專利名稱：甜瓜枯萎病雙側分子標記鑒定技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明技術專利屬于農作物生物技術育種領域，本技術利用多聚酶鏈式反應(PCR技術)，借助與抗枯萎病基因緊密連鎖的雙側分子標記ML430和MR296來擴增甜瓜基因組特定區(qū)段的DNA片段?？共∑贩N和感病品種所擴增的DNA片段大小有差異，通過電泳技術可以在圖片上現象出來，即可根據此片段的大小判斷被鑒定品種對枯萎病的抗病性。
背景技術：
甜瓜枯萎病(Fusarium oxysperium)是瓜類嚴重病害之一,常造成大片瓜田植株死亡，甚至絕收，而且為害程度逐年加重。據調查，一般發(fā)病年份發(fā)病株率20%-30%，死亡株率10%左右；重發(fā)生年發(fā)病株率在30%以 上，死亡株率高達30%—50%，甚至絕產(孫桂華等，2005)。該病是典型的土傳病害，從苗期到成株期均可發(fā)病，結瓜中期為發(fā)病高峰，常引起瓜秧枯萎死亡，對瓜的品質、產量影響很大。甜瓜抗病主基因的發(fā)現目前，據報道甜瓜枯萎病的抗性主基因比較明確的主要有3個。1973年，Risser報道了兩個抗病基因，分別為Fom-1和Fom_2。其中，Fom-1來自品種Doublon，抗甜瓜枯萎病?；蜕硇》N0和2，感生理小種I和1.2，Fom-2來自品種CM17187，抗生理小種0和I，感生理小種2和1.2，Joobeur等2004年克隆分離到該基因。Zink (1985)在品種Perlita FR中發(fā)現了第3個抗病基因Fom_3，該基因與Fom-1不等位，抗生理小種0和2。甜瓜中與枯萎病連鎖的分子標記的開發(fā) Joobeur等2004年在克隆抗枯萎病主基因Fom-2的研究中，發(fā)現有多個分子標記與Fom-2緊密連鎖，遺傳順序為SSR430-SSR138-Fom-2 -SSR181-SSR184-STS296-SSR180，可用來輔助篩選與鑒定 Fom_2。另夕卜，Ali Oumouloud 等(2008)利用 Charentais-Foml XTRG-1551 組合的 F2 群體，篩選到 3個 RAPD 標記(B17649, V01578, and V061092)與 Fom-1 連鎖。甜瓜品種抗枯萎病的鑒定方法危害甜瓜的主要是尖鐮刀菌甜瓜?；偷牟≡?。常用鑒定方法主要是苗期人工接種鑒定方法，一種是浸根法，另一種是傷根法。人工接種鑒定法有一定的局限性，能否觀察到病癥收到孢子濃度、接種和觀察時間、鑒定期間的溫度和濕度的影響。分子標記鑒定方法能有限克服人工接種鑒定的局限性。第一，取材方便，可利用種子、根、莖、葉片等植株的任意組織器官；第二，不受苗的發(fā)育時間影響，在整個發(fā)育期均可鑒定；第三，不受發(fā)病條件的影響，直接從DNA水平上發(fā)現片段大小的差異，從而判斷抗病性。但也有一定的局限性，即分子標記與抗病基因是否連鎖緊密，距離越近，鑒定結果越準確，反之，則不準確，特別是利用單個標記進行鑒定時。本研究利用與抗枯萎病基因緊密連鎖的雙側分子標記，可降低單側標記由于遺傳交換而發(fā)生的誤判現象。

發(fā)明內容
要解決的技術問題:本研究為了克服人工接種鑒定甜瓜枯萎病抗病性不準的缺點，即鑒定結果易受到接種用孢子濃度的大小、接種和觀察時間、鑒定期間的溫度和濕度的影響，從而造成錯判現象。本技術發(fā)明則利用與抗枯萎病基因緊密連鎖的雙側分子標記來直接擴增各品種的DNA序列，再根據抗病、感病標準鑒定寄主的DNA片段進行比較，就可鑒定品種是否有抗病性。本技術取材方便、不受發(fā)病條件的影響，鑒定準確，苗或植株是否發(fā)病都可用于鑒定。本技術發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:
(1)采用CTAB法從任意組織或器官(如種子、根、葉片、莖桿等)中提取基因組DNA；
(2)以基因組DNA為模板，利用與Fom2連鎖的分子標記擴增不同品種的特異DNA片段，即PCR技術的應用；
(3)利用2-3%的瓊脂糖凝膠電泳技術，分離從不同品種中所擴增的與枯萎病基因連鎖的DNA片段，使不同大小的DNA片段跑在不同的位置；
(4)凝膠電泳結果成像，即將電泳好的膠放在紫外線下，經過染色的DNA可在紫外線下顯現出來，從而肉眼可看到從不同品種中擴增的DNA片段跑在膠中的位置，離點樣孔距離遠的，是小DNA片段，離得近的，即跑的慢的就是大DNA片段；
(5)與標準鑒定寄主所擴增的片段比較，與抗病寄主所擴增的DNA在同一個水平線上的品種則為抗病品種，與感病寄主所擴增的DNA在同一個水平線上的品種則為感病品種。當兩側標記帶型均為抗病類型時，該品種為抗病品種；當兩側標記帶型均為感病類型時，該品種為感病品種；兩側標記帶薪類型不同時，則需要進一步做人工鑒定。
本技術發(fā)明的有益效果是，可以從DNA水平上根據不同品種所擴增的DNA片段大小，來準確地鑒定出甜瓜品種是否具有抗枯萎病的特性。
具體實施例方式1.DNA 提取
采用CTAB方法提取DNA。DNA提取效果比SDS提取方法好，去糖效果明顯。具體方法如下:
(1)取少量葉片于Eppendorf管中(約70_100mg),置液氮中冷凍Imin；
(2)打開管蓋，用小木棒搗碎幼葉(注:搗一會兒再放入液氮中，凍后再搗，直到非常碎為止，一般3次為好)；然后，每個管中放入3個小鋼珠管中，振蕩器振蕩3-4次；
(3)視材料多少加入600-700ul已預熱的DNA提取液(CTAB)，輕輕混勻后，置于65°C水浴保溫25 min，其間搖動2_3次；
(4)在管中加入等體積的苯酚/氯仿￠00-700111),上下顛倒5min使充分混勻，靜置抽提5 min ；
(5)4。。下12000r/min離心5 min,吸取上清液到新的Eppendorf管中；
(6)加入與上清液等體 積的異丙醇混勻，常溫放置10min ；
(7)4°C下12000r/min離心5 min，輕輕倒去液體，保留管底離心沉淀物(DNA沉淀物)；(8)加入70%的酒精500-600ul，輕搖離心管，離心，去上清液，再加入70%酒精，反復操作兩次；
(9)沉淀吹干，50ul TE或ddH20溶解DNA，加0.4%RNase酶備用，或可放入_30°C中保存。2.PCR反應與產物檢測
2.1 PCR技術擴增特異片段
采用20ML的反應體系(表5.3.2): PCR的緩沖液2.0ML，的MgCl2 2.0ML，的dNTP 0.4ML，引物 1.5ML，模板 DNA 2.0 ML，Taq 酶 I U，加 ddH20 補足 20ML。PCR 擴增條件為:(1) 94°C 預變性 5min ；(2) 94°C變性 Imin ； (3) 50 - 60。。退火lmin，溫度因引物不同而異(引物ML430:正向引物5’-CCATCATGAITTGGAATGAATTAG-3’，反向引物 5’- CGirGCAAITTGATCnTTTAAT-3’；引物 ML296:5’- CCACAAAAAGGAGCTTGACC- 3’；5， - GCCAATTGCCCAAATCAG- 3，。)
;(4)72°C延伸Imin ;擴增30-35個循環(huán)；最后，72°C延伸IOmin，4°C保溫。
2.2 PCR產物的檢測
(I)瓊脂糖凝膠(3%)電泳法檢測程序(200 ml膠為例):
第一步溶膠稱取6 g瓊脂糖放入500 ml三角瓶中，加入200 ml TAE (pH=8.0)溶解，然后放入微波爐中加熱溶解。注意:新膠制備時需要反復多次加熱，特別需要防止膠沸騰溢出。第二步加染色劑。待膠冷卻至60度左右，加入10 ul ( 5 ug/ul)的EB(溴化乙錠)染色劑，混合均勻。第三步裝膠板。將膠倒入準備好的制膠板內，插入梳子。待膠完全凝固后，輕輕拔出梳子，將膠連同膠板一起放入電泳槽內電泳，電泳槽內加入TAE溶液，使膠剛好淹沒即可。第四步點樣。將準備好的PCR擴增樣品(每管加入l_2ul載樣緩沖液)依次點入點樣孔。點樣量一般為10 ul左右。第五步電泳。電壓一般按膠版長度5 V / cm設置,設置好時間，開始電泳。第六步凝膠成像檢測。將電泳好的膠放在凝膠成像系統，使用紫外線進行檢測，拍下檢測結果。注意戴好防護面具或關好儀器門，以防止紫外線對皮膚的損傷。第七步判斷品種的抗病性在電泳圖上，如附

圖1和附圖2說明，將待測品種擴增的DNA條帶與抗病、感病品種的條帶位置進行比較，對于標記ML430而言，DNA帶跑在前面的品種為感病的，在后面的 為抗病品種；對于標記MR296而目，DNA帶跑在后面的品種為感病的，在前面的為抗病品種。
權利要求
1.一種甜瓜枯萎病雙側分子標記鑒定技術，利用PCR技術，通過分子標記擴增DNA片段，比較DNA片段大小和電泳位置，鑒定品種的抗病性。
2.其特征是利用與枯萎病基因緊密連鎖的雙側標記，左側標記為ML430，右側標記為MR296，擴增特異DNA片段，通過比較大小能更準確的鑒定品種的抗性，減少單側標記鑒定中由于遺傳交換而出現 誤判的現象。
全文摘要
甜瓜枯萎病抗性品種雙側分子標記鑒定技術利用多聚酶鏈式反應，借助與甜瓜抗枯萎病基因緊密連鎖的雙側分子標記ML430與MR296來擴增特異DNA片段。而抗病品種和感病品種所擴增的DNA片段大小上的差異可通過電泳技術在瓊脂糖凝膠上顯示在不同的位置，再與標準抗病品種和感病品種中所擴增的DNA片段的大小和位置比對，大小相同或處于同一個位置的即為同一類型的品種。兩個分子標記的帶型均為抗病類型時，該品種即為抗病品種。本方法取材方便、鑒定準確，不受植物生長發(fā)育和氣候條件的影響。主要用途本技術發(fā)明主要用于篩選鑒定抗枯萎病的品種資源，也可用于甜瓜分子標記輔助育種。
文檔編號C12Q1/68GK103243152SQ201210029980
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月11日 優(yōu)先權日2012年2月11日
發(fā)明者邵元健 申請人:邵元健