專利名稱：一種草魚基因組dna快速提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物組織DNA提取的方法，更具體的說(shuō)涉及一種草魚基因組DNA 的提取方法。
背景技術(shù)：
基因組DNA提取作為一項(xiàng)最基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)，是開(kāi)展諸多分子生物學(xué)研究的成功保證。對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物育種研究，基礎(chǔ)群體遺傳多樣性研究及早期選育工作，要求盡量保證在不處死并需要大量的研究個(gè)體。伴隨高通量測(cè)序技術(shù)及各種基因芯片的發(fā)展應(yīng)用， 大規(guī)模基因組DNA的提取已成為現(xiàn)在科研工作的必要，而目前許多DNA提取方法已經(jīng)不能很好的滿足這種要求。常規(guī)使用的酚/氯仿的基因組DNA提取方法，不僅操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，而且抽提過(guò)程中多次使用揮發(fā)性試劑，并產(chǎn)生大量的有毒廢液，既不安全也不環(huán)保。而采用試劑盒進(jìn)行大規(guī)模提取DNA，昂貴的價(jià)格不適于大規(guī)模作業(yè)。本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)便快捷并健康安全的草魚基因組DNA的提取方法。發(fā)明內(nèi)容DNA本發(fā)明的目的是提供一種草魚基因組DNA的快速提取方法，以克服現(xiàn)有DNA提取方法存在的缺陷，本發(fā)明的提取方法操作簡(jiǎn)單，快速、安全。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種草魚基因組DNA提取方法，包括以下步驟1)裂解草魚鰭條組織經(jīng)無(wú)菌水清洗后，吸干水分，剪成小碎塊，置于無(wú)菌離心管中，加入裂解液，顛倒混勻，45-65°C下，裂解1-2. 5小時(shí)至澄清得草魚鰭條組織裂解液，裂解過(guò)程中將離心管來(lái)回顛倒數(shù)次；2)離心將草魚鰭條組織裂解液在離心機(jī)上離心；3)吸附吸取草魚鰭條組織裂解液離心后的上清液，加入用NaAc溶液濾洗過(guò)的吸附柱中，其下面附收集管，靜置2-^iin后將吸附柱離心，棄去收集管中的廢液；4)漂洗向吸附柱中加入洗滌液后將吸附柱離心，棄去收集管中的廢液；5)溶解將漂洗后的吸附柱放置在無(wú)菌離心管中，靜置l-2min，加入無(wú)菌水，靜置 2-^iin后離心，離心管中即為收集的DNA。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟1)中裂解液由PH值為8.0，摩爾濃度為IM 的1Tris -HCl水溶液，pH值為8. 0，摩爾濃度為0. 5M的EDTANa2水溶液，質(zhì)量含量為10%的 SDS水溶液，無(wú)菌水，蛋白酶K按體積比5 20 10 64 1混合而成。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟1)中裂解液的其用量為lmg鰭條組織加入20 μ 1裂解液。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟3)中NaAc溶液為3Μ，冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至
5 · 2 ο在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟4)中洗滌液由pH值為7. 4，摩爾濃度為IM的Tris -HCl水溶液，pH值為8. 0，摩爾濃度為0. 5M的EDTA水溶液，無(wú)水乙醇，無(wú)菌水按體積比4 1 350 235混合而成。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟4)中洗滌液的體積為步驟幻中加入到吸附柱中上清液體積的1-3倍。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟幻中無(wú)菌水的體積為步驟幻中加入到吸附柱中上清液體積的0. 5-1. 2倍。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟2)-5)中，離心溫度為4_8°C下，離心轉(zhuǎn)速為 3000-5000rpm，離心時(shí)間為 l_5min。本發(fā)明的草魚基因組DNA提取方法與傳統(tǒng)的酚/氯仿的基因組DNA提取方法相比，不僅操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，減低繁瑣操作導(dǎo)致出錯(cuò)的概率，而且抽提過(guò)程中避免了使用大量的有毒試劑，更加健康環(huán)保；與試劑盒提取基因組DNA的方法相比，本發(fā)明的方法成本大大降低。


圖1是本發(fā)明的方法和傳統(tǒng)酚/氯仿法提取的草魚基因組DNA電泳結(jié)果，其中1-4 為本發(fā)明的方法提取獲得的DNA樣，5-8為傳統(tǒng)酚/氯仿法提取獲得的DNA樣，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000。圖2是本發(fā)明的方法和傳統(tǒng)酚/氯仿法提取的草魚基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中1-4為以本發(fā)明提取獲得DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5-8為以傳統(tǒng)酚/氯仿法提取獲得DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000。圖3本發(fā)明的方法和DNA提取試劑盒提取的草魚基因組DNA電泳結(jié)果，其中1_4 為本發(fā)明的方法提取獲得的DNA樣，5-8為DNA提取試劑盒提取獲得的DNA樣，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000。圖4是本發(fā)明的方法和DNA提取試劑盒提取的草魚基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中1-4為以本發(fā)明提取獲得DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5-8為以DNA提取試劑盒提取獲得DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例和對(duì)比例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。在以下實(shí)施例和對(duì)比例中，所用IM Tris · HCl (pH7. 4和pH8. 0)溶液通過(guò)如下方法制備121. Ig Tris堿于 800ml水中溶解，加入濃HCl調(diào)節(jié)pH值至所需值(ρΗ7· 4，HCl 70ml ；pH8. 0，HCl 42ml)，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)PH值，加水定溶至1L，分裝后高壓滅菌；所用0. 5M EDTANa2 (pH8. 0)溶液通過(guò)如下方法制備在800ml水中加入186. Ig 二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2 ·Η20)，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0 (約需20gNa0H顆粒)然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用；所用10% SDS (pH7. 2)溶液通過(guò)如下方法制備稱取IOOg電泳級(jí)SDS在900ml水中溶解，加熱至68°C助溶，加入幾滴濃鹽酸，調(diào)節(jié)溶液的PH至7. 2，加水定容至1L，分裝后備用；所用0. 5M EDTA (pH8. 0)溶液通過(guò)如下方法制備在800ml水中加入146. Ig乙二胺四乙酸，劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0 (約需20gNa0H顆粒)然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用；所用裂解液(500μ 1)體系由 25 μ 1 IM Tris · HCl (pH 8. 0), 100 μ 1 0. 5Μ EDTANa2 (ρΗ8. 0), 50 μ 1 10% SDS, 320 μ 1 無(wú)菌水，5 μ 1 蛋白酶 K 組成；所用洗滌液(500μ 1)體系由 4μ1 IM Tris · HCl (pH 7· 4)，1 μ 1 0. 5Μ EDTA (ρΗ8. 0)，350 μ 1無(wú)水乙醇，235 μ 1無(wú)菌水組成；所用3Μ NaAc (pH 5. 2)溶液可通過(guò)如下方法制備稱取40. 8gNaAc · 3H20,加水定溶至100ml，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5. 2 ；所用NaAc溶液濾洗吸附柱的過(guò)程為向吸附柱加入300 μ 1 3Μ NaAc (pH 5. 2)溶液，下面附收集管，靜置anin，4000rpnK4°C )離心lmin，棄去收集管中廢液；所用蛋白酶K，硅膠膜離子吸附柱及收集管子等試劑耗材購(gòu)置于天根生化科技 (北京)有限公司。所用2XTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1由天根生化科技有限公司生產(chǎn)。所采用微衛(wèi)星引物序列信息為(XiaJ. H. et al. A consensus linkage map of the grass carp (Ctenopharyngodon idella)based on microsatellites and SNPs. BMC Genomics 2010,11 :135.)CID1528F GCTGGTTTAAACAGGCACACCTTC ；CID1528R :TTGGGACGGAAAGCTGCTCTG。實(shí)施例1用本發(fā)明的方法提取草魚基因組DNA1)剪取約25mg鰭條組織，無(wú)菌水清洗，用濾紙吸干水分，剪成小碎塊，置于1. 5ml 無(wú)菌離心管中，加入500 μ 1裂解液，顛倒混勻，55°C水浴鍋或搖床，裂解1. 5-2小時(shí)至澄清， 裂解過(guò)程將離心管來(lái)回顛倒數(shù)次；2)取出以上步驟1)的裂解液，在離心機(jī)上4000rpm(4°C )離心Imin ；3)吸取150 μ 1裂解液的上清液，加入到用NaAc溶液濾洗過(guò)的吸附柱中，下面附收集管，室溫靜置:3min，4000rpnK4°C )將吸附柱離心2min，棄去收集管中的廢液；4)向每個(gè)吸附柱中加入300 μ 1洗滌液，4000rpnK4°C )將吸附柱離心3min，棄去收集管中的廢液；5)將漂洗后的吸附柱轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的1. 5ml離心管中，靜置lmin，加入120-150 μ 1 無(wú)菌水，靜置:3min，4000rpnK4°C )離心:3min，棄去吸附柱，離心管中即為收集的DNA，4°C保
存?zhèn)溆?。?duì)比例1傳統(tǒng)酚/氯仿法提取草魚基因組DNA組織裂解方法依照實(shí)施例1中步驟1)，DNA提取過(guò)程，經(jīng)過(guò)多次酚/氯仿抽提后收集DNA，4°C保存?zhèn)溆?。?duì)比例2試劑盒提取草魚基因組DNAa. 20_50mg組織剪成小碎塊，轉(zhuǎn)入裝有180 μ 1組織裂解液的1. 5ml離心管中，用大口徑槍頭吹打混勻；
b.加入20 μ 1的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋震蕩充分混勻；c.將裂解物放置在55°C水浴1-3小時(shí)，期間輕柔震蕩幾次；d.加入200 μ 1結(jié)合液，立刻渦旋震蕩充分混勻，70°C放置IOmin ；e.冷卻后加100 μ 1異丙醇，立刻渦旋震蕩充分混勻；f.用Iml的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個(gè)吸附柱中，吸附柱放入收集管， 13000rpm離心60s，倒掉收集管中廢液；g.加入500 μ 1抑制物去除液，12000rpm離心30s，棄去廢液；h.加入700 μ 1漂洗液，12000rpm離心30s，棄去廢液；i.將吸附柱放回空收集管中，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液；j.取出吸附柱，放入干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μ 1洗脫緩沖液 EB,室溫放置3-5分鐘，12000rpm離心1分鐘。離心管中DNA放置4°C備用。發(fā)明人對(duì)實(shí)施例1和對(duì)比例1提取的草魚基因組DNA及其相應(yīng)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了比較。分別吸取實(shí)施例1和對(duì)比例1提取獲得的草魚基因組DNA 3 μ 1同時(shí)進(jìn)行1. 0%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，其中1-4為本發(fā)明提取獲得DNA樣，5-8為傳統(tǒng)酚/氯仿法提取獲得DNA樣，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000。從圖中可以看出相比傳統(tǒng)酚/氯仿法在獲得量上較少，但存在拖帶更少的優(yōu)點(diǎn)，說(shuō)明本發(fā)明方法能有效獲得高質(zhì)量的草魚基因組DNA。對(duì)以上DNA樣品采用分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，再稀釋至終濃度lOng/μ 1，用于 SSR 擴(kuò)增，引物為 CID1528，25 °C PCR 反應(yīng)體系，ZXiTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1, CID1528F(10yM)ly 1，CID1528R(10 μ Μ) 1 μ 1, DNA(IOng/μ 1)2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1 ；程序設(shè)置為預(yù)變性 94°C 3min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30S，55°C 30S，72°C 30S)，72°C 5min;吸取 PCR 產(chǎn)物3 μ 1采用檢測(cè)1. 2%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，其中1-4為以本發(fā)明提取獲得DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5-8為以傳統(tǒng)酚/氯仿法提取獲得DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000。從圖中可以看出傳統(tǒng)酚/氯仿法與本發(fā)明方法獲得的草魚基因組DNA均能較好地用于SSR的PCR擴(kuò)增。發(fā)明人對(duì)實(shí)施例1和對(duì)比例2提取的草魚基因組DNA及其相應(yīng)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了比較。分別吸取實(shí)施例1和對(duì)比例2提取獲得的草魚基因組DNA 3 μ 1同時(shí)進(jìn)行1. 0%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，其中1-4為本發(fā)明提取獲得DNA樣，5-8為DNA提取試劑盒提取獲得DNA樣，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000。從圖中可以看出本發(fā)明方法相比試劑盒提取方法在獲得量方面稍差，均能有效獲得高質(zhì)量的草魚基因組DNA。對(duì)以上DNA樣品采用分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，再稀釋至終濃度lOng/μ 1，用于 SSR 擴(kuò)增，引物為 CID1528，25 °C PCR 反應(yīng)體系，ZXiTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1, CID1528F(10yM)ly 1，CID1528R(10 μ Μ) 1 μ 1, DNA(10ng/y 1)2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1 ；程序設(shè)置為預(yù)變性 94°C 3min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30S，55°C 30S，72°C 30S)，72°C 5min;吸取 PCR 產(chǎn)物3 μ 1采用檢測(cè)1. 2%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，其中1-4為以本發(fā)明提取獲得DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5-8為以DNA提取試劑盒提取獲得DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000。從圖中可以看出本發(fā)明方法與試劑盒提取方法獲得的草魚基因組DNA均能較好地用于SSR的PCR擴(kuò)增。
權(quán)利要求
1.一種草魚基因組DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟1)裂解草魚鰭條組織經(jīng)無(wú)菌水清洗后，吸干水分，剪成小碎塊，置于無(wú)菌離心管中， 加入裂解液，顛倒混勻，45-65°C下，裂解1-2. 5小時(shí)至澄清得草魚鰭條組織裂解液，裂解過(guò)程中將離心管來(lái)回顛倒數(shù)次；2)離心將草魚鰭條組織裂解液在離心機(jī)上離心；3)吸附吸取草魚鰭條組織裂解液離心后的上清液，加入用NaAc溶液濾洗過(guò)的吸附柱中，其下面附收集管，靜置2-^iin后將吸附柱離心，棄去收集管中的廢液；4)漂洗向吸附柱中加入洗滌液后將吸附柱離心，棄去收集管中的廢液；5)溶解將漂洗后的吸附柱放置在無(wú)菌離心管中，靜置0.5-2min，加入無(wú)菌水，靜置 2-^iin后離心，離心管中即為收集的DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草魚基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟1)中裂解液由PH值為8. 0，摩爾濃度為IM的Tris · HCl水溶液，pH值為8. 0，摩爾濃度為0. 5M的EDTANa2水溶液，質(zhì)量含量為10 %的SDS水溶液，無(wú)菌水，蛋白酶K按體積比 5 20 10 64 1 混合而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草魚基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟1)中裂解液的其用量為lmg鰭條組織加入20 μ 1裂解液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草魚基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟)中NaAc 溶液為3Μ，冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草魚基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟4)中洗滌液由PH值為7. 4，摩爾濃度為IM的Tris · HCl水溶液，pH值為8. 0，摩爾濃度為0. 5Μ的 EDTA水溶液，無(wú)水乙醇，無(wú)菌水按體積比4 1 350 235混合而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草魚基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟4)中洗滌液的體積為步驟幻中加入到吸附柱中上清液體積的1-3倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草魚基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟幻中無(wú)菌水的體積為步驟3)中加入到吸附柱中上清液體積的0. 5-1. 2倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草魚基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟幻-5)中， 離心溫度為4-8°C下，離心轉(zhuǎn)速為3000-5000rpm，離心時(shí)間為l_5min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種草魚基因組DNA提取方法，包括步驟1)裂解草魚鰭條組織經(jīng)無(wú)菌水清洗后，吸干水分，剪成小碎塊，置于無(wú)菌離心管中，加入裂解液，顛倒混勻，45-65℃下，裂解1-2.5小時(shí)至澄清，裂解過(guò)程中將離心管來(lái)回顛倒數(shù)次；2)離心將草魚鰭條組織裂解液在離心機(jī)上離心；3)吸附吸取草魚鰭條組織裂解液離心后的上清液，加入用NaAc溶液濾洗過(guò)的吸附柱中，其下面附收集管，靜置后將吸附柱離心，棄去收集管中的廢液；4)漂洗向吸附柱中加入洗滌液后將吸附柱離心，棄去收集管中的廢液；5)溶解將漂洗后的吸附柱放置在離心管中，靜置，加入無(wú)菌水，再靜置后離心，離心管中即為收集的DNA。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102559663SQ20121003174
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者傅建軍, 李家樂(lè), 沈玉幫, 白志毅, 陳勇 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)