專利名稱：MRSA中QacC基因的檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒劑QacC基因攜帶情況的檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，并出現(xiàn)了多重耐藥株。研究發(fā)現(xiàn)，多重耐藥菌株中的主動(dòng)外排系統(tǒng)能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)抗菌藥物的濃度，同時(shí)由于主動(dòng)外排系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)底物的廣泛性，使細(xì)菌呈現(xiàn)對(duì)多種化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同的抗菌藥物高度耐藥。進(jìn)一步研究表明，細(xì)菌的主動(dòng)外排是導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的主要原因。研究認(rèn)為 MRSA的耐藥可能跟細(xì)菌獲得主動(dòng)外排基因有關(guān)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MRSA中存在多種主動(dòng)外排系統(tǒng)。 Markham等早在1996年就推測(cè)外排系統(tǒng)在MRSA多重耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。金黃色葡萄球菌還存在qac, smr等多種外排系統(tǒng)。Qac基因家族中發(fā)現(xiàn)有QacA, QacB, QacC, QacD, QacE等基因。細(xì)菌獲得Qac基因可表現(xiàn)對(duì)胺類、胍類、腙類消毒劑也耐藥。在Qac家族中， 除對(duì)消毒劑耐藥外，對(duì)多種抗菌藥物存在高耐藥率。QacC基因可從金葡菌小質(zhì)粒和大質(zhì)粒如214kb的pSK89、pSK108和4718kb的 PSK41中分離得到；在凝固酶陰性葡萄球菌的結(jié)合型質(zhì)粒PNVH99中也發(fā)現(xiàn)它的存在。后來(lái)從食品中分離得到的葡萄球菌經(jīng)核酸測(cè)序證明，qacC與sm r僅有一個(gè)核苷酸的不同。qacC 基因編碼的蛋白含有107個(gè)氨基酸，屬于原核多重耐藥家族，這個(gè)家族中還包括大腸埃希菌編碼蛋白Ebr和革蘭陰性桿菌的整合子編碼蛋白QacE。該家族的蛋白均有四個(gè)跨膜片段，它們依靠質(zhì)子泵的動(dòng)力對(duì)季胺類化合物和溴化己啶等消毒劑耐藥。目前檢測(cè)QacC基因攜帶情況的方法主要有PCR后瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序。凝膠電泳法成本低、易操作，但靈敏度低，容易出現(xiàn)假陰性；測(cè)序是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但測(cè)序技術(shù)步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、容易污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒劑QacC基因攜帶情況的PCR檢測(cè)引物及使用該引物的檢測(cè)方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一組MRSA中QacC基因的檢測(cè)引物，其特征在于，包括(A) QacC 基因正向引物5，-tgcaacacctaccactaaatataactt-3，；(B) QacC 基因反向引物5，_cgaaactacgccgactatga_3，。本發(fā)明還提供了一種MRSA中QacC基因的檢測(cè)方法，其特征在于，采用上述MRSA 中QacC基因的檢測(cè)引物，具體步驟為第一步取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MRSA陽(yáng)性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本 DNA,作為檢測(cè)樣品；取不攜帶QacC基因的金黃色葡萄球菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA， 作為陰性對(duì)照品；人工合成QacC序列，構(gòu)建攜帶QacC基因的重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照品；
3
第二步用無(wú)菌水分別配制濃度為5-15umol/L的QacC基因正向引物溶液、濃度為5-15umol/L的QacC基因反向引物溶液及濃度為5-15umol/L的QacC基因檢測(cè)探針溶液；QacC 基因正向引物的序列為5’ -tgcaacacctaccactaaatataactt-3J, QacC 基因反向引物的序列為5 ’ -cgaaactacgccgactatga-3 ’, QacC基因檢測(cè)探針的序列為 FAM-gcaacttgggcggga-MGBNFQ ；第三步在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的QacC基因正向引物溶液0. I-Iul、QacC基因反向引物溶液0. I-Iul、QacC基因檢測(cè)探針溶液0. 1-lul，然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入第一步得到的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品及陽(yáng)性對(duì)照品各0. 1-lul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul ;在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-100°C保溫1_3分鐘，然后運(yùn)行30-50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在80-100。。保溫10-20秒，再在50-70°C保溫0. 5-1. 5分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，PCR結(jié)果呈S形曲線即為攜帶QacC基因。本發(fā)明是對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中是否還有耐消毒劑QacC基因的檢測(cè)， 細(xì)菌一旦獲得此基因即可對(duì)現(xiàn)用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過(guò)檢測(cè)了解細(xì)菌中QacC 基因的攜帶情況，有利于對(duì)含有耐消毒劑基因的菌株的監(jiān)控，防止菌株繼續(xù)流行，同時(shí)從科研角度對(duì)其耐藥機(jī)理的進(jìn)一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開(kāi)發(fā)。本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用具有分辨率更高、雜交特異性更強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)的Taqman-MGB探針，不僅檢測(cè)率高、可重復(fù)性強(qiáng)，檢測(cè)速度快，全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了交叉污染，且自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品， 使結(jié)果判讀更直觀。


圖I為攜帶QacC基因的陽(yáng)性對(duì)照品的Realtime PCR曲線圖；圖2為Realtime PCR陰性對(duì)照品的Realtime PCR曲線圖；圖3為攜帶QacC基因檢測(cè)樣品的Realtime PCR曲線圖；圖4為QacC基因檢測(cè)樣品的瓊脂糖凝I父電泳圖；圖5為QacC基因檢測(cè)樣品的測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例I、采用固相亞磷酰胺三酯法制備一組用于檢測(cè)MRSA中QacC基因攜帶情況的引物，包括QacC 基因正向引物5，-tgcaacacctaccactaaatataactt-3，；QacC 基因反向引物5，-cgaaactacgccgactatga-3 2、檢測(cè)方法(I)取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌陽(yáng)性的臨床樣本分離株，高溫滅活，用商品化的細(xì)菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，YP03002) 提取樣本DNA，稀釋至30ul (濃度10ng/ul)，置_20°C保存，待用；將標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌株(保藏單位中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)ATCC Number :43300)，高溫滅活，用商品化的細(xì)菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，YP03002) 提取樣本DNA，稀釋至30ul (濃度10ng/ul)，作為陰性對(duì)照品；人工合成QacC序列(由上海生工合成)，構(gòu)建攜帶QacC基因的重組質(zhì)粒，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，為陽(yáng)性對(duì)照品。(2)根據(jù)QacC基因的保守區(qū)域，采用ABI Primer Express 3.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成引物及Taqman探針，探針序列一端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料(由上海生工合成)，用無(wú)菌水配制濃度為lOumol/L的QacC基因正向引物溶液，濃度為lOumol/L的QacC基因反向引物溶液以及濃度為lOumol/L的QacC基因檢測(cè)探針溶液，其中，引物和檢測(cè)探針序列如下QacC 基因正向引物5，-tgcaacacctaccactaaatataactt-3，；QacC 基因反向引物5，-cgaaactacgccgactatga-3 ；QacC 基因檢測(cè)探針FAM-gcaacttgggcggga_MGBNFQ。(3)在每一個(gè) PCR 反應(yīng)孔中依次加入 PCR Master Mix (Applied Biosystems 公司生產(chǎn)的 Taqman Universal PCR Master Mix 2X，包括 10 XPCR 緩沖液、MgC12、dNTP、DNA 聚合酶)12. 5ul，QacC基因正向引物溶液0. 5ul，QacC基因反向引物溶液0. 5ul，QacC基因檢測(cè)探針溶液0. 5ul。然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入步驟(I)得到的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品及陽(yáng)性對(duì)照品各0. 5ul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul。在ABI7300型熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C保溫2分鐘，95°C保溫2分鐘，然后運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在95°C保溫15秒，再在60°C保溫I分鐘；(4)用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，如圖I所示，陽(yáng)性對(duì)照品的Realtime PCR曲線， 呈S形。如圖2所示，為陰性對(duì)照品的Realtime PCR曲線，為非S形。如圖3所示，為檢測(cè)樣品的Realtime PCR曲線，呈S形。得出判斷，該樣品為攜帶QacC基因菌株。利用本發(fā)明對(duì)超過(guò)100例MRSA樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，根據(jù)上述方法進(jìn)行的QacC 基因攜帶情況檢出率可達(dá)99%以上，可重復(fù)性達(dá)到100%。而瓊脂糖凝膠電泳法的檢出率約75%，如圖4所示，為QacC基因檢測(cè)樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖；本發(fā)明與直接測(cè)序法相比，結(jié)果一致性可達(dá)到99. 5%以上，如圖5所示，為QacC基因檢測(cè)樣品的測(cè)序圖。
權(quán)利要求
1.MRSA中QacC基因的檢測(cè)引物，其特征在于，包括(A)· QacC 基因正向引物5，-tgcaacacctaccactaaatataactt-3，；(B)· QacC 基因反向引物:5，-cgaaactacgccgactatga-3’。
2.—種MRSA中QacC基因的檢測(cè)方法，其特征在于，采用權(quán)利要求I所述的MRSA中 QacC基因的檢測(cè)引物，具體步驟為第一步取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MRSA陽(yáng)性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測(cè)樣品；取不攜帶QacC基因的金黃色葡萄球菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對(duì)照品；人工合成QacC序列，構(gòu)建攜帶QacC基因的重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照品；第二步用無(wú)菌水分別配制濃度為5-15umol/L的QacC基因正向引物溶液、濃度為5-15umol/L的QacC基因反向引物溶液及濃度為5-15umol/L的QacC基因檢測(cè)探針溶液；QacC 基因正向引物的序列為5’ -tgcaacacctaccactaaatataactt-3J，QacC 基因反向引物的序列為:5，-cgaaactacgccgactatga-3’，QacC 基因檢測(cè)探針的序列為 FAM-gcaacttgggcggga-MGBNFQ ；第三步在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的 QacC基因正向引物溶液O. I-Iul、QacC基因反向引物溶液O. I-Iul、QacC基因檢測(cè)探針溶液O. Ι-lul，然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入第一步得到的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品及陽(yáng)性對(duì)照品各O. Ι-lul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul ;在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-100°C保溫1_3分鐘，然后運(yùn)行30-50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在 80-100。。保溫 10-20 秒，再在 50-70°C保溫 O. 5-1. 5 分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，PCR結(jié)果呈S形曲線即為攜帶QacC基因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組MRSA中QacC基因的檢測(cè)引物及使用該引物的檢測(cè)方法。所述的MRSA中QacC基因的檢測(cè)引物其特征在于，包括QacC基因正向引物5’-tgcaacacctaccactaaatataactt-3’；QacC基因反向引物5’-cgaaactacgccgactatga-3’。檢測(cè)方法為取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MRSA陽(yáng)性的臨床樣本分離株作為檢測(cè)樣品，取不攜帶QacC基因的金黃色葡萄球菌菌株作為陰性對(duì)照品，分別高溫滅活，提取樣本DNA；人工合成QacC序列，構(gòu)建攜帶QacC基因的重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照品；分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。本發(fā)明檢測(cè)率高、可重復(fù)性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586432SQ20121003309
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者傅詠南, 張奕, 王校 申請(qǐng)人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司