專(zhuān)利名稱(chēng)：腸出血性大腸桿菌O157:H7多價(jià)fliC-hcpA-tir-eae重組菌及疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸出血性大腸桿菌0157:H7多價(jià)融合型重組菌、重組蛋白制備方法及亞單位疫苗，屬于生物制藥領(lǐng)域。背景技術(shù)：
腸出血性大腸桿菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是重要的食源性人獸共患病原，0157:H7是其重要的血清型。近20余年來(lái)，EHEC 0157:H7引發(fā)的食物中毒在世界各地包括中國(guó)都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHEC 0157 :H7感染患者和無(wú)癥狀攜帶者可作為傳染源。在動(dòng)物宿主范圍非常廣泛，其中反芻動(dòng)物帶菌率較高。相對(duì)來(lái)講，動(dòng)物作為傳染源要比人類(lèi)更為重要，它往往是動(dòng)物源食品污染的根源。人類(lèi)感染可引起嚴(yán)重的胃腸道和循環(huán)系統(tǒng)疾病，如出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic Colitis, HC)、溶血尿毒綜合征(Haemolytic uraemic syndrome, HUS)等,個(gè)別患者可因急性和慢性腎功能衰竭而死亡。動(dòng)物感染一般不引發(fā)明顯的臨床癥狀，但能夠長(zhǎng)期甚至終生攜帶。EHEC動(dòng)物宿主范圍非常廣泛，其中反芻動(dòng)物帶菌率較高。因此，防控EHEC 0157:H7 的重中之重是減少和控制動(dòng)物帶菌和排菌。目前，對(duì)0157:H7的感染缺乏有效的防治方法，只能給予對(duì)癥治療和適當(dāng)?shù)目咕委?。由?157:H7的暴發(fā)流行特點(diǎn)和治療上的困難，疫苗研究就顯得極為緊迫。有效的疫苗研制是預(yù)防和治療0157:H7感染最簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和快捷的手段。選取與EHEC 0157:H7粘附和定植密切相關(guān)的鞭毛(H7)、菌毛(HCP)和緊密素 (Intimin)和轉(zhuǎn)位緊密素受體(Tir)四個(gè)基因分別設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)，擴(kuò)增相應(yīng)基因片段， 并依次串聯(lián)，構(gòu)建重組菌，獲得重組蛋白，制備亞單位疫苗，用于預(yù)防EHEC 0157:H7在動(dòng)物體內(nèi)的定植。三、發(fā)現(xiàn)內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明目的在于構(gòu)建EHEC 0157:H7多價(jià)融合型重組菌，表達(dá)重組蛋白，進(jìn)而研制亞單位疫苗。本發(fā)明在抗原選擇上直接針對(duì)EHEC 0157:H7重要的粘附因子，強(qiáng)調(diào)多個(gè)粘附因子的聯(lián)合應(yīng)用以產(chǎn)生最大的免疫保護(hù)作用，降低動(dòng)物帶菌率，進(jìn)而減少人類(lèi)感染 EHEC的機(jī)會(huì)，保障人類(lèi)身心健康。技術(shù)方案本發(fā)明的具體實(shí)施方案如下
腸出血性大腸桿菌0157:H7 (EHEC 0157:H7)多價(jià)融合型重組菌、重組蛋白制備方法及亞單位疫苗，其特征在于，所說(shuō)的多價(jià)重組菌和重組蛋白為BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。多價(jià)重組菌和重組蛋白的制備方法包括
(I)腸出血性大腸桿菌0157:H7免疫多價(jià)融合型重組菌，其構(gòu)建方法為
根據(jù)GenBank中0157 :H7 EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分別設(shè)計(jì)引物， 并分別在上下游引物兩端加入酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，在AcW基因后和me基因前加入長(zhǎng)度為24個(gè)核苷酸的連接片段(陰影部分)，引物序列如下
fliC~ I 5-ggggagctcactattaccaacaaa-3Sac IfHC-V2 5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3Xhol I
AcpA-Pl 5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3Xhol I
hcpA~ 2 5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR I tir~ l 5-gatgaattcgagccggatagccca-3EcoR I
tir~ 2 5-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3Sal I
eae~V\ 5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc-3 Sal I eae~ 2 :5_ ggctctagattattctacacaaaccgc-3Xba I
0157 :H7過(guò)夜培養(yǎng)物，ImL/管，12000r離心2分鐘，棄上清，收集菌體重懸于1/5體積雙蒸水，煮10min，4°C 12000r離心10分鐘，吸取上清凍存_20°C，用于PCR擴(kuò)增用；
擴(kuò)增片段的上下游引物分別加有fee I和通I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增eae片段的上下游引物分別加有免7 1和油<3 I酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)條件均為95°C預(yù)變性5分鐘，94°C I分鐘，55°C 30秒，72 0C I分鐘，30個(gè)循環(huán)，72°C再延伸10分鐘；
擴(kuò)增AcW片段的上下游分別引物加有ZAW I和及I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增iir片段的上下游引物分別加有I和I酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)條件均為95°C預(yù)變性5分鐘，94°C I分鐘，56 V 30秒，72 °C 30秒，30個(gè)循環(huán)，72 °C再延伸6分鐘。fIiC-VI 和 fIiC-Vl、hcpA-PI 和 IwpA-P2、tir~ I 和 iir_P2、eae_PI 和 eae_P2 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為945bp、438bp、327bp和891bp。擴(kuò)增的fliC片段位于閱讀框538-1483 核苷酸之間；擴(kuò)增的hcpA片段位于閱讀框19-441核苷酸之間；擴(kuò)增的tir片段位于閱讀框 775-1083核苷酸之間；擴(kuò)增的eae片段位于閱讀框1995-2805核苷酸之間。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量比I. 2%的瓊脂糖電泳，切膠稱(chēng)重，加入3倍體積DE-A緩沖液后65°C作用10分鐘，待膠全部融化后，再加入DE-A緩沖液的O. 5體積的DE-B緩沖液，顛倒混勻后，將融化的液體轉(zhuǎn)移于微型柱子，并12000g離心I分鐘，棄液體，加入洗滌緩沖液I 500uL, 12000g離心30秒，再棄液體，加入洗滌緩沖液II 750uL, 12000g離心I分鐘， 棄液體，空管12000g離心I分鐘，轉(zhuǎn)移柱子于干凈的I. 5mL離心管中，并加入60uL洗脫緩沖液，12000g離心I分鐘，收集離心液，即為經(jīng)過(guò)純化的945bp、438bp、327bp和891bp片段， 命名為fliC、hcpA、tir和eae片段。將fee I和沿07 I酶切的fliC片段4uL與同樣酶切的載體pCold I片段4uL， T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. OuL，同時(shí)加入一個(gè)離心管，混勻后，4°C連接過(guò)夜，用于轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Sac I和 Xhol I雙酶切，37°C水浴2小時(shí),瓊脂糖凝膠電泳,可以看到一條945bp的條帶出現(xiàn),獲得 pCold I -/YiCr重組質(zhì)粒；用ZAo 1和&0/ I酶切hcpA片段和pCold I -fliC重組質(zhì)粒, 膠回收后，PCold I -fliCM 4. OuL, hcpA片段取2 uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul,補(bǔ)水2 uL, —同加入eppendorf管,混勻后，4°C連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到438bp的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -f liC-hcpA重組質(zhì)粒；用AcoTP I和5^7 I酶切tir 片段和 pCold I -fliC-hcpA 重組質(zhì)粒,膠回收后,pCold I -fliC-hcpA 取 2. OuL, tir 片段取3. O uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，補(bǔ)水3 uL，一同加入離心管中， 4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C 水浴2小時(shí),瓊脂糖凝膠電泳,可以看到327bp的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC-hcpA-tir重組質(zhì)粒；用I和油<3 I酶切eae片段和pCold I -fliC-hcpA-tir重組質(zhì)粒，膠回收后，pCold I -fliC-hcpA-tir 和 eae 各取 4. OuL，T4 DNA 連接緩沖液和 T4 DNA 連接酶各I. Oul，一同加入管中，混勻后，4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到891bp 的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重組質(zhì)粒，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒 pCold I -fliC-hcpA-tir-eae轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得多價(jià)重組菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。(2)多價(jià)重組菌的構(gòu)建、多價(jià)重組融合蛋白的表達(dá)和純化
將BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)培養(yǎng)物按體積比2%接種于含lOOPg/mL有氨芐抗生素的LB中，37°C振蕩培養(yǎng)至A=O. 6^0. 8時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至工作濃度為0. 5mM,繼續(xù)15°C震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)菌液離心收集菌體重懸于TE緩沖液中，超聲裂解后，12000g 離心25分鐘，收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小為88kD目的蛋白， 主要存在于菌體上清中，獲得fliC-hcpA-tir-eae多價(jià)重組蛋白。將上述誘導(dǎo)重組菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)經(jīng) 12000 g 離心 10 分鐘，收集菌體，用1/10體積的螯合緩沖液重懸，再加入lmg/mL的溶菌酶，混勻后30°C作用2 小時(shí)，超聲波進(jìn)行超聲破碎，4°C 12000 g離心30分鐘收集上清，0.45μΜ濾器過(guò)濾后上經(jīng)過(guò)預(yù)處理(4倍柱體積的螯合緩沖液洗柱子)的Ni+親和層析柱，加入洗脫緩沖液收集蛋白，即為經(jīng)過(guò)純化的fliC-hcpA-tir-eae重組蛋白。(3) EHEC 0157:H7多價(jià)融合蛋白亞單位疫苗的制備
將上述純化的多價(jià)融合蛋白測(cè)定蛋白濃度，控制在0.2Pg/^L。抗原與佐劑 (ISA50V，法國(guó)S印pic公司生產(chǎn))按照1:1 (V/V)進(jìn)行分散處理制成油乳劑。有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下
I、本發(fā)明針對(duì)EHEC 0157:H7重要的粘附因子串聯(lián)構(gòu)建了融合型重組菌。利用PCR，獲得fliC、hcpA、tir和eae四個(gè)基因片段，并通過(guò)串聯(lián)，最終克隆入表達(dá)質(zhì) IipCold中，成功構(gòu)建pCold-fliC-hcpA-tir-eae，轉(zhuǎn)化入BL21中獲得重組菌，即BL21 (pCoId-fIiC-hcpA-tir-eae)。2、本發(fā)明成功獲得BL21 (pCo I d-f I i C-hcpA-t i r-eae )，經(jīng)過(guò)3 7 °C高密度發(fā)酵培養(yǎng)，15°C IPTG的誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)，表達(dá)量約占全菌蛋白的30%，經(jīng)過(guò)純化后獲得重組融合型蛋白，即fliC-hcpA-tir-eae重組蛋白。3、本發(fā)明將純化后的fliC-hcpA-tir-eae重組蛋白制備了亞單位疫苗，免疫了 Balb/c小鼠和山羊，明確了上述表達(dá)的重組蛋白具有良好的抗原性，為更加安全而有效的防控腸出血性大腸桿菌的感染和致病提供了有效的技術(shù)方法。四

圖I :pCold-fliC-hcpA-tir_eae重組質(zhì)粒酶切鑒定。M, DL-2000 ; 1-3, pCold-fliC-hcpA-tir-eae 重組質(zhì)粒質(zhì)粒 I /Xba I 圖 2 BL21 (pCo I d-f I i C-hcpA-t ir-eae )重組菌電泳分析。Μ,中分子量蛋白質(zhì)Marker ;l,BL21(pCold-fliC-hcpA-tir-eae)誘導(dǎo)后全菌蛋白； 2,1^21(卩(]01(1-;1^1;[011。卩六-1:;[1'-636)誘導(dǎo)前全菌蛋白；3,BL21 (pCold-fliC-hcpA-tir-eae) 誘導(dǎo)后全菌蛋白上清圖3 :免疫后小鼠血清中IgG滴度測(cè)定圖4 :免疫組和對(duì)照組小鼠攻擊排菌變化圖5 :免疫后山羊糞便中IgG滴度測(cè)定圖6 :免疫組和對(duì)照組山羊攻擊排菌變化五具體實(shí)施例方式
I、獲取fliC、hcpA、tir和eae基因，并串聯(lián)克隆入pCold載體根據(jù)GenBank中0157:H7 EDL933 (上海三踏生物科技有限公司)的(序列號(hào) L07388)、Ac/^ (序列號(hào)NC_013008)、iir (序列號(hào)AF125993)和 eae (序列號(hào):Z11541) 基因序列分別設(shè)計(jì)引物，并分別在上下游引物兩端加入酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，在AcW基因后和eae基因前加入長(zhǎng)度為24個(gè)核苷酸的連接片段(陰影部分)，引物序列如下
fHC-VI5-RRRRaRctcactattaccaacaaa-3Sac IfIiC-Yl5~ttactCRaRRRtCRttRcaRaacc-3Xhol IhcpA~ \5-RRRctCRaRtttacacttatCRaaotRat-3Xhol IhcpA~ 25-tttRaattctttaRcaRcaRctttaRcaRcaRCRttRRCRtcatc-3 EcoR Itir-Pl :5-RatRaattcRaRCCRRataRccca-3EcoR Itir~ 2 :5-ttaRtcRacaRcccccRatRaaac-3Sal Ieae~ \ :5-ttaRtcRacRctRctRctaaaRctRctRctaaatttRatcaaacc-3 Sal Ieae~ 2 :5- RRctctagattattctacacaaaccRC-3Xba I
0157 :H7過(guò)夜培養(yǎng)物，ImL/管，12000r離心2分鐘，棄上清，收集菌體重懸于1/5體積雙蒸水，煮10min，4°C 12000r離心10分鐘，吸取上清凍存_20°C，用于PCR擴(kuò)增用；
擴(kuò)增片段的上下游引物分別加有fee I和通I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增eae片段的上下游引物分別加有免7 1和油<3 I酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)條件均為95°C預(yù)變性5分鐘，94°C I分鐘，55°C 30秒，720C I分鐘，30個(gè)循環(huán)，72°C再延伸10分鐘;擴(kuò)增Ac如片段的上下游分別引物加有通I和及^7 I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增iir片段的上下游引物分別加有及^7 I和 Sal I酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)條件均為95°C預(yù)變性5分鐘，94°C I分鐘，56°C 30秒，72°C 30 秒，30個(gè)循環(huán)，72 °C再延伸6分鐘。fIiC-VI 和 fIiC-Vl、hcpA-PI 和 IwpA-P2、tir~ I 和 iir_P2、eae_PI 和 eae_P2 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為945bp、438bp、327bp和891bp。擴(kuò)增的fliC片段位于閱讀框538-1483 核苷酸之間；擴(kuò)增的hcpA片段位于閱讀框19-441核苷酸之間；擴(kuò)增的tir片段位于閱讀框 775-1083核苷酸之間；擴(kuò)增的eae片段位于閱讀框1995-2805核苷酸之間。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量比I. 2%的瓊脂糖電泳，切膠稱(chēng)重，加入3倍體積DE-A 緩沖液(天根公司)后65°C作用10分鐘，待膠全部融化后，再加入DE-A緩沖液的O. 5體積的DE-B緩沖液，顛倒混勻后，將融化的液體轉(zhuǎn)移于微型柱子(天根公司)，并12000g離心 I分鐘，棄液體，加入洗滌緩沖液I 500uL，12000g離心30秒，再棄液體，加入洗滌緩沖液
II750uL, 12000g離心I分鐘，棄液體，空管12000g離心I分鐘，轉(zhuǎn)移柱子于干凈的I. 5mL離心管中，并加入60uL洗脫緩沖液，12000g離心I分鐘，收集離心液，即為經(jīng)過(guò)純化的945bp、 438bp、327bp 和 891bp 片段，命名為 fliC、hcpA、tir 和 eae 片段。將fee I和沿o7 I酶切的fliC片段4uL與同樣酶切的載體pCold I (大連寶生物公司)片段4uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. OuL,同時(shí)加入一個(gè)離心管，混勻后，4°C連接過(guò)夜，用于轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用 Sac I和通I雙酶切，37°C水浴2小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到一條945bp的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I重組質(zhì)粒；用沿ο I和I酶切hcpA片段和pCold I -fliC重
組質(zhì)粒，膠回收后，PCold I 取4. OuL，hcpA片段取2 uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA 連接酶各I. Oul,補(bǔ)水2 uL, —同加入eppendorf管,混勻后,4 連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳， 可以看到438bp的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -f liC-hcpA重組質(zhì)粒；用AcoTP I和5^7 I酶切 tir 片段和 pCold I -fliC-hcpA 重組質(zhì)粒,膠回收后,pCold I -fliC-hcpA 取 2. OuL, tir 片段取3. O uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，補(bǔ)水3 uL，一同加入離心管中， 4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C 水浴2小時(shí),瓊脂糖凝膠電泳,可以看到327bp的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC-hcpA-tir 重組質(zhì)粒；用Sal I和ZAa I酶切eae片段和pCold I -fliC-hcpA-tir重組質(zhì)粒,膠回收后，pCold I -fliC-hcpA-tir和eae各取4. OuL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，一同加入管中，混勻后，4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化ToplO (南京百思凱)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到 891bp的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重組質(zhì)粒,將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒 pCold I -fliC-hcpA-tir-eae轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)(南京百思凱)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得多價(jià)重組菌 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。2、多價(jià)重組菌的構(gòu)建、多價(jià)重組融合蛋白的表達(dá)和純化
將 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)培養(yǎng)物按體積比 2% 接種于含 lOOPg/mL 有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L ;酵母提取物5g/L ;氯化鈉5g/L)中，37°C振蕩培養(yǎng)至A=O. 6 O. 8時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至工作濃度為O. 6mM，繼續(xù)15°C震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)菌液離心收集菌體重懸于TE緩沖液中，超聲裂解后，12000g離心25分鐘，收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小為88kD目的蛋白，主要存在于菌體上清中，獲得 fliC-hcpA-tir-eae多價(jià)重組蛋白。將上述誘導(dǎo)重組菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)經(jīng) 12000 g 離心 10 分鐘，收集菌體，用1/10體積的螯合緩沖液重懸，再加入lmg/mL的溶菌酶，混勻后30°C 作用2小時(shí)，超聲波進(jìn)行超聲破碎，4°C 12000 g離心30分鐘收集上清，0. 45μΜ濾器過(guò)濾后，加入到Ni+親和層析柱(上海英俊公司)，加入洗脫緩沖液收集蛋白，即為經(jīng)過(guò)純化的 fliC-hcpA-tir-eae 重組蛋白。3, EHEC 0157:H7多價(jià)融合蛋白亞單位疫苗的制備
將上述純化的多價(jià)融合蛋白測(cè)定蛋白濃度，控制在0. 2Pg/^L?？乖c佐劑ISA50V (法國(guó)Seppic公司生產(chǎn))按照1:1 (V/V)進(jìn)行分散處理制成油乳劑。4、免疫試驗(yàn) (一)小鼠試驗(yàn)
(I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取雄性BALB/c小鼠(揚(yáng)州大學(xué)購(gòu)買(mǎi))20只，18g-22g/只。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的前處理在攻毒前所有組均給予5g/L鏈霉素溶液飲用3天，3天后糞檢腸道排菌少于IO3 CFU/g，灌胃攻菌后全部給予0.5g/L的鏈霉素溶液飲用。以排除腸道正常菌群，為0157:H7在小鼠體內(nèi)馴化一個(gè)定居和生長(zhǎng)的環(huán)境，在腸道中成為優(yōu)勢(shì)菌群，
8增加小鼠的易感性。并在攻毒前斷水?dāng)嗍?2小時(shí)，攻毒后6小時(shí)恢復(fù)飲水飲食，防止攻毒后細(xì)菌快速排出動(dòng)物腸道，延長(zhǎng)在其體內(nèi)作用時(shí)間。(3)免疫攻毒和分組情況將20只小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，即實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用制備的亞單位疫苗，而對(duì)照組用等量的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液替代。采用背部及腹部皮下多點(diǎn)注射方式進(jìn)行免疫，免疫I次，免疫劑量為25ug/只。免疫后35天后進(jìn)行灌胃攻毒，劑量約為I X 101° CFU/只。攻菌后密切觀察各組小鼠的行為、攝食情況及精神狀態(tài)的變化，詳細(xì)統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡情況，并每隔兩天收集小鼠新鮮糞便，測(cè)定糞便中排菌時(shí)間和排菌量的變化情況。(4)免疫后血清中fliC-hcpA-tir-eae特異性IgG抗體的檢測(cè)
小鼠免疫前后，對(duì)小鼠采取斷尾方式采血制備血清，應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠免疫后血清IgG抗體效價(jià)。(5)免疫效果確定依據(jù)
①抗體變化利用ELISA檢測(cè)免疫后血清抗體變化，以重組抗原包被酶標(biāo)板，結(jié)果表明能夠誘導(dǎo)高滴度的IgG，達(dá)到3.89X 105以上，并且一致性良好。圖3。②攻毒保護(hù)情況35天攻毒，結(jié)果顯示免疫組小鼠存活率為10/10，對(duì)照組存活率為6/10。③排菌量變化攻毒后24小時(shí)開(kāi)始采集糞便，之后每隔兩天采集一次，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后涂布篩選性麥康凱平板，37°C培養(yǎng)18 24小時(shí)，取出平板計(jì)數(shù)，并對(duì)菌落用二重PCR 進(jìn)行鑒定，均為0157:H7。免疫組排菌時(shí)間縮短，免疫組攻毒之后第4天檢測(cè)不到0157:H7， 而對(duì)照組于第14d仍能檢測(cè)到高達(dá)IO4CFU以上的排菌，圖4。(二)山羊試驗(yàn)
Cl)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取雄性山羊(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院羊場(chǎng)購(gòu)買(mǎi))10只，3月齡。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的前處理在攻毒前所有山羊斷食斷水12小時(shí)，攻毒后6小時(shí)恢復(fù)飲水飲食，防止攻擊后細(xì)菌快速排出動(dòng)物腸道，延長(zhǎng)在其體內(nèi)作用時(shí)間。(3)免疫攻毒和分組情況將10只山羊隨機(jī)分為2組，5只/組。頸部多點(diǎn)注射免疫，免疫劑量為200ug/只。間隔21天后,進(jìn)行2次免疫,二次免疫后14天后進(jìn)行灌胃攻毒，劑量約為IXlOici CFU/只。攻菌后密切觀察各組羊的行為，并每隔2天收集山羊的新鮮糞便，測(cè)定糞便中排菌時(shí)間和排菌量的變化情況。(4)免疫后血清中fliC-hcpA-tir-eae特異性IgG抗體的檢測(cè)
山羊免疫前和二免后，耳靜脈采血制備血清，應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)免疫后血清IgG 抗體效價(jià)。(5)免疫效果確定依據(jù)
①抗體變化利用ELISA檢測(cè)免疫后血清抗體變化，以重組抗原包被酶標(biāo)板，結(jié)果表明能夠誘導(dǎo)高滴度的IgG，達(dá)到2. 48 X IO4以上。圖5。②攻毒保護(hù)情況對(duì)照山羊和免疫山羊沒(méi)有任何不良反應(yīng)，無(wú)死亡。③排菌量變化攻毒后24小時(shí)開(kāi)始采集糞便，之后每2天采集一次，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后涂布篩選性麥康凱平板，37°C培養(yǎng)18 24小時(shí)，取出平板計(jì)數(shù)，并對(duì)菌落用二重PCR 進(jìn)行鑒定，均為0157:H7。免疫山羊不排菌，而對(duì)照山羊第12天仍然在排菌。圖6。
權(quán)利要求
1 .腸出血性大腸桿菌0157:H7多價(jià)融合型重組菌，其構(gòu)建方法為根據(jù)GenBank中0157 :H7 EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分別設(shè)計(jì)引物， 并分別在上下游引物兩端加入酶切位點(diǎn)，在AcW基因后和me基因前加入長(zhǎng)度為24個(gè)核苷酸的連接片段，引物序列如下fHC-VI5-RRRRaRctcactattaccaacaaa-3Sac IfIiC-Yl5~ttactCRaRRRtCRttRcaRaacc-3Xhol IhcpA~ \5-RRRctCRaRtttacacttatCRaaotRat-3Xhol IhcpA~ 25-tttRaattctttaRcaRcaRctttaRcaRcaRCRttRRCRtcatc-3 EcoR Itir-Pl :5-RatRaattcRaRCCRRataRccca-3EcoR Itir~ 2 :5-ttaRtcRacaRcccccRatRaaac-3Sal Ieae~ \ :5-ttaRtcRacRctRctRctaaaRctRctRctaaatttRatcaaacc-3 Sal Ieae~ 2 :5- RRctctagattattctacacaaaccRC-3Xba I·0157 :H7過(guò)夜培養(yǎng)物，ImL/管，12000r離心2分鐘，棄上清，收集菌體重懸于1/5體積雙蒸水，煮10min，4°C 12000r離心10分鐘，吸取上清凍存_20°C，用于PCR擴(kuò)增用；擴(kuò)增片段的上下游引物分別加有fee I和通I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增eae片段的上下游引物分別加有免7 1和油<3 I酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)條件均為95°C預(yù)變性5分鐘，94°C I分鐘，550C 30秒，720C I分鐘，30個(gè)循環(huán)，72°C再延伸10分鐘;擴(kuò)增Ac如片段的上下游分別引物加有通I和及^7 I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增iir片段的上下游引物分別加有及^7 I和 Sal I酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)條件均為95°C預(yù)變性5分鐘，94°C I分鐘，56°C 30秒，72°C 30 秒，30個(gè)循環(huán)，72°C再延伸6分鐘；fIiC- I 和 fliC-V2、hcpA-V\ 和 Ac/^_P2、tir~ l 和 tir_ 2、eae~ l 和 eae_P2 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為945bp、438bp、327bp和891bp ;擴(kuò)增的fliC片段位于閱讀框538-1483核苷酸之間；擴(kuò)增的hcpA片段位于閱讀框19-441核苷酸之間；擴(kuò)增的tir片段位于閱讀框 775-1083核苷酸之間；擴(kuò)增的eae片段位于閱讀框·1995-2805核苷酸之間；將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量比I. 2%的瓊脂糖電泳，切膠稱(chēng)重，加入3倍體積DE-A緩沖液后65°C作用10分鐘，待膠全部融化后，再加入DE-A緩沖液的O. 5體積的DE-B緩沖液，顛倒混勻后,將融化的液體轉(zhuǎn)移于微型柱子,并12000g離心I分鐘，棄液體，加入洗滌緩沖液 I 500uL, 12000g離心30秒，再棄液體，加入洗滌緩沖液II 750uL, 12000g離心I分鐘，棄液體，空管12000g離心I分鐘，轉(zhuǎn)移柱子于干凈的I. 5mL離心管中，并加入60uL洗脫緩沖液， 12000g離心I分鐘，收集離心液，即為經(jīng)過(guò)純化的945bp、438bp、327bp和891bp片段，命名為 fliC、hcpA、tir 和 eae 片段；將fee I和沿o7 I酶切的fliC片段4uL與同樣酶切的載體pCold I片段4uL，T4 DNA 連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. OuL,同時(shí)加入一個(gè)離心管，混勻后，4°C連接過(guò)夜，用于轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Sac I和通W I雙酶切， 37°C水浴2小時(shí),瓊脂糖凝膠電泳,可以看到一條945bp的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC 重組質(zhì)粒；用沿ο I和及^7 I酶切hcpA片段和pCold I -fliC重組質(zhì)粒，膠回收后， pCold I取4. 0uL，hcpA片段取2 uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，補(bǔ)水2 uL, 一同加入eppendorf管，混勻后，4°C連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到438bp的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I -fliC-hcpA重組質(zhì)粒；用AcoTP I和Sal I酶切tir片段和 pCold I -fliC-hcpA 重組質(zhì)粒,膠回收后，pCold I -fliC-hcpA 取 2. OuL, tir 片段取3. O uL，T4 DNA連接緩沖液和T4 DNA連接酶各I. Oul，補(bǔ)水3 uL，一同加入離心管中， 4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C 水浴2小時(shí),瓊脂糖凝膠電泳,可以看到327bp的條帶出現(xiàn),獲得pCold I -fliC-hcpA-tir 重組質(zhì)粒；用I和油<3 I酶切eae片段和pCold I -fliC-hcpA-tir重組質(zhì)粒，膠回收后，pCold I -fliC-hcpA-tir 和 eae 各取 4. OuL，T4 DNA 連接緩沖液和 T4 DNA 連接酶各I. Oul，一同加入管中，混勻后，4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切，37°C水浴2小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳，可以看到891bp 的條帶出現(xiàn)，獲得pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重組質(zhì)粒，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒 pCold I -fliC-hcpA-tir-eae轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得多價(jià)重組菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。
2.權(quán)利要求I所述腸出血性大腸桿菌0157:H7多價(jià)融合型重組菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)表達(dá)的重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白，其特征在于，將權(quán)利要求I所述BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)培養(yǎng)物按體積比2%接種于含lOOPg/mL有氨芐抗生素的LB中，37°C振蕩培養(yǎng)至A=O. 6^0. 8時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至工作濃度為O. 5mM，繼續(xù)15°C震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)菌液離心收集菌體重懸于TE緩沖液中，超聲裂解后，12000g離心25min，收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小為 88kD目的蛋白，主要存在于菌體上清中，獲得fliC-hcpA-tir-eae多價(jià)重組蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白，其特征在于，將權(quán)利要求3所述經(jīng)過(guò)O.6mM IPTG 誘導(dǎo)的重組菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)菌液經(jīng)12000 g離心10分鐘，收集菌體，用1/10體積的螯合緩沖液重懸，再加入lmg/mL的溶菌酶，混勻后30°C作用2小時(shí)，超聲破碎，4°C 12000 g離心30分鐘收集上清，0.45μΜ濾器過(guò)濾后上親和層析柱，加入洗脫緩沖液收集蛋白，即為經(jīng)過(guò)純化的fliC-hcpA-tir-eae重組蛋白。
5.用權(quán)利要求I所述腸出血性大腸桿菌0157:H7多價(jià)融合型重組菌制備的疫苗。
6.用權(quán)利要求2-4之一所述重組蛋白制備的疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于，將權(quán)利要求2-4之一所述重組蛋白作為抗原，與佐劑ISA50V按照體積比I: I進(jìn)行分散處理制成油乳劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及腸出血性大腸桿菌O157:H7多價(jià)fliC-hcpA-tir-eae重組菌及疫苗，屬于生物制藥領(lǐng)域。分別擴(kuò)增出EHECO157:H7的H7鞭毛(fliC)基因、菌毛(hcpA)基因、轉(zhuǎn)位緊密素受體(tir)基因和緊密素(eae)基因，依次串聯(lián)，克隆入表達(dá)載體pCold中，獲得重組質(zhì)粒pCold-fliC-hcpA-tir-eae，在BL21(DE3)獲得高效表達(dá)。經(jīng)過(guò)高密度發(fā)酵和一系列的純化程序獲得高純度的融合蛋白分子疫苗。該疫苗的制備工藝簡(jiǎn)捷、易于放大、重復(fù)性好，所獲得目標(biāo)蛋白純度較高，動(dòng)物試驗(yàn)證明可刺激機(jī)體在體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫方面產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答，免疫預(yù)防保護(hù)和治療作用。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102586311SQ20121003091
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者何孔旺, 俞正玉, 倪艷秀, 葉青, 呂立新, 周俊明, 張雪寒, 李彬, 欒曉婷, 溫立斌, 王小敏, 茅愛(ài)華, 郭容利 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院