專利名稱：表達(dá)o型口蹄疫病毒空衣殼的重組缺損腺病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組腺病毒，尤其涉及表達(dá)0型口蹄疫病毒空衣殼的重組缺損型腺病毒及其構(gòu)建方法，本發(fā)明進(jìn)一步涉及該重組缺損腺病毒在制備預(yù)防或治療口蹄疫疫苗中的應(yīng)用，屬于口蹄疫的防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
口蹄疫是豬、牛、羊等主要家畜和其它家養(yǎng)、野生偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達(dá)70多種?？谔阋叩呐R床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水泡。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類傳染病之首。目前，有三分之二的OIE成員國流行FMD，時(shí)刻威脅著無FMD國家和地區(qū)的家畜安全和畜產(chǎn)品貿(mào)易?？谔阋卟《?Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，其直徑為 23納米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七個(gè)血清型C、A、O、C、南非I、南非2、南非3和亞洲I型，以及65個(gè)以上亞型。0型口蹄疫為全世界流行最廣的一個(gè)血清型，中國流行的口蹄疫主要為O、A、C三個(gè)血清型及ZB型(云南保山型)?？谔阋卟《靖餮逯g沒有交叉保護(hù)，即使是同一血清型內(nèi)的不同亞型之間抗原差異程度也較大，以至于一種亞型的疫苗可能不完全保護(hù)同一血清型中其它亞型FMDV的感染，給口蹄疫的防治帶來了極大的困難。疫苗接種是成功預(yù)防、控制乃至最終消滅口蹄疫的最有效手段。目前用于防治口蹄疫的疫苗主要有合成肽疫苗和滅活疫苗兩種。合成肽疫苗是基于病毒的主要抗原位點(diǎn)，利用病毒的主要抗原位點(diǎn)的一部分氨基酸序列合成的具有一定結(jié)構(gòu)的多肽，用于免疫動物誘導(dǎo)中和抗體而達(dá)到保護(hù)的目的。但是，如果在病毒的主要抗原位點(diǎn)上發(fā)生關(guān)鍵氨基酸的突變，就會導(dǎo)致合成肽疫苗免疫保護(hù)效力的喪失。口蹄疫滅活疫苗在消滅歐洲的口蹄疫以及控制世界其他國家的口蹄疫過程中發(fā)揮了重要作用。但是，滅活疫苗的生產(chǎn)中需要密閉設(shè)施來繁殖活病毒，存在活病毒逃逸的潛在風(fēng)險(xiǎn)，世界上一些地區(qū)FMD的暴發(fā)似乎與滅活疫苗中殘存的活病毒有關(guān)。此外，制備FMD滅活疫苗的抗原未經(jīng)提純，含有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，難于進(jìn)行感染動物和免疫動物的鑒別診斷。鑒于FMD滅活疫苗的上述缺點(diǎn)，國內(nèi)外研究者都在尋求一種更加安全有效的口蹄疫疫苗。理想的口蹄疫疫苗具有病毒的完整抗原譜，其免疫原性類似與天然的病毒顆粒，并且沒有病毒的核酸，不能自主復(fù)制等特點(diǎn)。如今成為研究熱點(diǎn)的口蹄疫候選疫苗包括蛋白質(zhì)亞單位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗和重組病毒等。到目前為止，證明最有效的FMD新型疫苗是人5型復(fù)制缺損型腺病毒(Ad5)表達(dá)的口蹄疫病毒空衣殼。Ad5作為一個(gè)理想的載體的重要原因是因?yàn)槠涿庖邉游锖蟛划a(chǎn)生針對Ad5的中和抗體，排除了二次免疫的干擾。研制出安全、高效、免疫保護(hù)期更長的以腺病毒為載體的口蹄疫病毒空衣殼疫苗，對于口蹄疫的有效預(yù)防將具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供編碼0型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組P1-2A-3C以及該亞基因組P1-2A-3C的突變體；本發(fā)明的目的之二是提供攜帶亞基因組P1-2A-3C或該亞基因組P1-2A-3C的突變體并能夠穩(wěn)定表達(dá)0型口蹄疫病毒空衣殼的重組缺損型腺病毒；本發(fā)明的目的之三是提供一種構(gòu)建上述重組缺損型腺病毒的方法；本發(fā)明目的之四是將所構(gòu)建的重組缺損型腺病毒應(yīng)用于制備成預(yù)防或治療口蹄疫病毒空衣殼疫苗或試劑。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了編碼0型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組 P1-2A-3C，其核苷酸序列為SEQ ID No. I所示。此外，本發(fā)明還提供了該亞基因組P1-2A-3C的突變體，其核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示。構(gòu)建口蹄疫病毒空衣殼必須保證在完整正確的FMDV基因組結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上精確拼接FMDV的P1-2A和3C基因以形成完全正確的亞基因組，否則將對口蹄疫病毒空衣殼的形成造成嚴(yán)重的影響。只有口蹄疫病毒P1-2A-3C亞基因組序列得到正確拼接，3C蛋白酶才能充分裂解口蹄疫前體蛋白并完成病毒空衣殼的組裝，這對后期的動物免疫試驗(yàn)的效果會產(chǎn)生重要甚至決定性影響。Mayr 等(Mayr, G. A.，Chinsangaram, J.，Grubman, M. J.，1999， Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containingthe capsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus as avaccine candidate. Virology 263，496-506.)構(gòu)建了含 A 型 FMDV 亞基因組 P1-2A-3C 的重組腺病毒，并對一株重組腺病毒的3C蛋白酶基因進(jìn)行了突變，從而使3C蛋白酶不能發(fā)揮裂解蛋白的作用，在后期的動物免疫試驗(yàn)中此株重組腺病毒就不能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生中和抗體。本發(fā)明將所拼接的編碼口蹄疫病毒空衣殼的P1-2A-3C亞基因組序列或其突變體導(dǎo)入到腺病毒中篩選獲到兩株穩(wěn)定、高效表達(dá)FMD病毒空衣殼的重組腺病毒，這兩株重組腺病毒免疫的小鼠產(chǎn)生了高水平的口蹄疫病毒中和抗體，同時(shí)在C57BL/6鼠體內(nèi)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生完全的保護(hù)性免疫，這也驗(yàn)證了本發(fā)明在體外正確地拼接了 0型口蹄疫病毒的亞基因組P1-2A-3C或其突變體，因此在腺病毒感染的293細(xì)胞中FMDV空衣殼蛋白得到正確表達(dá)、裂解和組裝，因而在動物體內(nèi)誘導(dǎo)堅(jiān)強(qiáng)而持久的保護(hù)性免疫。篩選到穩(wěn)定、高效表達(dá)口蹄疫病毒空衣殼的重組腺病毒是本發(fā)明的另一重要之目的，為此，本發(fā)明提供了兩株穩(wěn)定、高效表達(dá)口蹄疫病毒空衣殼的重組腺病毒。其中一株是攜帶有SEQ ID No. I所示的編碼0型口蹄疫病毒空衣殼亞基因組的重組缺損型腺病毒(rAdV-0-P12A3C)，另外一株是攜帶SEQ ID No. 2所示的編碼0型口蹄疫病毒突變株空衣殼的亞基因組的重組復(fù)制缺損型腺病毒(rAdV-Om-P12A3C)。本發(fā)明用間接免疫熒光試驗(yàn)和Western blot檢測重組腺病毒rAdV-0_P12A3C中的SEQ ID No. I所示的亞基因組在293細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)測定其一步生長曲線；然后用rAdV-O-P12A3C免疫BALB/c小鼠，研究該重組腺病毒在鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答；最后，在C57BL/6小鼠體內(nèi)評價(jià)其攻毒保護(hù)效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示該重組缺損型腺病毒的滴度達(dá)7. 2X 108PFU/ml，重組腺病毒rAdV-0_P12A3C在病毒傳代過程中穩(wěn)定表達(dá)并能夠形成FMD病毒空衣殼；rAdV-O-P12A3C接種BALB/c小鼠后9周(二免后3周)中和抗體達(dá)到峰值；rAdV-O-P12A3C接種C57BL/6小鼠后的3、5、7和14天用同型口蹄疫病毒攻擊，均產(chǎn)生完全的免疫保護(hù)。這些結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的用缺損腺病毒5型表達(dá)的O型口蹄疫病毒空衣殼在小鼠體內(nèi)可持續(xù)誘導(dǎo)高水平的中和抗體并可抵抗病毒的攻擊，作為預(yù)防或治療O型口蹄疫的候選疫苗。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，近年來中國流行的0型FMDV毒株產(chǎn)生了 2個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異(site I)，造成了一個(gè)優(yōu)勢FMDV中和表位的部分改變，為了研制能夠更好地覆蓋0型FMDV抗原譜的疫苗，本發(fā)明在構(gòu)建的0型質(zhì)粒pShuttle-0-P12A3C的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)突變引物進(jìn)行定點(diǎn)誘變，構(gòu)建了 0型FMDV突變株P(guān)1-2A-3C亞基因組的重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C。為此，本發(fā)明提供了另一株能夠穩(wěn)定表達(dá)口蹄疫病毒空衣殼的重組復(fù)制缺損型腺病毒(rAdV-Om-P 12A3C)，該0型突變體重組腺病毒(rAdV-Om-P 12A3C)與0型重組腺病毒(rAdV-O-P12A3C)相比較，只是在于上述的2個(gè)氨基酸的變化，其余的基因及其氨基酸序列均未發(fā)生任何變化。同時(shí)，0型突變體重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定也同于0型重組腺病毒。該0型突變體重組復(fù)制缺損型腺病毒攜帶有SEQ ID No. 2所示的編碼0型口蹄疫病毒突變株的亞基因組，毒價(jià)達(dá)7. 4 X 108PFU/ml，能夠在各種表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)0型口蹄疫病毒突變株的空衣殼。用FMDV共享表位單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光檢測呈陽性，用Western blot檢測 呈現(xiàn)中等強(qiáng)度的陽性反應(yīng)，表明其口蹄疫病毒空衣殼在293細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。本發(fā)明繪制一步生長曲線測定重組腺病毒rAdV-0m-P12A3C在293細(xì)胞中的復(fù)制能力。同時(shí)，在C57BL/6小鼠體內(nèi)評價(jià)了其攻毒保護(hù)效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C傳至第8代、在接種后60h，病毒的復(fù)制水平達(dá)到高峰。病毒在復(fù)制過程中能夠形成FMDV病毒空衣殼，并在病毒傳代過程中穩(wěn)定地表達(dá)。rAdV-0m-P12A3C接種C57BL/6小鼠后的3天、5天、7天和14天用同型口蹄疫病毒攻擊，均產(chǎn)生完全的免疫保護(hù)。本發(fā)明將所篩選到的穩(wěn)定、高效的表達(dá)口蹄疫病毒空衣殼、病毒滴度為7. 2X108PFU/ml的第8代重組復(fù)制缺損型腺病毒(rAdV-O-P12A3C)提交專利認(rèn)可的微生物保藏機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏號是=CGMCC No. 5719 ;分類命名是人血清5型復(fù)制缺損型腺病毒；保藏時(shí)間是2012年I月16日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明將所篩選到的另一株穩(wěn)定、高效的表達(dá)口蹄疫病毒空衣殼、病毒滴度為7. 4X108PFU/ml的第8代重組復(fù)制缺損型腺病毒(rAdV-Om-P12A3C)提交專利認(rèn)可的微生物保藏機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏號是=CGMCC No. 5717 ;分類命名是人血清5型復(fù)制缺損型腺病毒；保藏時(shí)間是2012年I月16日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建所述重組缺損型腺病毒rAdV-0_P12A3C的方法，該方法包括以下步驟^fSEQ ID No. I所示的亞基因組和腺病毒穿梭質(zhì)?？刹僮餍缘倪B接，得到重組腺病毒穿梭表達(dá)載體；將重組腺病毒穿梭表達(dá)載體與腺病毒骨架載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得了以質(zhì)粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將克隆化重組腺病毒基因組線型化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得重組缺損型腺病毒rAdV-O-P12A3C。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建所述重組缺損型腺病毒rAdV-0m-P12A3C的方法，該方法包括以下步驟將SEQ ID No. 2所示的亞基因組的突變體和腺病毒穿梭質(zhì)?？刹僮鞯倪B接，得到重組腺病毒穿梭表達(dá)載體；將重組腺病毒穿梭表達(dá)載體與腺病毒骨架載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得了以質(zhì)粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將克隆化重組腺病毒基因組線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得重組的缺損型腺病毒rAdV-Om-P12A3C 其中，所述的腺病毒穿梭質(zhì)粒選自 p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack或pAdTrack-CMV ;所述的病毒骨架載體質(zhì)粒選自pAdEasy-1或pAdEasy-2。本發(fā)明所篩選到的兩株重組缺損腺病毒滴度高，在復(fù)制過程中能夠形成口蹄疫病毒空衣殼，并在病毒傳代過程中穩(wěn)定地表達(dá)，所表達(dá)的口蹄疫病毒空衣殼在小鼠體內(nèi)可持續(xù)誘導(dǎo)高水平的中和抗體并可抵抗病毒的攻擊，可作為預(yù)防或治療0型口蹄疫的疫苗。用本發(fā)明重組缺損腺病毒所制備的疫苗不含有口蹄疫病毒遺傳物質(zhì)，因此不具有感染性，安全性更高；該疫苗不必加佐劑，副作用更小；該疫苗接種后可獲得更持久的免疫反應(yīng)和較長的免疫保護(hù)期；該疫苗以復(fù)制缺損型腺病毒作為載體，其在體內(nèi)不復(fù)制，再次接種時(shí)不干擾疫苗的免疫效果。


圖I重組腺病毒rAdV-0-P12A3C感染293細(xì)胞引起的細(xì)胞病變；(A)正常293細(xì)胞；(B)感染 rAdV-O-P12A3C 的 293 細(xì)胞。圖2重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C感染293細(xì)胞引起的細(xì)胞病變；(A)正常293細(xì)胞；(B)感染 rAdV-Om-P12A3C 的 293 細(xì)胞。圖3 重組腺病毒 rAdV-0-P12A3C 的 PCR 鑒定；L DL 15000 DNA Ladder ;1 3 :在293細(xì)胞中傳至第4代、6代和8代rAdV-0-P12A3C ；4 =WtAdV作為陰性對照。圖4重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C的PCR鑒定；1 wtAdV ;2 5 :在293細(xì)胞中傳至第 2 代、4 代、6 代和 8 代 rAdV-Om-P12A3C ；L DL 15000 DNA Ladder。圖5用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測重組腺病毒rAdV-0_P12A3C感染的293細(xì)胞；(A)rAdV-O-P12A3C感染的293細(xì)胞；(B)wtAdV感染的293細(xì)胞作為陰性對照。圖6用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C感染的293細(xì)胞；(A)rAdV-Om-P12A3C感染的293細(xì)胞；(B)wtAdV感染的293細(xì)胞作為陰性對照。圖7Western blot分析FMDV空衣殼在重組腺病毒rAdV-0_P12A3C感染細(xì)胞中的表達(dá)；1.野生型腺病毒感染的293細(xì)胞；2. FMDV 146S蛋白；3預(yù)染的蛋白Marker ;4 7.第2代、4代，6代和8代rAdV-0-P12A3C感染的293細(xì)胞。圖8Western blot分析FMDV空衣殼在重組腺病毒rAdV-0m_P12A3C感染細(xì)胞中的表達(dá)；1.野生型腺病毒感染的293細(xì)胞；2 3.第6代、8代rAdV-Om-P12A3C感染的293細(xì)胞；4. FMDV 146S蛋白；5預(yù)染的蛋白Marker。圖9重組腺病毒rAdV-0_P12A3C的一步生長曲線。圖10重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C的一步生長曲線。圖11重組腺病毒rAdV-0_P12A3C免疫BALB/c鼠的IgG抗體動態(tài)變化；A :重組腺病毒rAdV-0-P12A3C免疫組；B 0型口蹄疫BEI滅活病毒免疫組；C =Asial和0型口蹄疫雙價(jià)滅活商品苗免疫組；D Ad5野生型腺病毒免疫對照組；A和D組在第一次免疫后第6周以相同劑量加強(qiáng)免疫和C組在第一次免疫后第4周以相同劑量加強(qiáng)免疫。圖12重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫BALB/c鼠的IgG抗體動態(tài)變化；A :重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫組；B :0型口蹄疫BEI滅活病毒免疫組；C =Asial和0型口蹄疫雙價(jià)滅活商品苗免疫組；D Ad5野生型腺病毒免疫對照組;A和D組在第一次免疫后第6周以相同劑量加強(qiáng)免疫和C組在第一次免疫后第4周以相同劑量加強(qiáng)免疫。圖13重組腺病毒rAdV-0-P12A3C免疫BALB/c鼠的中和抗體動態(tài)變化;A :重組腺病毒rAdV-0-P12A3C免疫組；B :0型口蹄疫BEI滅活病毒免疫組；C :Asial和0型口蹄疫雙價(jià)滅活商品苗免疫組；D Ad5野生型腺病毒免疫對照組；A和D組在第一次免疫后第6周以相同劑量加強(qiáng)免疫和C組在第一次免疫后第4周以相同劑量加強(qiáng)免疫。圖14重組腺病毒rAdV-0m-P12A3C免疫BALB/c鼠的中和抗體動態(tài)變化；A :重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫組；B :0型口蹄疫BEI滅活病毒免疫組；C =Asial和0型口蹄疫雙價(jià)滅活商品苗免疫組；D Ad5野生型腺病毒免疫對照組;A和D組在第一次免疫后第6周以相同劑量加強(qiáng)免疫和C組在第一次免疫后第4周以相同劑量加強(qiáng)免疫。
圖15重組腺病毒rAdV-0-P12A3C免疫C57BL/6鼠不同時(shí)間對同源FMDV攻毒的保護(hù)；A :重組腺病毒rAdV-0-P12A3C免疫組；B =Asial和0型口蹄疫雙價(jià)滅活商品苗免疫組；C :Ad5野生型腺病毒免疫對照組；D :PBS空白對照組；各試驗(yàn)組的鼠分別在在接種后3天、5天、7天和14天用同型口蹄疫病毒攻擊，每只400LD5(i。圖16重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫C57BL/6鼠不同時(shí)間對同源FMDV攻毒的保護(hù)；A :重組腺病毒rAdV-Om-P12A3C免疫組；B =Asial和0型口蹄疫雙價(jià)滅活商品苗免疫組；C Ad5野生型腺病毒免疫對照組；D :PBS空白對照組；各試驗(yàn)組的鼠分別在在接種后3天、5天、7天和14天用同型口蹄疫病毒攻擊，每只80LD5(i。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)驗(yàn)材料腺病毒骨架載體pAdEasy-1、腺病毒穿梭載體pShut11e-CMV、大腸桿菌BJ5183感受態(tài)菌以及AD-293細(xì)胞均購自Stratagene公司。大腸桿菌JM109、DH5 a感受態(tài)細(xì)胞和pOK質(zhì)粒由本發(fā)明人試驗(yàn)室保存。Pme I和Pac I均為NEB BioLabs產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent 購自 QIAGEN 公司?？谔阋卟《?VP2 單克隆抗體 4B2 (于力等，抗口蹄疫病毒血清型共享單克隆抗體及其識別的抗原表位，中國發(fā)明專利申請?zhí)?00910161346. 9)由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存。無外源基因表達(dá)的野生型腺病毒(wtAd)由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。商品化的Asial和0型口蹄疫雙價(jià)滅活苗購自新疆天康公司(生產(chǎn)批號:2010025)。I、重組復(fù)制缺損型腺病毒(rAdV-O-P 12A3C)和重組復(fù)制缺損型腺病毒(rAdV-Om-P12A3C)的構(gòu)建和鑒定I. 10型FMDV亞基因組組P1、2A和3C基因的拼接根據(jù)0型FMDV 0/YS/CHA/05株全長基因組，分別設(shè)計(jì)上下游引物(表I)，采用PCR方法分別擴(kuò)增P1-2A和3C基因，將pOK和P1-2A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行HindIII和BamHI酶切，連接后轉(zhuǎn)化并且篩選陽性克隆，酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為p0K_P12A。將POK與3C基因的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行XhoI和EcoRV酶切，連接后轉(zhuǎn)化并且篩選陽性克隆，進(jìn)行酶切和測序鑒定，測序正確的重組質(zhì)粒命名為P0K-3C。將pOK-P12A和pOK-3C分別進(jìn)行XhoI和EcoRV酶切，連接后轉(zhuǎn)化并且篩選陽性克隆，進(jìn)行酶切和測序鑒定，測序正確的重組質(zhì)粒命名為p0K-0-P12A3C。表I用于0型FMDV的P1、2A和3C亞基因組拼接的引物1. 2重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建
權(quán)利要求
1.編碼O型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組P1-2A-3C，其特征在于其核苷酸序列為SEQID No. I 所示。
2.編碼O型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組P1-2A-3C的突變體，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示。
3.攜帶有權(quán)利要求I所述亞基因組的重組腺病毒。
4.攜帶有權(quán)利要求2所述亞基因組的突變體的重組腺病毒。
5.按照權(quán)利要求3所述的重組腺病毒，其特征在于，其微生物保藏號是CGMCCNo.5719。
6.按照權(quán)利要求4所述的重組腺病毒，其特征在于，其微生物保藏號是CGMCCNo.5717。
7.—種構(gòu)建權(quán)利要求3或5所述的重組腺病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將SEQ ID No. I所示的亞基因組和腺病毒穿梭質(zhì)?？刹僮鞯倪B接，得到重組腺病毒穿梭表達(dá)載體；將重組腺病毒穿梭表達(dá)載體與腺病毒骨架載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得了以質(zhì)粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將克隆化重組腺病毒基因組線型化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得重組缺損型腺病毒。
8.—種構(gòu)建權(quán)利要求4或6所述的重組腺病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將SEQ ID No. 2所示的亞基因組的突變體和腺病毒穿梭質(zhì)?？刹僮鞯倪B接，得到重組腺病毒穿梭表達(dá)載體；將重組腺病毒穿梭表達(dá)載體與腺病毒骨架載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得了以質(zhì)粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將克隆化重組腺病毒基因組線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得重組的缺損型腺病毒。
9.權(quán)利要求I所述的亞基因組或權(quán)利要求2所述的的亞基因組突變體在制備預(yù)防或治療口蹄疫的藥物或試劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3-6任何一項(xiàng)所述的重組腺病毒在制備預(yù)防或治療口蹄疫的藥物或試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了表達(dá)O型口蹄疫病毒空衣殼的重組缺損腺病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明首先精確構(gòu)建了編碼O型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組或其突變體，其核苷酸序列分別為SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示；將其與腺病毒表達(dá)載體可操作性連接得到重組腺病毒穿梭表達(dá)載體，進(jìn)而與腺病毒骨架載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了克隆化重組腺病毒基因組；將其線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得兩株重組復(fù)制缺損型腺病毒。本發(fā)明的重組缺損腺病毒滴度高，在復(fù)制過程中能夠形成口蹄疫病毒空衣殼，并在病毒傳代過程中穩(wěn)定、高效地表達(dá)口蹄疫病毒空衣殼，所表達(dá)的空衣殼在小鼠體內(nèi)可持續(xù)誘導(dǎo)高水平的中和抗體并可抵抗病毒的攻擊，可作為預(yù)防或治療口蹄疫的疫苗。
文檔編號C12N15/861GK102747092SQ20121003011
公開日2012年10月24日 申請日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者于力, 周國輝, 楊德成 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所