專利名稱：生產(chǎn)5’-核糖核苷酸的方法
生產(chǎn)5’-核糖核苷酸的方法
本申請是發(fā)明專利申請2004800(^937. 7的分案申請。
本發(fā)明涉及包含5’-核糖核苷酸的組合物和用于生產(chǎn)該組合物的方法。本發(fā)明還涉及包含5’ -核糖核苷酸的組合物在食品或飼料中的應(yīng)用。
自溶酵母提取物是對細(xì)胞進(jìn)行破碎和對聚合酵母物質(zhì)進(jìn)行消化(裂解)之后從酵母中獲得的可溶物質(zhì)的濃縮物。細(xì)胞破碎之后培養(yǎng)基中釋放出來的活性酵母酶是造成裂解的原因。通常上述類型的酵母提取物不包含5’ -核糖核苷酸，因為在自溶過程期間，天然 RNA已被分解或修飾，使其無法或幾乎無法降解成5’ -核糖核苷酸。富含氨基酸的上述類型的酵母提取物作為基本味道提供者被用于食品工業(yè)。酵母提取物中存在的氨基酸為食品增加了類似肉湯、肉湯味。
另一方面，水解酵母提取物是在下述處理之后從酵母中獲得的可溶性物質(zhì)的濃縮物，所述處理是對細(xì)胞進(jìn)行破碎、消化(裂解)以及在裂解期間向酵母懸浮物中加入蛋白酶和/或肽酶以及特別地，核酸酶。天然酵母酶在裂解之前被失活。該過程期間，形成了鳥嘌呤的5’-核糖核苷酸(5’-鳥嘌呤單磷酸酯；5’-GMP)、尿嘧啶的5’-核糖核苷酸(5’-尿嘧啶單磷酸酯；5’ -UMP)、胸腺嘧啶的5’ -核糖核苷酸(5’ -胸腺嘧啶單磷酸酯；5’ -CMP) 和腺嘌呤的5’ -核糖核苷酸(5’ -腺嘌呤單磷酸酯；5’ -AMP)。向混合物中加入腺苷酸脫氨酶后，5’ -AMP被轉(zhuǎn)化為5’ -肌甙單磷酸酯(5’ -IMP)。通過此種方法獲得的水解酵母提取物因此富含5’ -核糖核苷酸，尤其是富含5’ -GMP和5’ -IMP。通常酵母提取物還富含谷氨酸單鈉(MSG)。5’-IMP、5’-GMP和MSG因其增強(qiáng)香味的特性而為人們所知。它們在某些種類的食品中能增加香噴噴的美妙味道。該現(xiàn)象被描述為“ 口感”或鮮味(umami)。富含 5’ -核糖核苷酸以及可選地，富含MSG的酵母提取物通常被加入到湯、醬、腌汁或香料調(diào)料中。
目前，富含5’ -核糖核苷酸的酵母提取物是用具有高RNA含量的酵母菌株和/或通過對細(xì)胞內(nèi)容物的部分提取來生產(chǎn)的。此類型的增味水解酵母提取物的缺點(diǎn)在于由于氨基酸、短肽和其它酵母成分的存在，它們不適合需要純凈味道的應(yīng)用。
JP 51106791描述了一種純化RNA的方法，其中對酵母提取物進(jìn)行超濾，接著是若干額外的純化步驟。對于獲得有商業(yè)吸引力的RNA來說所必需的一系列純化步驟使得該過程復(fù)雜而又昂貴。在該篇文獻(xiàn)中沒有暗示將經(jīng)純化的RNA用于含有5’-核糖核苷酸的組合物的生產(chǎn)，所述5’ -核糖核苷酸可被用作食品中的增味劑。
本發(fā)明的一個目的是提供含有高含量5’ -核糖核苷酸的組合物，其在味道方面是純凈的，并可被用于若干食品或飼料上的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供具有上述特征的含有5’ -核糖核苷酸的組合物的簡單而有效的生產(chǎn)方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了包含至少55 % w/w (基于無NaCl的干重)5 ’ -核糖核苷酸的組合物。 優(yōu)選地，該組合物包含至少65% w/w的5’-核糖核苷酸，更優(yōu)選地，至少75% w/w的5’-核糖核苷酸。優(yōu)選地，該組合物還包含谷氨酸鹽。典型地，本發(fā)明的組合物包含至多98% w/w的5’ -核糖核苷酸。
本發(fā)明還提供了一種非常簡單、劃算因此在商業(yè)上很具吸引力的方法。有益地，本發(fā)明的方法與從酵母提取物中對RNA的分離以及將經(jīng)過分離的RNA向5’-核糖核苷酸的轉(zhuǎn)化結(jié)合在一起。以這種方式，可能以相對簡單并因此在商業(yè)上很具吸引力的方法生產(chǎn)出高純度的5’ -核糖核苷酸來。
本發(fā)明的方法可被用于生產(chǎn)本發(fā)明組合物。
特別地，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)含有5’ -核糖核苷酸的組合物的方法，所述方法包括
(i)處理微生物細(xì)胞，以釋放出包含RNA的細(xì)胞內(nèi)容物；
(ii)將存在于釋放出的細(xì)胞內(nèi)容物中的RNA與其它可溶性細(xì)胞物質(zhì)分離；
(iii)將經(jīng)過分離的RNA轉(zhuǎn)化為5’ -核糖核苷酸。
在此用術(shù)語“5，-核糖核苷酸”來指5，-GMP、5，-CMP,5' _UMP、5，-AMP和/或 5’ -IMP的混合物，其中混合物中的5’ -IMP是通過將5’ -AMP部分或完全轉(zhuǎn)化成5’ -IMP來獲得的。
術(shù)語“5’ -核糖核苷酸”在本文中指游離的5’ -核糖核苷酸或其鹽。
5’-核糖核苷酸在本發(fā)明組合物中的重量百分比基于該組合物無NaCl的干重，并且作為5’ -核糖核苷酸的二鈉鹽七水合物ONa. 7Aq)來被計算。無NaCl并不意味著本發(fā)明的組合物就不能含有NaCl，而是在計算％ w/w時將NaCl從所述組合物中排除出去。后一種計算可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來進(jìn)行。組合物中谷氨酸鹽的量被計算為谷氨酸的百分比(％ w/w)，即，組合物的每重量無NaCl干重中游離谷氨酸的重量。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包含谷氨酸鹽，其中，谷氨酸鹽與5’ -核糖核苷酸的比例小于0. 1，優(yōu)選地，小于0. 05，或者更優(yōu)選地，小于0.01 ；以及，其中該比例大于0. 001。通常， 所述組合物包含0. 01 %至10 %，優(yōu)選0. 05 %至5 %或更優(yōu)選地，0. 1 %至2 % w/w的谷氨酸鹽，這些含量基于所述組合物的無NaCl干重。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包含的5’ -GMP的量比5’ -IMP和5’ -AMP的總和更多。 商業(yè)上可獲得的所有酵母提取物含有的5’ -GMP的量都比5’ -IMP和5’ -AMP的總和要少。 優(yōu)選從酵母獲得的本發(fā)明的5’ -核糖核苷酸組合物含有比5’ -IMP和5’ -AMP的總和還多的5’ -GMP。在此類組合物中相對于5’ -IMP和5’ -AMP的總和而言，更高的5’ -GMP含量是有好處的，因為這使得該組合物較之目前商業(yè)上可獲得的酵母提取物具有更強(qiáng)的增味能力。這是因為5’ -GMP在增加香味的方面比5’ -IMP更為有用，而5’ -AMP對增加香味沒有作用(T. Nagodawithana, "Savoury Flavours，，，(1995) edited by Esteekay associates， Inc，Wisconsin，USA，page 302)。
任何類型的微生物都可被用作本發(fā)明方法中RNA的來源。細(xì)菌和真菌微生物是優(yōu)選的，例如適于食品和飼料應(yīng)用的那些。優(yōu)選的微生物是那些具有食品級狀態(tài)并因此可以安全用于人類食品消耗的。優(yōu)選的是具有高RNA含量的微生物。
適合在本發(fā)明方法中使用的微生物的例子包括酵母和絲狀真菌，例如 Trichoderma 或 Aspergillus。屬于 Saccharomyces、Kluyveromyces 或 Candida 屬的酵母菌株是優(yōu)選使用的。屬于Saccharomyces,例如屬于Saccharomyces cerevisiae株的酵母菌株是優(yōu)選的。
合適的細(xì)菌微生物的例子是乳酸細(xì)菌，例如，乳酸菌(LactcAaci 1 Ius)。
本發(fā)明的方法可以以討論中的微生物的發(fā)酵培養(yǎng)液開始?？墒褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的發(fā)酵方法。在一些情況下，該發(fā)酵培養(yǎng)液在用于本發(fā)明的方法之前可被濃縮，例如通過離心或過濾。例如，膏狀酵母(已被濃縮成15-27wt%干物質(zhì)含量的面包酵母)可被使用。
通常從具有高RNA含量的菌株(S卩，典型地，具有6-15%的RNA含量)中來獲得發(fā)酵培養(yǎng)液。以這種方式，在水解過程中會產(chǎn)生高含量的5’ -核糖核苷酸。雖然具有高RNA 含量的酵母或其它微生物菌株是優(yōu)選的，但是，具有低RNA含量的酵母或其它微生物菌株也是可以使用的。有利地，使用本發(fā)明的方法，可將上述酵母或其它微生素菌株轉(zhuǎn)化為具有高5’ -核糖核苷酸含量的組合物或酵母提取物。此外，使用本發(fā)明的方法，可以獲得其中 5’_核糖核苷酸含量比基于初始酵母或微生物的RNA含量預(yù)測出來的含量和/或在目前可獲得的酵母提取物中發(fā)現(xiàn)的含量要高的組合物。
在對微生物細(xì)胞進(jìn)行處理以釋放出細(xì)胞內(nèi)容物之前，優(yōu)選對所述微生物細(xì)胞進(jìn)行處理以使所述細(xì)胞中存在的天然的酶失活。通常，在自溶微生物提取物中RNA會被降解或修飾，對該RNA的分離因此也就缺少吸引力了。
例如用熱激(heat shock)對發(fā)酵培養(yǎng)液中天然的酶進(jìn)行失活是可行的，所述熱激例如5至10分鐘，適合在80°C _97°C的溫度下進(jìn)行。該處理應(yīng)當(dāng)至少使降解所述微生物 RNA的酶(例如，磷酸酶、foiase、Fdase)失活。因此，優(yōu)選地，在該處理之后所述微生物RNA 將不會被降解或修飾。RNA降解可能發(fā)生于稍后的階段，例如，通過加入合適的酶。
在本發(fā)明的方法中，對微生物細(xì)胞進(jìn)行處理以釋放出包含RNA的細(xì)胞內(nèi)容物。通過該處理，細(xì)胞壁被破碎和/或破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。
為了從細(xì)胞中釋放出細(xì)胞內(nèi)容物，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)處理、機(jī)械處理或酶處理。
機(jī)械處理包括均質(zhì)(homogenisation)技術(shù)。為此目的，適用高壓均質(zhì)機(jī)是可行的。其它的均質(zhì)技術(shù)可以包括用顆粒例如沙和/或玻璃珠來混合，或者研磨裝置(例如玻珠研磨機(jī))。
化學(xué)處理包括使用鹽、堿和/或一種或多種表面活性劑或去垢劑?；瘜W(xué)處理是較不優(yōu)選的，因為它們可能導(dǎo)致RNA的部分降解，尤其是用到堿的時候，以及導(dǎo)致隨后2’ -核糖核苷酸和3’ -核糖核苷酸的形成。
優(yōu)選地，用酶進(jìn)行該溶解或細(xì)胞壁裂解步驟，因為就此可以獲得對該過程的更好的控制。此外，酶的使用使得該方法特別適合于大規(guī)模的應(yīng)用。若干種酶制劑都可以使用， 包括纖維素酶、葡聚糖酶、半纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶或果膠酶。例如，可以使用蛋白酶， 例如內(nèi)切蛋白酶。用于酶的反應(yīng)條件取決于所使用的酶。通常，所述的微生物細(xì)胞被酶處理1至M小時，在4至10的PH和40°C至70°C的溫度下進(jìn)行。
化學(xué)處理或酶處理之后，優(yōu)選地，所用的化學(xué)物質(zhì)或酶應(yīng)在使得RNA不會被實質(zhì)上改變和/或降解的條件下被中和或失活。
對酶的失活可通過pH處理或者優(yōu)選地，通過熱處理來進(jìn)行。
隨后，將釋放出的細(xì)胞內(nèi)容物中存在的RNA與其它可溶性微生物細(xì)胞物質(zhì)分離。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以將可溶的RNA與其它可溶性物質(zhì)分離，例如RNA的選擇性沉淀或者色譜方法。優(yōu)選地，通過超濾(UF)來進(jìn)行RNA與其它可溶性微生物細(xì)胞物質(zhì)的分離。超濾很經(jīng)濟(jì)又很方便，特別適合大規(guī)模應(yīng)用以及制造食品級產(chǎn)品。就實驗室規(guī)模而言，對RNA的分離可以若干種途徑來進(jìn)行，其中每種都能獲得非常純凈的少量 RNA樣品。這些方法通常勞動強(qiáng)度大且很昂貴。本發(fā)明提供了特別適用于大規(guī)模分離RNA 或5’ -核糖核苷酸的方法，該方法還允許以有商業(yè)吸引力的規(guī)模來生產(chǎn)RNA或5’ -核糖核苷酸。本發(fā)明的方法產(chǎn)生了良好純度且高產(chǎn)量的5’-核糖核苷酸。大規(guī)模意味著本發(fā)明方法中的初始材料可以是IOm3或更大的發(fā)酵罐中生產(chǎn)的微生物的發(fā)酵培養(yǎng)液。在用UF來分離RNA與其它可溶性細(xì)胞物質(zhì)的情況下，可以使用具有10_50kD分子量分離點(diǎn)(cut-off)的過濾器，優(yōu)選是20-50kD。通常，較大的過濾器尺寸允許較高的過濾器流量，但也可能導(dǎo)致較大的損失和/或較為不純凈的產(chǎn)品。從超濾步驟產(chǎn)生的滲余物中回收RNA部分(fraction)。本領(lǐng)域的技術(shù)人很清楚最終組合物中5’-核糖核苷酸的量會受到方法中所用的超濾器類型的影響，并會受到超濾步驟中洗滌效率的影響。經(jīng)過分離的RNA可被轉(zhuǎn)化為5’ -核糖核苷酸，優(yōu)選是使用酶來進(jìn)行的。5’-磷酸二酯酶(5’-Fdase)可被用于進(jìn)行RNA到5’-核糖核苷酸的轉(zhuǎn)化。5’-磷酸二酯酶可從微生物來源或植物來源(例如，麥芽根的提取物)獲得。商業(yè)上可獲得的微生物的5’-Fdase的一個例子是Amano (日本)生產(chǎn)的RP-I酶。脫氨酶，例如腺嘌呤脫氨酶可被用于將5’ -AMP轉(zhuǎn)化為5’ -IMP。商業(yè)上可獲得的脫氨酶的一個例子是Amano (日本) 生產(chǎn)的脫氨酶500。用5’ -Fdase和脫氨酶進(jìn)行的從RNA到5’ -核糖核苷酸的轉(zhuǎn)化可用兩步法或一步法來進(jìn)行。在分離RNA之前，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，將來自微生物細(xì)胞(例如細(xì)胞壁)的固體物質(zhì)與釋放出的細(xì)胞內(nèi)容物里存在的可溶性物質(zhì)(包括RNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)、油脂和維生素)分離。這可以通過任何適于開展固/液分離的方法來達(dá)成。例如可以使用離心或過濾。當(dāng)在RNA與其它可溶性微生物細(xì)胞物質(zhì)的分離之前未除去來自微生物細(xì)胞的固體時，所述固體物質(zhì)可在完成RNA到5’ -核糖核苷酸的轉(zhuǎn)化之后通過任何固 /液分離方法來除去。應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明上下文中，類似于“將存在于釋放出的細(xì)胞內(nèi)容物中的RNA與其它可溶性細(xì)胞物質(zhì)分離”的措辭或類似于“將經(jīng)過分離的RNA轉(zhuǎn)化為5’ -核糖核苷酸”的措辭并不一定意味著所有RNA都應(yīng)被分離或轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很清楚被分離出的 RNA的數(shù)量將取決于所用的分離方法的類型；被轉(zhuǎn)化的RNA的量將取決于若干種因素，例如取決于所用的酶的類型。在RNA向5’_核糖核苷酸轉(zhuǎn)化之后，以及可選地，在除去來自微生物細(xì)胞的固體物質(zhì)之后獲得的含有5’ -核糖核苷酸的部分，優(yōu)選地從比5’ -核糖核苷酸分子量更高的化合物中來提純，優(yōu)選通過超濾。純化的程度將取決于所用的超濾膜的分子量分離點(diǎn)。含有5’ -核糖核苷酸的部分，(可選地，在通過超濾進(jìn)行的純化之后，)通常作為可被進(jìn)一步濃縮和/或干燥的溶液通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得。可用本發(fā)明方法獲得的包含5’ -核糖核苷酸的組合物，具有高的5’ -核糖核苷酸含量，在味道上是純凈的。本說明書中出現(xiàn)的“味道上純凈”指當(dāng)以合適的量將本發(fā)明的組合物加到食品或飼料中時，在所述食品和/或飼料中，極少有或不存在任何是從中獲得所述組合物的微生物所典型具有的特殊的味道和/或氣味，或者任何來自所述組合物的肉湯或類似肉湯的味道和/或氣味。優(yōu)選地，在本發(fā)明組合物中極少有或不存在微生物所典型具有的任何特殊的味道和/或氣息和/或氣味。例如，使用Saccharomyces作為初始材料的情況下，組合物沒有酵母味道；使用 Candida作為初始材料的情況下，組合物沒有甜味。以合適的量應(yīng)用于食物制品時，該組合物將不提供肉湯或類似肉湯的味道。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述5’ -核糖核苷酸組合物可按照任何想要的比例加入到傳統(tǒng)的酵母提取物中。作為結(jié)果，可以獲得具有任何想要的5’ -核糖核苷酸含量的酵母提取物。本發(fā)明的組合物來自天然的來源，特別是優(yōu)選為食物級的微生物。根據(jù)本發(fā)明的含有5’ -核糖核苷酸的組合物可被用于任何食品或飼料產(chǎn)品中，尤其是為了改善和/或增加其味道和/或香氣和/或口感。可加入所述組合物的典型的食品類型包括日常食品、烘焙食品、蔬菜、水果、肉、糖果、脂肪、油、飲料(例如，碳酸飲料或來自日常食品的飲料，例如牛奶，來自蔬菜、水果的飲料、酒精飲料等)或任何從上述食品加工得到的食品。本發(fā)明的組合物在具有降低的或較低的總脂肪的食品(或飲料)中也有合適的應(yīng)用。在本發(fā)明的上下文中，具有降低的或較低的總脂肪的食品，通常是通過加工、配方或?qū)е缕渲邪目傊窘档偷脑倥浞?，?或用脂肪替代品對所述總脂肪的替代，從相應(yīng)的全脂食品中獲得的。所述過程和所述的脂肪替代品是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。具有降低的或較低的總脂肪的食品的明顯缺點(diǎn)是此類食品缺乏相應(yīng)全脂食品或飲料制品的豐富香味。通過用本發(fā)明的組合物來增強(qiáng)具有降低的或較低的總脂肪的食品的味道和/或香氣和/或口感中的脂肪氣味可以克服掉該缺點(diǎn)。后者意味著所述包含有本發(fā)明組合物的具有降低的或較低的總脂肪的食品具有與相應(yīng)全脂食品的味道和/或香氣和/ 或口感更為相似的味道和/或香氣和/或口感。本發(fā)明的組合物還在包含人工加甜劑的食品中具有合適的應(yīng)用。與使用人工加甜劑相關(guān)的明顯缺點(diǎn)是副味或后味(例如苦味)在食品中的存在或發(fā)展。單獨(dú)或組合使用時存在上述問題的最常用的人工加甜劑是安賽蜜-K、阿力甜(alitame)、阿斯巴甜、環(huán)己基氨基磺酸鹽(cyclamate)、紐甜(neotame)、新橙皮甘(neohesperidine)、糖精、甜葉菊甙、 蔗糖素(sucralose)和甜蛋白(thaumatin)。通過使用本發(fā)明的組合物來掩蓋食品或飲料中人工加甜劑的副味或后味可以克服該缺點(diǎn)。本發(fā)明還包括包含人工加甜劑和本發(fā)明組合物的組合物。本發(fā)明的組合物可被用來增加飲料中更為特別的味道和/或香氣和/或口感，具體而言，在飲料的味道和/或香氣中增加特定蔬菜的氣味和/或水果氣味和/或酒精氣味。 例如，它們可被用于在蔬果汁中增加特定的蔬菜味道和/或蔬菜香氣，在水果汁中增加特定的水果味道和/或水果香氣，在酒精飲料，尤其是那些具有低或降低的酒精含量的酒精飲料(例如葡萄酒和啤酒)中增加特定的酒精味道和/或酒精香氣。在上述應(yīng)用中加到食品或飲料中的5’ -核糖核苷酸組合物的量將取決于食品或飲料的類型以及取決于所述的應(yīng)用。5’-核糖核苷酸組合物的量可以在例如0. 0001% w/w 至10% w/w中變化，所述的量是相對于所述食品或飲料而言的。現(xiàn)在將通過一些實施例來對本發(fā)明進(jìn)行闡釋，所述實施例并不是要限制本發(fā)明的范圍。實施例1在連續(xù)直通熱交換器(continuous flowthrough heat exchanger)中，于 95°C對 40000kg的膏狀酵母(干固體為18. 2% )進(jìn)行10分鐘的熱處理，以失活所有的酵母酶活性。隨后，用 Pescalase(來自 Bacillus Iicheniformis 的內(nèi)切蛋白酶，DSM N. V.，荷蘭) 在pH8. 0和62°C對失活的酵母分批進(jìn)行6小時的處理。此后，在70°C通過對所述蛋白酶進(jìn)行1小時的熱處理(分批)使其失活，用鹽酸將PH降至5. 3。通過連續(xù)離心從反應(yīng)混合物中除去固體物質(zhì)。在50kD的超濾器上對剩下的上清液進(jìn)行超濾以將高分子量的部分(包括RNA)與低分子量的物質(zhì)分離，所述低分子量的物質(zhì)例如無機(jī)成分、維生素、碳水化合物 (例如海藻糖)、游離氨基酸、肽和小的蛋白質(zhì)。然后在PH5. 3和65°C對所述高分子量的部分(滲余物UFl)與5’ -磷酸二酯酶分批進(jìn)行15小時的培養(yǎng)，以將RNA水解成5’ -核糖核苷酸。接著，通過脫氨酶在PH5. 1和55°C進(jìn)行的2. 5小時的培養(yǎng)，將釋放出的5’_AMP轉(zhuǎn)化為5’ -IMP。最后，用50kD的過濾器對所述反應(yīng)混合物再次進(jìn)行超濾。濾液的干固體主要由5’ -核糖核苷酸(濾液UF2)組成。根據(jù)下述方法通過HPLC對樣品進(jìn)行RNA含量和/或5’-核糖核苷酸含量的分析。 樣品中的RNA在堿處理階段被水解。用5’ -GMP作為標(biāo)準(zhǔn)，用Whatman Partisil 10-SAX 柱，用pH 3. 35的磷酸緩沖液作為洗脫液以及UV檢測，通過HPLC來對GMP (即從RNA水解得到的2’ -GMP和3’ -GMP)進(jìn)行定量?；跓o氯化鈉干物質(zhì)的RNA的重量百分比相當(dāng)于基于無氯化鈉干物質(zhì)的游離GMP的重量百分比的 4倍。還可對過濾物UF2的5，-GMP、5，-IMP、5，-AMP和谷氨酸含量進(jìn)行分析。用Whatman Partisil 10-SAX柱，用pH3. 35的磷酸緩沖液作為洗脫液以及UV檢測，通過HPLC來測定樣品中5’ -GMP、5’ -IMP和5’ -AMP的量(以基于無氯化鈉的干物質(zhì)的其二鈉七水合物的重量百分比來表示)?；?’ -GMP、5’ -IMP和5’ -AMP的標(biāo)準(zhǔn)來計算濃度。利用在食物和其它物質(zhì)測試試齊Ll盒(Boehringer Mannheim/R-Biopharm, Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis,Catalogue No. 10139092035，Catalogue year 2004, R-BIOPHARM AG,Darmstad, Germany)中測定L-谷氨酸的L-谷氨酸Colorimetric方法來測定谷氨酸的量。表1中顯示了所述提取方法的數(shù)據(jù)。表1 核苷酸提取方法的數(shù)據(jù)
5，- 5’- 谷氨 5，-
數(shù)量干固體干固體RNA*
GMP* IMP*** 酸** AMP**
(kg) (%w/w) (kg) * (%)
______** (%) (%) (%) *(%)
膏狀酵母40000 18.2072808.2
上清液 *54100 8.77475010.35.5
滲余物 UFl 81207.8063272.5____04__
濾液 UF2*101603.984040.0 24.5 24.1 0.50
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*包括洗滌液體基于無NaCl的干固體***基于無NaCl的干固體，以2Na. 7aq表示組合物中5’ -核糖核苷酸的量是大約97% w/w，這是基于無氯化鈉的干物質(zhì)的。實施例2于95°C對2100g膏狀酵母的一部分(干固體為18. 2% )進(jìn)行10分鐘的熱處理， 以失活所有的酵母酶活性。隨后，用Pescalase(來自Bacillus Iicheniformis的內(nèi)切蛋白酶，DSM N. V.，荷蘭)在pH8.0和62對失活的酵母分批進(jìn)行6小時的處理。此后，在70°C 通過對所述蛋白酶進(jìn)行1小時的熱處理(分批)使其失活，用鹽酸將PH降至5. 3。在50kD 的超濾器上對水解物進(jìn)行超濾以將高分子量的部分及細(xì)胞壁(包括RNA)與低分子量的可溶性物質(zhì)分離，所述低分子量的物質(zhì)例如無機(jī)成分、維生素、碳水化合物(例如海藻糖)、游離氨基酸、肽和小的蛋白質(zhì)。然后在PH5. 3和65°C將所述滲余物與5’-磷酸二酯酶進(jìn)行15 小時的培養(yǎng)，以將RNA水解成5’ -核糖核苷酸。接著，通過脫氨酶在pH5. 1和55°C進(jìn)行的 2. 5小時的培養(yǎng)，將釋放出的5’ -AMP轉(zhuǎn)化為5’ -IMP。最終，通過離心去除所述固體，用去礦質(zhì)水洗滌顆粒部分，并再次離心。兩份上清液(初級上清液和洗滌液)被合并，在50kD 超濾器上對整體進(jìn)行超濾，以將低分子量的物質(zhì)包括5’ -核糖核苷酸與高分子量的物質(zhì)分離。得到的超濾液被濃縮及噴霧干燥。對得到的粉末分析其5’ _GMP、5’ -IMP和5’ -AMP的濃度。此外，在終產(chǎn)物中測量谷氨酸和氯化鈉的濃度，以及在膏狀酵母中測量RNA的濃度。通過用Jenway氯化物測量儀 PCLM3 (Jenway, Essex, England)在樣品中測量氯離子以及計算相應(yīng)的氯化鈉的量，來對氯化鈉進(jìn)行測定。表2中顯示了所述提取方法的數(shù)據(jù)。表2 核苷酸提取方法的數(shù)據(jù)(50kD UF過濾器)
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含谷氨酸鹽和基于無NaCl的干重而言至少55% W/V5’-核糖核苷酸，其中所述谷氨酸鹽與5’ -核糖核苷酸的比例小于0. 1 ；并且該比例大于0. 001。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含基于無NaCl的干重而言至少 65% w/w的5，-核糖核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含基于無NaCl的干重而言至少 75% w/w的5’ -核糖核苷酸。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述谷氨酸鹽與5’-核糖核苷酸的比例小于0.05 且大于0. 001。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述谷氨酸鹽與5’-核糖核苷酸的比例小于0.01 且大于0. 001。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含基于無NaCl的干重而言0.01% 至10% w/w的谷氨酸鹽。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含的5’-GMP的量多于5’ -IMP和 5’ -AMP的總和。
8.如權(quán)利要求1至7中任意一項所述的組合物在食品或飼料中的用途。
9.如權(quán)利要求1至7中任意一項所述的組合物的用途，所述用途用于增加具有降低的或較低的總脂肪的食品的味道和/或香氣和/或口感中的脂肪氣味。
10.如權(quán)利要求1至7中任意一項所述的組合物的用途，所述用途用于掩蓋食品中人工加甜劑的后味。
11.如權(quán)利要求1至7中任意一項所述的組合物的用途，所述用途用于增加飲料的味道和/或香氣和/或口感中特定的蔬菜氣味和/或水果氣味和/或酒精氣味。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)5’-核糖核苷酸的方法。本發(fā)明描述了包含至少55％w/w(基于無氯化鈉干重)的5’-核糖核苷酸的組合物，以及用于生產(chǎn)該組合物的方法，所述方法包括如下步驟(i)處理微生物細(xì)胞，以釋放出包含RNA的細(xì)胞內(nèi)容物；(ii)將存在于釋放出的細(xì)胞內(nèi)容物中的RNA與其它可溶性細(xì)胞物質(zhì)分離；(iii)將經(jīng)過分離的RNA轉(zhuǎn)化為5’-核糖核苷酸。
文檔編號C12Q1/00GK102524737SQ201210028479
公開日2012年7月4日 申請日期2004年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月27日
發(fā)明者伯圖斯·諾丹姆, 珍·格瑞特·科圖特斯 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司