。然后清洗、離心并且在緩沖液中再次懸浮這些細胞。然后使用熒光激活細胞分選儀 (FACS)分析和分選該細胞懸浮物。CXCR4-陽性細胞被從CXCR4-陰性細胞中分離收集，因此產(chǎn)生該細胞類型的分離。如果需要的話，分離的細胞組合物可通過更多輪的分選被進一步純化，該分選通過其它基于親和的方法或者使用特異針對定形內(nèi)胚層細胞的相同或不同標志物。在其它方法中，可以使用配體或與CXCR4結(jié)合的其它分子富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細胞。在一些實施方案中，該分子是SDF-I或其片段、融合物或模擬物。優(yōu)選的方法中，在誘導干細胞培養(yǎng)物向定形內(nèi)胚層譜系分化后，從其它非定形內(nèi)胚層細胞富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細胞。應(yīng)當理解，上述富集、分離和純化方法可用于處于分化任何階段的培養(yǎng)物。除了剛描述過的方法外，也可以使用其它細胞分離技術(shù)分離定形內(nèi)胚層細胞。另外，還可以通過特定生長條件下連續(xù)次培養(yǎng)的方法富集或分離定形內(nèi)胚層細胞，該特定生長條件促進定形內(nèi)胚層細胞的選擇性存活或選擇性生長。使用本發(fā)明的方法，富集的、分離的和/或純化的定形內(nèi)胚層細胞群和/或組織可在體外自多能性細胞培養(yǎng)物或細胞群產(chǎn)生，例如已經(jīng)經(jīng)歷至少一些分化的干細胞培養(yǎng)物或細胞群。在一些方法中，所述細胞進行隨機分化。但在優(yōu)選的方法中，所述細胞被定向主要分化為定形內(nèi)胚層細胞。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外產(chǎn)生始于人胚胎干細胞的定形內(nèi)胚層細胞。使用本發(fā)明的方法，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，細胞群或細胞培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層細胞的含量可被富集至少約2倍至約1000倍。包含定形內(nèi)胚層細胞的組合物上述方法產(chǎn)生的細胞組合物包括包含定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和富集定形內(nèi)胚層細胞的細胞群。例如，可以產(chǎn)生包含定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物，其中該細胞培養(yǎng)物或細胞群中至少約50-90%的細胞是定形內(nèi)胚層細胞。因為可通過調(diào)整某些參數(shù)(這些參數(shù)包括但不限于，細胞生長條件、生長因子濃度和培養(yǎng)步驟的時間安排)來調(diào)整分化方法的效率，本文所述的分化方法可導致約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、 約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85 %、約90 %、約95 %、約98 %、約99 %或超過約99 %的多能性細胞向定形內(nèi)胚層細胞轉(zhuǎn)化。在使用分離定形內(nèi)胚層細胞的方法中，例如通過使用與CXCR4受體結(jié)合的親和試劑，可回收基本上純的定形內(nèi)胚層細胞群。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的人飼養(yǎng)細胞。鑒定能夠促進前原條和/或中內(nèi)胚層分化的因子本發(fā)明的某些篩選方法涉及鑒定能夠促進前原條和/或中內(nèi)胚層細胞分化的至少一種分化因子的方法。這些方法的一些實施方案中，獲得包含諸如人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞的前原條和/或中內(nèi)胚層細胞的細胞群。然后向該細胞群提供候選分化因子。在第一時間點，其在提供候選分化因子之前或大約同時，確定標志物的表達。或者，可以在提供候選因子之后確定該標志物的表達。在第二時間點，其在第一時間點之后并且在向所述細胞群提供候選分化因子之后，再次確定相同標志物的表達。通過比較所述標志物在第一時間點的表達和所述標志物在第二時間點的表達，確定所述候選分化因子是否能夠促進定形內(nèi)胚層細胞的分化。如果所述標志物在第二時間點的表達比所述標志物在第一時間點的表達增加或減少，則所述候選分化因子能夠促進定形內(nèi)胚層細胞的分化。本發(fā)明篩選方法的一些實施方案使用包含人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞的細胞群或細胞培養(yǎng)物。例如，該細胞群可以是基本上純的人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞群?；蛘?，該細胞群可以是富集的人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞群，其中該細胞群中至少約90%、 至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約 97 %、至少約98 %、至少約99 %或多于至少約99 %的人細胞是人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞。本發(fā)明的其它實施方案中，所述細胞群包含人細胞，其中至少約10%、至少約15%、至少約20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、 至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80 %、至少約 85%或多于至少約85%的人細胞是人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞。其它實施方案中，所述細胞群包含非人細胞，例如非人飼養(yǎng)細胞。其它實施方案中，所述細胞群包含人飼養(yǎng)細胞。 這些實施方案中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %或多于至少約 95%的除所述飼養(yǎng)細胞外的人細胞是人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞。本發(fā)明篩選方法的一些實施方案中，使所述細胞群接觸候選(測試)分化因子，或者以其它方式向所述細胞群提供候選(測試)分化因子。該候選分化因子可以包括有可能促進人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞分化的任何分子。本發(fā)明的一些實施方案中，所述候選分化因子包括已知是一種或多種細胞類型的分化因子的分子。其它實施方案中，所述候選分化因子包括未知能夠促進細胞分化的分子。在優(yōu)選實施方案中，所述候選分化因子包括未知能夠促進人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞分化的分子。本發(fā)明篩選方法的一些實施方案中，所述候選分化因子包括小分子。在優(yōu)選實施方案中，小分子是分子量約10，OOOamu或更小的分子。在一些實施方案中，小分子是類視黃醇，例如視黃酸。本發(fā)明的其它實施方案中，候選分化因子包括多肽。該多肽可以是包括但不限于糖蛋白、脂蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白、細胞因子、趨化因子、肽類激素、白介素或生長因子的任何多肽。優(yōu)選的多肽包括生長因子。一些優(yōu)選實施方案中，候選分化因子包括一種或多種選自FGF10、FGF4、FGF2和Wnt3B的生長因子。本文所述篩選方法的一些實施方案中，候選分化因子包括一種或多種選自雙調(diào)蛋白(amphiregulin)、B-淋巴細胞刺激因子、IL-16、胸腺生成素、TRAIL/Apo-2、前B細胞集落增強因子、內(nèi)皮分化相關(guān)因子I (EDFl)、內(nèi)皮單核細胞活化多肽II、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、自然殺傷細胞增強因子(NKEFA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白8(成骨蛋白2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、CGI-149蛋白(神經(jīng)內(nèi)分泌分化因子)、細胞因子A3 (巨噬細胞炎性蛋白I- α )、神經(jīng)膠母細胞分化相關(guān)蛋白 (GBDRl)、肝癌衍生生長因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽U-25前體、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子B(VEGF-B)、Τ細胞特異RANTES前體、胸腺樹突狀細胞衍生因子I、運鐵蛋白、白介素-I (IL I)、白介素-2(IL 2)、白介素-3(IL 3)、白介素_4(IL 4)、白介素_5(IL 5)、白介素-6 (IL 6)、白介素-7 (IL 7)、白介素-8 (IL 8)、白介素-9 (IL 9)、白介素-10 (IL 10)、白介素-11(IL 11)、白介素-12(IL 12)、白介素-13(IL 13)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、紅細胞生成素、 血小板生成素、維生素D3、表皮生長因子(EGF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、甲狀腺激素、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、aFGF、FGF-4、FGF-6、角質(zhì)形成細胞生長因子 (KGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、血小板衍生生長因子ΒΒ、β神經(jīng)生長因子、活化素A、 轉(zhuǎn)化生長因子β I (TGF- β I)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β、爆裂刺激活性物(BPA)、紅細胞系刺激活性物(EPA)、PGE2、胰島素生長因子(IGF-I)、IGF-II、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)源性連接蛋白(Glial-derived nexin)、地塞米松(Dexamethasone)、 β-巰基乙醇、視黃酸、叔丁對甲氧酚、5-氮雜胞苷、兩性霉素B、抗壞血酸、抗壞血酸鹽、 異丁基黃嘌呤、吲哚美辛、β -甘油磷酸鹽、煙酰胺、DMS0、噻唑烷二酮、TWS119、氧化毒素 (oxytoxin)、血管升壓素、促黑素細胞激素、促皮質(zhì)激素、促脂解素、促甲狀腺素、生長激素、 促乳素、黃體生成素、人絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、促性腺激素釋放因子、促乳素釋放因子、促乳素抑制因子、生長激素釋放因子、促生長素抑制素、 促甲狀腺素釋放因子、降鈣素基因相關(guān)肽、甲狀旁腺激素、胰高血糖素樣肽I、葡萄糖依賴性促胰島多肽、胃泌素、腸促胰液素、縮膽囊素、促胃動素、血管活性腸肽、P物質(zhì)、胰多肽、酪酪肽、酪神經(jīng)肽、胰島素、胰高血糖素、胎盤促乳素、松弛素、血管緊張素II、鈣三醇、心房鈉尿肽、褪黑激素、甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、降鈣素、雌二醇、雌酮、孕酮、睪酮、皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、醛固酮、腎上腺素、去甲腎上腺素、雄留烯(androstiene)、鈣三醇、膠原蛋白、地塞米松、 β -巰基乙醇、視黃酸、叔丁對甲氧酚、5-氮雜胞苷、兩性霉素B、抗壞血酸、抗壞血酸鹽、異丁基黃嘌呤、吲哚美辛、甘油磷酸鹽、煙酰胺、DMS0、噻唑烷二酮和TWS119的生長因子。本發(fā)明篩選方法的一些實施方案中，以一種或多種濃度向細胞群提供候選分化因子。一些實施方案中，向細胞群提供候選分化因子使圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約O. lng/ml到約10mg/ml。一些實施方案中，圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約lng/ml到約lmg/ml。其它實施方案中，圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約10ng/ml到約100 μ g/ml。其它實施方案中，圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約100ng/ml到約10 μ g/ml。優(yōu)選實施方案中，圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度為約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、約 250ng/ml、 約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ml、約 425ng/ ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、約 750ng/ml、 約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ml、約 925ng/ ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 I μ g/ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ml、約 5 μ g/ ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ml、約 12 μ g/ ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約
19μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ml、約 125 μ g/ ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、約 350 μ g/ml、 約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、約 650 μ g/ml、 約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約 1000 μ g/ml 或大于 1000 μ g/ml。本發(fā)明篩選方法的某些實施方案中，向細胞群提供除前腸分化因子之外的包括任何分子的候選分化因子。例如，一些實施方案中，向細胞群提供除類視黃醇、生長因子TGF3 超家族的成員、FGF10和FGF4之外的包括任何分子的候選分化因子。一些實施方案中，向細胞群提供除視黃酸之外的包括任何分子的候選分化因子。一些實施方案中，本文所述篩選方法的步驟包括確定至少一種標志物在第一時間點和第二時間點的表達。一些實施方案中，該第一時間點可以在向細胞群提供候選分化因子之前或與之大致同時?；蛘?，一些實施方案中，該第一時間點在向細胞群提供候選分化因子之后。一些實施方案中，確定多種標志物在第一時間點的表達。除確定至少一種標志物在第一時間點的表達之外,本文所述篩選方法的一些實施方案考慮確定至少一種標志物在第二時間點的表達，該第二時間點在第一時間點之后，也在向細胞群提供候選分化因子之后。這些實施方案中，確定相同標志物在第一時間點和第二時間點的表達。一些實施方案中，確定多種標志物在第一時間點和第二時間點的表達。這些實施方案中，確定相同的多種標志物在第一時間點和第二時間點的表達。一些實施方案中，在多個時間點確定標志物的表達，其中每一個都在第一時間點之后，并且每一個都在向細胞群提供候選分化因子之后。某些實施方案中，用Q-PCR確定標志物的表達。其它實施方案中，用免疫細胞化學確定標志物的表達。本文所述篩選方法的某些實施方案中，在第一時間點和第二時間點確定其表達的標志物是與人前原條細胞和/或中內(nèi)胚層細胞分化為特定細胞相關(guān)的標志物，該特定細胞為組成衍生自腸管的組織和/或器官的細胞的前體。一些實施方案中，衍生自腸管的組織和/或器官包含終末分化的細胞。一些實施方案中，標志物指示胰細胞或胰前體細胞。優(yōu)選實施方案中，標志物是胰-十二指腸同源框因子-I (PDXl)。其它實施方案中，標志物是同源框A13(H0XA13)或同源框C6 (H0XC6)。另外，其它實施方案中，標志物指示肝細胞或肝前體細胞。某些優(yōu)選實施方案中，標志物是白蛋白、肝細胞特異性抗原(HSA)或普洛斯彼羅(prospero)-相關(guān)同源框I (PROXl)。其它實施方案中,標志物指示肺或肺前體細胞。一些優(yōu)選實施方案中，標志物是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子l(TITFl)。其它實施方案中，標志物指示腸或腸前體細胞。其它優(yōu)選實施方案中，標志物是絨毛蛋白(villin)或尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子 2(CDX2)。其它實施方案中，標志物指示胃或胃前體細胞。其它優(yōu)選實施方案中，標志物是 VACMUVMF或CXCR4。其它實施方案中，標志物指示甲狀腺或甲狀腺前體細胞。這些實施方案中，標志物是TITFl。其它實施方案中,標志物指示胸腺或胸腺前體細胞。本發(fā)明篩選方法的一些實施方案中，使向細胞群提供候選趨化因子和確定標記物在第二時間點的表達之間經(jīng)過足夠長的時間。該向細胞群提供候選趨化因子和確定標記物在第二時間點的表達之間的足夠的時間間隔可以從最短約I小時到最長約10天。一些實施方案中，向細胞群提供候選趨化因子后多次確定至少一種標志物的表達。一些實施方案中，該足夠的時間間隔是最短約I小時、最短約6小時、最短約12小時、最短約18小時、最短約24小時、最短約30小時、最短約36小時、最短約42小時、最短約48小時、最短約54 小時、最短約60小時、最短約66小時、最短約72小時、最短約78小時、最短約84小時、最短約90小時、最短約96小時、最短約102小時、最短約108小時、最短約114小時、最短約 120小時、最短約126小時、最短約132小時、最短約138小時、最短約144小時、最短約150 小時、最短約156小時、最短約162小時、最短約168小時、最短約174小時、最短約180小時、最短約186小時、最短約192小時、最短約198小時、最短約204小時、最短約210小時、 最短約216小時、最短約222小時、最短約228小時、最短約234小時或最短約240小時。本文所述方法的一些實施方案中，進一步確定標志物在第二時間點的表達與該標志物在第一時間點的表達相比是否增加或減少。所述至少一種標志物表達的增加或減少表明候選分化因子能夠促進定形內(nèi)胚層細胞的分化。類似地，如果確定了多種標志物表達，進一步確定該多種標志物在第二時間點的表達與該多種標志物在第一時間點的表達相比是否增加或減少。可以通過測量或評估細胞群中標志物在第一和第二時間點的數(shù)量、水平或活性來確定標志物表達的增加或減少。這種確定可以是與其它標志物(如看家基因的表達)相比較的，或絕對的。某些實施方案中，其中標志物在第二時間點的表達比其在第一時間點的表達增加了，增加的量為至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90 倍、至少約100倍或多于至少約100倍。一些實施方案中，增加的量為少于2倍。標志物在第二時間點的表達比其在第一時間點的表達減少的實施方案中，減少的量為至少約2倍、 至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約 60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。一些實施方案中，減少的量為少于2倍。本文所述篩選方法的一些實施方案中，向細胞群提供候選趨化因子之后，人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞分化為一種或多種定形內(nèi)胚層譜系的細胞類型。一些實施方案中， 向細胞群提供候選趨化因子之后，人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞分化為衍生自腸管的細胞。這些細胞包括但不限于，胰腺、肝、肺、胃、腸、甲狀腺、胸腺、咽、膽囊和膀胱的細胞和這些細胞的前體。此外，這些細胞可以進一步發(fā)育為更高級的結(jié)構(gòu)如組織和/或器官。本發(fā)明的篩選方法的其它實施方案中，向所述細胞群提供候選分化因子之后，所述人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞分化為中胚層譜系的一種或多種細胞類型。一些實施方案中，向所述細胞群提供候選分化因子之后，所述人前原條和/或中內(nèi)胚層細胞分化為包括但不限于血細胞、心血管系統(tǒng)的細胞、骨骼組織及其它結(jié)構(gòu)和結(jié)締組織以及每一前述細胞類型的前體的細胞?；蛘?，這些細胞可以進一步發(fā)育為諸如組織和/或器官的更高級結(jié)構(gòu)。增加FGF8基因產(chǎn)物表汰的方法本發(fā)明方法的一些實施方案涉及在體外增加FGF8基因產(chǎn)物在人胚胎干細胞中的表達的方法。此類方法包括在含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得所述hESC的步驟。例如，該培養(yǎng)基可以含有濃度為約0% (v/v)、約O. 05% (v/v)、約0.1% (v/v)、約0.2% (v/v)、約 O. 3% (v/v)、約 O. 4% (v/v)、約 O. 5% (v/v)、約 O. 6% (v/v)、約 O. 7% (v/v)、約 O. 8% (v/v)、約 O. 9% (v/v)、約 I % (v/v)、約 1.1% (v/v)、約 I. 2% (v/v)、約 I. 3% (v/v)、 約 L 4% (v/v)、約 L 5% (v/v)、約 L 6% (v/v)、約 L 7% (v/v)、約 L 8% (v/v)、約 L 9% (v/v)的血清。一些實施方案中，所述培養(yǎng)基不包含血清替代物。讓hESC與足以增加FGF8 基因產(chǎn)物的表達的量的分化因子接觸。一些實施方案中，所述分化因子是至少一種TGF3 超家族的生長因子。在優(yōu)選實施方案中，所述TGFii超家族的生長因子是活化素A。用于接觸hESC的分化因子的濃度范圍從約lng/ml至約lmg/ml。例如,分化因子可以以lng/ml、 約 5ng/ml、約 25ng/ml、約 50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、 約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、 約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 lyg/ ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、 約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、 約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、 約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約 1000 μ g/ml 的濃度接觸 hESC。 曾力口 Brachyury、FGF4矛口 /或SNAIl基因產(chǎn)物表達的方法本發(fā)明的其它實施方案涉及在體外增加brachyuir、FGF4和/或SNAIl基因產(chǎn)物在人胚胎干細胞中的表達的方法。此類方法包括在含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基中獲得所述hESC的步驟。例如，該培養(yǎng)基可以含有濃度為約0% (v/v)、約O. 05% (v/v)、 約 0.1% (v/v)、約 O. 2% (v/v)、約 O. 3% (v/v)、約 O. 4% (v/v)、約 O. 5% (v/v)、約 O. 6% (v/v)、約 O. 7% (v/v)、約 O. 8% (v/v)、約 O. 9% (v/v)、約 I % (v/v)、約 1.1% (v/v)、約 1.2% (v/v)、約 1.3% (v/v)、約 1.4% (v/v)、約 1.5% (v/v)、約 1.6% (v/v)、約 1.7% (v/v)、約1.8% (v/v)、約1.9% (v/v)的血清。一些實施方案中，所述培養(yǎng)基不包含血清替代物。讓hESC與足以增加brachyuir、FGF4和/或SNAIl基因產(chǎn)物的表達的量的分化因子接觸。一些實施方案中，所述分化因子是至少一種TGFP超家族的生長因子。在優(yōu)選實施方案中，所述TGFP超家族的生長因子是活化素A。用于接觸hESC的分化因子的濃度范圍從約lng/ml至約lmg/ml ο例如，分化因子可以以lng/ml、約5ng/ml、約25ng/ml、約 50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、約 350ng/ml、約 375ng/ml、 約 400ng/ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ml、約 525ng/ml、約 550ng/ ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、約 850ng/ml、約 875ng/ml、 約 900ng/ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 I μ g/ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、 約 4μ g/ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約
11μ g/ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、 約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、 約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、 約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約 1000 μ g/ml 的濃度接觸 hESC?；虍a(chǎn)物在細胞培養(yǎng)物中的時間件表達本發(fā)明的其它實施方案涉及具有特定時間模式的基因表達的細胞培養(yǎng)物。一些實施方案中，該細胞培養(yǎng)物包含人胚胎干細胞(hESC)和含有少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。 例如，該培養(yǎng)基可以含有濃度為約0% (v/v)、約O. 05% (v/v)、約0.1% (v/v)、約0.2% (v/v)、約 O. 3% (v/v)、約 O. 4% (v/v)、約 O. 5% (v/v)、約 O. 6% (v/v)、約 O. 7% (v/v)、約 0.8% (v/v)、約 O. 9% (v/v)、約 1% (v/v)、約 I. 1% (v/v)、約 I. 2% (v/v)、約 I. 3% (v/v)、 約 I. 4% (v/v)、約 I. 5% (v/v)、約 I. 6% (v/v)、約 I. 7% (v/v)、約 I. 8% (v/v)、約 I. 9% (v/v)的血清。一些實施方案中，所述培養(yǎng)基不包含血清替代物。一些實施方案中，所述培養(yǎng)基是低血清RPMI。本發(fā)明的一些實施方案中，培養(yǎng)物中的hESC在參考時間點開始分化。該參考時間點是向所述細胞提供分化因子的點。一些實施方案中，所述分化因子是至少一種TGFP超家族的生長因子。在優(yōu)選實施方案中，所述TGFii超家族的生長因子是活化素A。向hESC 提供的分化因子的濃度范圍從約lng/ml至約lmg/ml。例如，分化因子可以以lng/ml、約 5ng/ml、約 25ng/ml、約 50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、 約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、 約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 lyg/ ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、 約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、 約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、 約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約 1000 μ g/ml 的濃度接觸 hESC。向hESC提供分化因子后，與hESC中的基線FGF8 mRNA表達相比，F(xiàn)GF8 mRNA的表達顯著上調(diào)。hESC中的基線FGF8表達是諸如mRNA等的FGF8基因產(chǎn)物的表達，該FGF8基因產(chǎn)物存在于維持在未分化狀態(tài)的hESC細胞培養(yǎng)物中。一些實施方案中，距參考時間點約 6小時時，F(xiàn)GF8 mRNA的表達顯著上調(diào)。本發(fā)明的其它實施方案中，距參考時間點約24小時后，F(xiàn)GF8 mRNA的表達下調(diào)。其它實施方案中，F(xiàn)GF8 mRNA的表達在距參考時間點約6小時至約24小時之間達到峰值。其它實施方案中，F(xiàn)GF8的峰值表達在距參考時間點少于約6小時時達到。本發(fā)明的其它實施方案涉及細胞培養(yǎng)物，其展現(xiàn)連接素多肽的增加的細胞核定位。在這些實施方案中，距所述參考時間點約17小時時β-連接素多肽開始向細胞核定位。一些實施方案中，距所述參考時間點短于約17小時時β-連接素多肽開始向細胞核定位。其它實施方案中，距所述參考時間點約17小時時β-連接素多肽顯著地向細胞核定位。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物的其它實施方案涉及具有增加的brachyury mRNA表達的細胞培養(yǎng)物。在該細胞培養(yǎng)物中，距所述參考時間點約24小時時brachyury mRNA的表達顯著上調(diào)。一些實施方案中，距所述參考時間點約24小時之前brachyury mRNA的表達顯著上調(diào)。一些實施方案中,距所述參考時間點約48小時時brachyury mRNA的表達顯著下調(diào)。 某些實施方案中，brachyury mRNA的表達在距參考時間點約12小時至約48小時之間達到峰值。在優(yōu)選實施方案中，距所述參考時間點約72小時時brachyury mRNA不顯著表達。在其它優(yōu)選實施方案中，距所述參考時間點約24小時時brachyury mRNA的表達顯著上調(diào)，而在距所述參考時間點約72小時時brachyury mRNA不顯著表達。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物的其它實施方案涉及具有增加的FGF4 mRNA表達的細胞培養(yǎng)物。在該細胞培養(yǎng)物中，距所述參考時間點約24小時時FGF4 mRNA的表達顯著上調(diào)。一些實施方案中，距所述參考時間點約24小時之前FGF4 mRNA的表達顯著上調(diào)。一些實施方案中，距所述參考時間點約48小時時FGF4 mRNA的表達顯著下調(diào)。某些實施方案中，F(xiàn)GF4 mRNA的表達在距參考時間點約12小時至約48小時之間達到峰值。在優(yōu)選實施方案中，距所述參考時間點約72小時時FGF4 mRNA不顯著表達。在其它優(yōu)選實施方案中，距所述參考時間點約24小時時FGF4 mRNA的表達顯著上調(diào)，而在距所述參考時間點約72小時時FGF4 mRNA不顯著表達。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物的優(yōu)選實施方案涉及具有增加的brachyury和FGF4 mRNA表達的細胞培養(yǎng)物。在該細胞培養(yǎng)物中，距所述參考時間點約24小時時brachyury和FGF4 mRNA的表達顯著上調(diào)。一些實施方案中，距所述參考時間點約24小時之前brachyury和 FGF4 mRNA的表達顯著上調(diào)。一些實施方案中，距所述參考時間點約48小時時brachyury 和FGF4 mRNA的表達顯著下調(diào)。某些實施方案中，brachyury和FGF4 mRNA的表達在距參考時間點約12小時至約48小時之間達到峰值。在優(yōu)選實施方案中，距所述參考時間點約 72小時時brachyury和FGF4 mRNA不顯著表達。在其它優(yōu)選實施方案中，距所述參考時間點約24小時時brachyury和FGF4 mRNA的表達顯著上調(diào)，而在距所述參考時間點約72小時時brachyury和FGF4 mRNA不顯著表達。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物的其它實施方案涉及具有增加的SNAIl mRNA表達的細胞培養(yǎng)物。在該細胞培養(yǎng)物中，距所述參考時間點約24小時時SNAIl mRNA的表達顯著上調(diào)。一些實施方案中，距所述參考時間點約24小時之前SNAIl mRNA的表達顯著上調(diào)。一些實施方案中，距所述參考時間點約48小時時SNAIl mRNA的表達下調(diào)。某些實施方案中，SNAIl mRNA的表達在距參考時間點約12小時至約48小時之間達到峰值。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物的實施方案還涉及具有E-鈣粘著素(ECAD)基因產(chǎn)物的特異時間表達的細胞培養(yǎng)物。該實施方案中，距所述參考時間點約12小時時E-鈣粘著素mRNA 的表達下調(diào)。其它實施方案中，距所述參考時間點短于12小時時E-鈣粘著素mRNA的表達可以下調(diào)。在優(yōu)選實施方案中，距所述參考時間點約48小時時E-鈣粘著素mRNA的表達顯著下調(diào)。本發(fā)明的其它實施方案涉及表達S0X17和/或F0XA2標志物的細胞培養(yǎng)物。一些實施方案中，距所述參考時間點約48小時時S0X17 mRNA的表達顯著上調(diào)。其它實施方案中，距所述參考時間點約96小時時F0XA2 mRNA的表達顯著上調(diào)。本發(fā)明的一些實施方案涉及包括具有某些特定模式的基因表達的細胞的細胞培養(yǎng)物。這些實施方案中，所述細胞培養(yǎng)物包含hESC、例如TGFii超家族的分化因子等的分化因子和包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。其它實施方案中，所述培養(yǎng)基包含多于2% (v/v)的血清。一些實施方案中，所述培養(yǎng)物缺乏血清替代物。一些實施方案中，在向所述細胞培養(yǎng)物提供所述分化因子時，所述細胞培養(yǎng)物全部是或主要全部是hESC。在分化期間，至少部分hESC分化為其它細胞類型，如通過某些標志物基因產(chǎn)物(mRNA和/或多肽)的表達所表明的。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物的一些實施方案中，第一套標志物基因的表達在第二和/或第三套標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。一些實施方案中，每一套標志物基因都可以包括一種或多種標志物基因?；虮磉_上調(diào)的范圍可以是從輕微到顯著。例如，與未分化hESC 中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)至少約10%。其它實施方案中，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)至少約 20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %或多于至少約90%。其它實施方案中，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6 倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約 30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、 至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物的其它實施方案中，第一套標志物基因的表達在第二和/或第三套標志物基因的表達上調(diào)之前下調(diào)。這些實施方案中，每一套標志物基因都可以包括一種或多種標志物基因。如同基因表達的上調(diào)，下調(diào)的范圍可以是從輕微到顯著。例如， 與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以下調(diào)至少約10%。 其它實施方案中，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以下調(diào)至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或多于至少約90%。其它實施方案中，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以下調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5 倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約 20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、 至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物的其它實施方案中，第一套標志物基因的表達在第二和/或第三套標志物基因的峰值表達之前或大致同時上調(diào)。這些實施方案中，每一套標志物基因都可以包括一種或多種標志物基因。其它實施方案中，第一套標志物基因的表達在第二和 /或第三套標志物基因的峰值表達之前或大致同時下調(diào)。如上所述，在這些實施方案中，每一套標志物基因都可以包括一種或多種標志物基因。而且，在上述實施方案中，基因表達的上調(diào)和下調(diào)的范圍都可以是從輕微到顯著。例如，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)或下調(diào)至少約10%。其它實施方案中，與未分化hESC 中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)或下調(diào)至少約20%、至少約 30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或多于至少約90%。其它實施方案中，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比,該標志物基因的表達可以上調(diào)或下調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、 至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30 倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的一些實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自FGF8、 Nodal、HEG、HEYl、GATA2、BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAII、 Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXL1、DKK4、NET01、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1 和 GRM4 的標志物基因的峰值表達之前上調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自HEY1、GATA2、BIK和IDl的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTI、 FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標志物基因的峰值表達之前或大致同時下調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和 IDl的標志物基因的表達在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自brachyury、FGF4、 SNAI1、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因的表達在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之前或大致同時上調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自brachyury、FGF4、SNAIl、 Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因在選自 S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之前或大致同時達到峰值表達。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自FGF8、Nodal.HEG, HEY1、GATA2、 BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、DKK4、NET01、 T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。具有一種或多種上述時間性基因表達模式的細胞培養(yǎng)物中的一些包括包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。在一些實施方案中，培養(yǎng)基不含血清。在其它實施方案中，培養(yǎng)基不含血清替代物。用于本發(fā)明細胞培養(yǎng)物的一些培養(yǎng)基包括濃度少于約I. 9% (v/v)、 少于約I. 8% (v/v)、少于約I. 7% (v/v)、少于約1.6% (v/v)、少于約I. 5% (v/v)、少于約 I. 4% (v/v)、少于約 I. 3% (v/v)、少于約 I. 2% (v/v)、少于約 I. 1% (v/v)、少于約 1% (v/v)、少于約 O. 9% (v/v)、少于約 O. 8% (v/v)、少于約 O. 7% (v/v)、少于約 O. 6% (v/v)、 少于約O. 5% (v/v)、少于約O. 4% (v/v)、少于約O. 3% (v/v)、少于約O. 2% (v/v)、少于約 O. 1% (v/v)或少于約O. 05% (v/v)的血清。具有一種或多種上述時間性基因表達模式的細胞培養(yǎng)物中的一些包含至少一種 TGF^超家族的分化因子。一些實施方案中，該生長因子是nodal、活化素A和/或活化素 B。在優(yōu)選實施方案中,所述分化因子是活化素A。在更優(yōu)選的實施方案中，活化素A在培養(yǎng)基中存在的濃度為約100ng/ml。然而，應(yīng)該理解，可以以約lng/ml至約lmg/ml的濃度范圍向細胞培養(yǎng)物提供所述TGFβ超家族的分化因子。一些實施方案中，以約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、 約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、 約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 I μ g/ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、 約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、 約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約950 μ g/ml、約1000 μ g/ml或高于約1000 μ g/ml向細胞培養(yǎng)物提供所述TGF β超家族的分化因子。本發(fā)明還預(yù)期分化hESC以產(chǎn)生具有特定時間性標志物基因表達模式的細胞的方法。例如，一些實施方案涉及分化人胚胎干細胞(hESC)的方法，其通過使hESC接觸包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基，向該hESC提供TGFii超家族的分化因子，然后容許hESC的分化發(fā)生來實現(xiàn)。在上述分化hESC的方法的一些實施方案中，第一套標志物基因的表達在第二和 /或第三套標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。一些實施方案中，每一套標志物基因都可以包括一種或多種標志物基因?；虮磉_上調(diào)的范圍可以是從輕微到顯著。例如，與未分化 hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)至少約10%。其它實施方案中，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比,該標志物基因的表達可以上調(diào)至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、 至少約90%或多于至少約90%。其它實施方案中，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、 至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約 90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的分化hESC的方法的其它實施方案中，第一套標志物基因的表達在第二和/或第三套標志物基因的表達上調(diào)之前下調(diào)。這些實施方案中，每一套標志物基因都可以包括一個或多個標志物基因。如同基因表達的上調(diào)，下調(diào)的范圍可以是從輕微到顯著。 例如，與未分化hESC中同一標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以下調(diào)至少約10%。其它實施方案中，與未分化hESC中同一標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以下調(diào)至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約 70 %、至少約80 %、至少約90 %或多于至少約90 %。其它實施方案中，與未分化hESC中同一標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以下調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4 倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15 倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的分化hESC的方法的其它實施方案中，第一套標志物基因的表達在第二和/或第三套標志物基因的峰值表達之前或大致同時上調(diào)。這些實施方案中，每一套標志物基因都可以包括一種或多種標志物基因。其它實施方案中，第一套標志物基因的表達在第二和/或第三套標志物基因的峰值表達之前或大約同時下調(diào)。如上所述，在這些實施方案中，每一套標志物基因都可以包括一種或多種標志物基因。而且，在上述實施方案中，基因表達的上調(diào)和下調(diào)的范圍都可以是從輕微到顯著。例如，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)或下調(diào)至少約10%。其它實施方案中，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)或下調(diào)至少約
20%、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90%或多于至少約90%。其它實施方案中，與未分化hESC中相同標志物基因的表達相比，該標志物基因的表達可以上調(diào)或下調(diào)至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20 倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。本發(fā)明的一些實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自FGF8、 Nodal、HEG、HEYl、GATA2、BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAII、 Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自FGF8、Nodal、 HEG、HEYU GATA2、BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIU Wnt3、 MIXL1、DKK4、NET01、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1 和 GRM4 的標志物基因的峰值表達之前上調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自HEY1、GATA2、BIK和IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAII、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTI、 FLJ22662、SLIT2、GADl和GRM4的標志物基因的峰值表達之前或大致同時下調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和 IDl的標志物基因的表達在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自brachyury、FGF4、 SNAI1、Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因的表達在選自S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之前或大致同時上調(diào)。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自brachyury、FGF4、SNAIl、 Wnt3、MIXLl、DKK4、ΝΕΤΟΙ、T、DACTl、FLJ22662、SLIT2、GADl 和 GRM4 的標志物基因在選自 S0X17、F0XA2、CXCR4和MIXLl的標志物基因的表達上調(diào)之前或大致同時達到峰值表達。其它實施方案中，在所述細胞培養(yǎng)物的至少一些細胞中，選自FGF8、Nodal.HEG, HEY1、GATA2、 BIK 和 IDl 的標志物基因的表達在選自 brachyury、FGF4、SNAIl、Wnt3、MIXLl、DKK4、NET01、 T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的標志物基因的表達上調(diào)之前上調(diào)。在本發(fā)明分化方法的一些實施方案中，使細胞培養(yǎng)物接觸或者以其它方式向其提供包含少于約2% (v/v)血清的培養(yǎng)基。在一些實施方案中，培養(yǎng)基不含血清。在其它實施方案中，培養(yǎng)基不含血清替代物。用于本發(fā)明方法的一些培養(yǎng)基包括濃度少于約I. 9% (v/ V)、少于約 I. 8% (v/v)、少于約 I. 7% (v/v)、少于約 I. 6% (v/v)、少于約 I. 5% (v/v)、少于約 I. 4% (v/v)、少于約 I. 3% (v/v)、少于約 I. 2% (v/v)、少于約 I. 1% (v/v)、少于約 1% (v/v)、少于約 0.9% (v/v)、少于約 0.8% (v/v)、少于約 0. 7% (v/v)、少于約 0. 6% (v/v)、 少于約0.5% (v/v)、少于約0. 4% (v/v)、少于約0. 3% (v/v)、少于約0. 2% (v/v)、少于約 0. 1% (v/v)或少于約0.05% (v/v)的血清。分化hESC以產(chǎn)生上述基因表達的時間模式的一些方法包括向例如hESC的培養(yǎng)物中的細胞提供至少一種TGFii超家族的分化因子。一些實施方案中，該生長因子是nodal、 活化素A和/或活化素B。在優(yōu)選實施方案中，所述分化因子是活化素A。在更優(yōu)選的實施方案中，活化素A在培養(yǎng)基中存在的濃度為約100ng/ml。然而，應(yīng)該理解，可以以約lng/ml至約lmg/ml的濃度范圍向細胞培養(yǎng)物提供所述TGFβ超家族的分化因子。一些實施方案中，以約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約 75ng/ml、約 100ng/ml、約 125ng/ml、約 150ng/ml、約 175ng/ml、約 200ng/ml、約 225ng/ml、 約 250ng/ml、約 275ng/ml、約 300ng/ml、約 325ng/ml、約 350ng/ml、約 375ng/ml、約 400ng/ml、約 425ng/ml、約 450ng/ml、約 475ng/ml、約 500ng/ml、約 525ng/ml、約 550ng/ml、約 575ng/ml、約 600ng/ml、約 625ng/ml、約 650ng/ml、約 675ng/ml、約 700ng/ml、約 725ng/ml、 約 750ng/ml、約 775ng/ml、約 800ng/ml、約 825ng/ml、約 850ng/ml、約 875ng/ml、約 900ng/ ml、約 925ng/ml、約 950ng/ml、約 975ng/ml、約 I μ g/ml、約 2 μ g/ml、約 3 μ g/ml、約 4 μ g/ ml、約 5 μ g/ml、約 6 μ g/ml、約 7 μ g/ml、約 8 μ g/ml、約 9 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 11 μ g/ ml、約 12 μ g/ml、約 13 μ g/ml、約 14 μ g/ml、約 15 μ g/ml、約 16 μ g/ml、約 17 μ g/ml、約 18 μ g/ml、約 19 μ g/ml、約 20 μ g/ml、約 25 μ g/ml、約 50 μ g/ml、約 75 μ g/ml、約 100 μ g/ ml、約 125 μ g/ml、約 150 μ g/ml、約 175 μ g/ml、約 200 μ g/ml、約 250 μ g/ml、約 300 μ g/ml、 約 350 μ g/ml、約 400 μ g/ml、約 450 μ g/ml、約 500 μ g/ml、約 550 μ g/ml、約 600 μ g/ml、 約 650 μ g/ml、約 700 μ g/ml、約 750 μ g/ml、約 800 μ g/ml、約 850 μ g/ml、約 900 μ g/ml、約 950 μ g/ml、約1000 μ g/ml或高于約1000 μ g/ml向細胞培養(yǎng)物提供所述TGF β超家族的分化因子。以上概括描述了本發(fā)明，可通過參照本文提供的某些具體實施例進一步理解本發(fā)明，這些實施例僅是為了說明而不是限制本發(fā)明。
實施例以下很多實施例描述了人多能性細胞的使用。產(chǎn)生人多能性細胞的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，在許多科學出版物中都有描述，包括第5，453，357,5, 670，372,5, 690，926、 6,090,622,6, 200,806和6，251,671號美國專利及
發(fā)明者伊曼紐爾·E·貝特格, 依文特·克魯恩, 凱文·艾倫·達穆爾, 艾倫·D·阿古尼克, 蘇珊·埃利澤 申請人:維亞希特公司