專利名稱：一種人源化三維腸黏膜模型的建立及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人源化三維腸黏膜模型的建立及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
口服給藥作為一種傳統(tǒng)的給藥方式，以其相對的方便性與安全性而為人們所廣泛接受。吸收過程是決定口服藥物生物利用度的關(guān)鍵因素之一。而小腸是口服藥物吸收的主要部位，所以目前國內(nèi)外主要利用各種體外及在體腸吸收模型研究藥物在小腸部位的跨膜轉(zhuǎn)運過程，從而預(yù)測其口服吸收情況。其中，Caco-2單層細胞模型是目前被廣泛應(yīng)用于研究藥物分子的生物膜通透性和跨膜轉(zhuǎn)運機制的體外模型之一。該模型體系組成因素單一明確，且細胞表型及功能與體內(nèi)腸上皮細胞存在部分相似性，所以它在藥物的吸收特性研究方面顯示出一定的優(yōu)勢。目前Caco-2細胞模型已經(jīng)成為研究藥物吸收特征的代表性體外研究體系。但需要指出:此模型尚存在很多缺陷。大量研究顯示其相關(guān)性較差，不同實驗室間預(yù)測結(jié)果差異較大。該模型不但缺少腸壁的黏液層以及部分代謝酶(如CYP3A)，從而影響一些化合物(如代謝酶底物)的吸收預(yù)測，而且缺乏細胞外間質(zhì)(ECM)及間質(zhì)細胞。事實上，ECM和間質(zhì)細胞的存在及他們與上皮細胞之間復(fù)雜的相互作用在維持腸上皮細胞的表型和功能方面是至關(guān)重要的。因此，在Caco-2單層細胞模型基礎(chǔ)上的改良就顯得非常重要。最近國外有相關(guān)報道:采用Caco-2細胞與其他細胞混合培養(yǎng)(包括HT29-MTX細胞、人Burkitt' s淋巴瘤細胞和PC-12細胞等)，從而建立兩種細胞共培養(yǎng)模型以模擬腸吸收代謝過程。但這些模型僅限于一種間質(zhì)細胞共培養(yǎng)，且缺乏ECM，而且模型穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較差。對比之下，動物 模型雖然具有正常腸上皮的復(fù)雜生理結(jié)構(gòu)和功能，克服了體外細胞模型所存在的缺陷，但種屬差異的存在大大限制了其數(shù)據(jù)在人體的外推性。此外，動物實驗本身難于實現(xiàn)理想質(zhì)控，缺少高通量篩選的優(yōu)勢；有關(guān)倫理學(xué)爭議以及“3R”原則的提出也都大大制約了動物模型在藥物吸收代謝研究中的應(yīng)用。近年來，再生醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得三維組織化模型的體外構(gòu)建成為可能。三維培養(yǎng)體系能夠提供與體內(nèi)類似的微環(huán)境，使細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)間建立緊密聯(lián)系并進行信號傳遞，從而使該體系中細胞的基因表達、基質(zhì)分泌及生理功能與在體細胞更相似。迄今為止，已有多種三維組織化模型構(gòu)建成功并應(yīng)用于研究中。但是經(jīng)文獻檢索，目前仍未發(fā)現(xiàn)構(gòu)建研究藥物腸道吸收代謝的三維腸黏膜模型的相關(guān)報道。基于以上原因，本發(fā)明利用腸上皮細胞、多種間質(zhì)細胞以及細胞外間質(zhì)構(gòu)建三維腸黏膜模型。該培養(yǎng)體系能夠提供與在體組織類似的微環(huán)境，使腸上皮細胞的生長更接近體內(nèi)三維生長模式，在細胞形態(tài)及功能特征方面最大限度地模擬了在體細胞或組織，從而發(fā)揮其對外源物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運代謝的生理功能。此三維模型可以作為傳統(tǒng)的體外單層細胞模型研究和體內(nèi)實驗的一個橋梁，從而更方便、更準確地評價口服藥物的透膜能力及其生物利用度
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人源化三維腸黏膜模型及其應(yīng)用，該模型可以廣泛用于藥物早期發(fā)現(xiàn)和新藥開發(fā)中預(yù)測口服藥物的透膜能力及其生物利用度。小腸上皮是外源性物質(zhì)(主要包括營養(yǎng)物質(zhì)及藥物)吸收的主要場所，它是一層主要由腸上皮細胞、分泌黏液的杯狀細胞、成纖維細胞、內(nèi)分泌細胞、神經(jīng)細胞、M細胞及黏膜下的免疫細胞共同構(gòu)成的生理屏障。腸上皮細胞為極性細胞，分為腸腔側(cè)和基底側(cè)。本發(fā)明提供了一種人源化三維腸黏膜模型的建立，步驟為將間質(zhì)細胞混種于細胞外基質(zhì)中，孵育2小時后細胞外基質(zhì)凝固，然后在其上面種上一層混合上皮細胞，共培養(yǎng)兩周以后，上皮細胞層達到完整致密狀態(tài)(跨膜電阻值大于250Ω.cm2)，再于Transwell基底側(cè)接種一層免疫細胞，上述四種細胞共培養(yǎng)一周以后，得到分化完全的三維腸黏膜模型。本發(fā)明提供的人源化三維腸黏膜模型的建立，所述間質(zhì)細胞包括成纖維細胞在內(nèi)的所有腸黏膜內(nèi)存在的間質(zhì)細胞，優(yōu)選為成纖維細胞。本發(fā)明提供的人源化三維腸黏膜模型的建立，所述的細胞外基質(zhì)包括膠原、基質(zhì)膠所有天然類及合成類的細胞外基質(zhì)，優(yōu)選為膠原。本發(fā)明提供的人源化三維腸黏膜模型的建立，所述的混合上皮細胞為黏液分泌細胞和Caco-2 (結(jié)腸腺癌)細胞，黏液分泌細胞和Caco-2細胞的接種比例為1: 9 1: 3。本發(fā)明提供的人源化三維腸黏膜模型的建立，所述黏液分泌細胞包括耐甲氨蝶呤的結(jié)腸腺癌HT29-MTX細胞、適應(yīng)于半乳糖培養(yǎng)基的結(jié)腸腺癌HT29-H細胞在內(nèi)的所有具有黏液分泌功能的細胞，優(yōu)選為HT29-MTX細胞。
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本發(fā)明提供的人源化三維腸黏膜模型的建立，，所述免疫細胞包括巨噬細胞、淋巴細胞所有腸黏膜內(nèi)存在的具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫細胞，優(yōu)選為THP-1 (人單核白血病)細胞來源的巨噬細胞。本發(fā)明提供的人源化三維腸黏膜模型的建立，所述的共培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基為含F(xiàn)BS (胎牛血清)、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺和抗生素等多種成分優(yōu)化的細胞共培養(yǎng)培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的人源化三維腸黏膜模型適用于天然產(chǎn)物、化學(xué)合成藥物、生物藥物所有來源的用于人體的口服藥物。本發(fā)明同現(xiàn)有Caco-2單層細胞模型相比具有如下優(yōu)點:1.該三維模型具有與體內(nèi)腸黏膜類似的黏液層，它本身可以作為某些藥物分子穿過腸道的屏障。2.該模型的胞間連接蛋白的表達量更低，使得胞間連接較疏松，更接近真實的小腸上皮細胞胞間連接狀態(tài)。3.該三維模型的轉(zhuǎn)運蛋白水平更接近真實的腸上皮細胞的表達水平。4.該三維模型的代謝酶表達水平(羧酸酯酶)更高，彌補了 Caco-2細胞代謝酶表達較低的缺點。5.該三維模型提供細胞與細胞之間以及細胞與細胞外基質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用，形成與體內(nèi)小腸上皮部位類似的微環(huán)境，使腸上皮細胞的生長更接近體內(nèi)三維生長模式。本發(fā)明主要利用Transwell體系建立并評價三維的腸黏膜模型，該三維培養(yǎng)體系主要包括人腸上皮細胞(Caco-2細胞和黏液分泌細胞)、間質(zhì)細胞、免疫細胞以及細胞外基質(zhì)，從而更好地模擬體內(nèi)正常腸黏膜生理結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所建立的三維腸黏膜模型可以廣泛用于具有不同理化性質(zhì)的口服藥物吸收代謝研究中。該模型利用多種細胞與細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)間直接或間接的相互作用，建立一種生理結(jié)構(gòu)及功能更接近體內(nèi)環(huán)境的三維體外吸收代謝模型，同時可以保證該模型具有理想的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，從而能夠更加準確地預(yù)測未知化合物的透膜能力，并深入了解它們在體內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運機制，為類藥化合物的篩選及新藥的開發(fā)提供方便可靠的工具。


圖1三維腸黏膜模型示意圖；圖2建立三維腸黏膜模型流程圖；圖3Caco-2單層細胞模型和三維腸黏膜模型中的高碘酸-希夫試劑黏液定量分析；圖4Caco-2單層細胞模型和三維腸黏膜模型不同培養(yǎng)時間跨膜電阻值(TEER)變化；圖5不同轉(zhuǎn)運途徑的標志化合物在Caco-2單層細胞模型和三維腸黏膜模型的透膜系數(shù)比較；圖6不同透膜能力的標志化合物在Caco-2單層細胞模型和三維腸黏膜模型的透膜系數(shù)比較；圖7酯酶底物(依那普利)在Caco-2單層細胞模型和三維腸黏膜模型的透膜系數(shù)比較；圖8酯酶代謝產(chǎn)物(依那普利拉)及其底物(依那普利)在Caco-2細胞中蓄積的濃度比。
具體實施例方式下列實施例是為了進一步說明本發(fā)明，而不是要限制其范圍。實施例1利用Transwell體系構(gòu)建具有極性的三維腸黏膜模型如下圖1所示，將間質(zhì)細胞(如成纖維細胞)接種于細胞外基質(zhì)(如膠原)中，孵育2小時以后細胞外基質(zhì)凝固，在其上面種上一層混合上皮細胞，即一定比例的Caco-2細胞和黏液分泌細胞(如HT29-MTX細胞)，共培養(yǎng)兩周以后，再于Transwell的基底側(cè)接種一層免疫細胞(如THP-1細胞來源的巨噬細胞)。上述四種細胞共培養(yǎng)一周以后，該模型分化完全，利用電阻率儀測定跨膜電阻值(TEER)確定上皮細胞層緊密性和完整性后，即可用于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運實驗。共培養(yǎng)模型的培養(yǎng)基采用含F(xiàn)BS，L-谷氨酰胺和抗生素等優(yōu)化的細胞共培養(yǎng)培養(yǎng)基，模型的建立完全按照圖2的時間設(shè)計。通過高碘酸-希夫試劑組織化學(xué)染色實驗結(jié)果(圖3)可以看出該模型可以分泌出大量的黏液，使腸上皮細胞表面形成一層黏液層，彌補了 Caco-2單層細胞模型缺少黏液層的不足；活性染色實驗結(jié)果顯示該模型中四種細胞的活性均較好，證明在整個三維培養(yǎng)體系中傳質(zhì)較好；利 用Picogreen突光染料精確測定21天內(nèi)不同時間點三維模型中總DNA含量，結(jié)果表明該模型中總的細胞增殖能力較強；Z0-1緊密連接蛋白免疫熒光實驗及不同培養(yǎng)時間測得的跨膜電阻值(圖4)表明該模型中上皮細胞胞間連接更疏松，克服了 Caco-2單層細胞模型過于緊密的弊端；P_gp免疫熒光實驗表明該三維模型中P-gp的表達略有下降，從而優(yōu)化了 Caco-2單層細胞模型中P-gp過表達的特性；與此同時，RT-PCR實驗結(jié)果顯示該模型與Caco-2單層細胞模型相比P-gp表達含量略有減低，而MRP2和BCRP表達含量有所提高，表明該模型中轉(zhuǎn)運蛋白的表達量更接近體內(nèi)的腸上皮細胞表達水平。實施例2利用該三維模型研究被動胞旁轉(zhuǎn)運標志化合物的透膜能力采用熒光黃作為胞旁轉(zhuǎn)運的標志化合物，Caco-2單層細胞模型作為對照，三維模型按前述方法建立，培養(yǎng)期間每隔一天換液，直到孵育21天左右，上皮細胞分化完全，同時通過測定跨膜電阻(TEER)檢測上皮細胞層的緊密性和完整性，TEER值達到250 Ω.cm2的三維模型可以用于轉(zhuǎn)運實驗。在細胞層頂側(cè)(絨毛面，A面)培養(yǎng)液中加入0.5ml 20 μ g/ml的熒光黃藥液，同時在底側(cè)(基底面，B面)加入1.5ml空白緩沖溶液，開始轉(zhuǎn)運實驗，分別在30min、60min、90min、120min在底側(cè)取100 μ I藥液，并同時補足100 μ I空白緩沖溶液。利用熒光分光光度計測定熒光黃含量，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是490nm和514nm。利用公式:Papp = Δ Q/( Δ t.A.C。)計算突光黃的表觀滲透系數(shù)(apparent permeabilitycoefficients, Papp)，其中AQ為At內(nèi)的轉(zhuǎn)運量，A為膜面積，C0為藥物的初始濃度，根據(jù)算得的Papp值評價其透膜能力變化，結(jié)果(圖5)表明熒光黃在三維模型中表觀滲透系數(shù)增力口，即通透性增加，這與測得的TEER值減小及ZO-1免疫熒光實驗胞間連接變疏松的結(jié)果是一致的，說明此三維模型改善了 Caco-2單層細胞模型過于緊密的不足，它能夠更加準確地預(yù)測胞旁轉(zhuǎn)運藥物的透膜能力。實施例3利用該三維模型研究被動跨細胞轉(zhuǎn)運標志化合物的透膜能力采用普萘洛爾作為被動跨細胞轉(zhuǎn)運的標志化合物，Caco-2單層細胞模型作為對照，三維模型按前述方法建立，培養(yǎng)期間每隔一天換液，直到孵育21天左右，上皮細胞分化完全，同時通過測定跨膜電阻( TEER)檢測上皮細胞層的緊密性和完整性，TEER值達到250 Ω.cm2的三維模型可以用于轉(zhuǎn)運實驗。在細胞層頂側(cè)(絨毛面，A面)培養(yǎng)液中加入
0.5ml 50 μ M的普萘洛爾藥液，同時在底側(cè)(基底面，B面)加入1.5ml空白緩沖溶液，開始轉(zhuǎn)運實驗，分別在30min、60min、90min、120min在底側(cè)取100 μ I藥液，并同時補足100 μ I空白緩沖溶液。利用UFLC測定普萘洛爾含量，檢測波長分別是290nm。利用公式:Papp =Λ Q/ ( Λ t.A.Ctl)計算普萘洛爾的Papp值，結(jié)果(圖5)表明普萘洛爾在三維模型中表觀滲透系數(shù)也有所增加，即通透性增強。實施例4利用該三維模型研究轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運標志化合物的透膜能力同樣按照前述方法建立三維腸黏膜模型，采用地高辛作為P-gp介導(dǎo)轉(zhuǎn)運的標志化合物，甲氨蝶呤作為BCRP介導(dǎo)轉(zhuǎn)運的標志化合物，依托泊苷作為MRP2介導(dǎo)轉(zhuǎn)運的標志化合物，Caco-2單層細胞模型作為對照，分別研究以上三個標志化合物在三維腸黏膜模型中透膜能力的變化，進而了解三種轉(zhuǎn)運蛋白在三維模型的功能變化。同樣利用UFLC對三種標志化合物進行含量測定，地高辛、甲氨蝶呤和依托泊苷的檢測波長分別為220nm、302nm和254nm。結(jié)果(圖5)表明地高辛的透膜系數(shù)有所增加，表明P_gp介導(dǎo)的外排轉(zhuǎn)運有所減少，即P-gP功能略有下降，這與P-gp免疫熒光實驗結(jié)果具有一致性；而甲氨蝶呤和依托泊苷的透膜系數(shù)有所減少，表明BCRP和MRP2介導(dǎo)的外排轉(zhuǎn)運有所增加，即三維模型中BCRP和MRP2的功能略有增強。以上結(jié)果說明三維腸黏膜模型中不同轉(zhuǎn)運蛋白的功能有所變化，改善了 Caco-2單層模型中P-gp功能過強，而BCRP和MRP2功能相對較弱的不足。
實施例5利用該三維模型研究高滲透標志化合物的透膜能力同樣按照前述方法建立三維腸黏膜模型，選取三種高滲透的標志化合物，即咖啡因、安替比林和酮洛芬，研究它們在Caco-2單層模型和三維模型中通透性的變化。利用UFLC對咖啡因、安替比林和酮洛芬進行含量測定，它們的檢測波長分別為275nm、241nm和256nm。結(jié)果(圖6)表明三種高滲透標志化合物在三維模型中的透膜系數(shù)都有一定程度的降低，這表明三維模型中的細胞外基質(zhì)及其中的間質(zhì)細胞對高滲透化合物可能發(fā)揮一定的屏障作用。實施例6利用該三維模型研究中、低滲透標志化合物的透膜能力同樣按照前述方法建立三維腸黏膜模型，選取兩種中、低滲透的標志化合物，即呋塞米和雷尼替丁，研究它們在Caco-2單層模型和三維模型中通透性的變化。利用UFLC對它們進行含量測定，呋塞米和雷尼替丁的檢測波長分別為271nm和314nm。結(jié)果(圖6)表明兩種中、低滲透標志化合物在三維模型中的透膜系數(shù)略有增加。實施例7利用該三維模型研究羧酸酯酶底物的透膜能力及代謝程度同樣按照前述方法建立三維腸黏膜模型，選取依那普利作為酯酶的陽性底物，研究它在Caco-2單層模型和三維模型中通透性的變化，同時考察依那普利在此模型中的代謝程度，即提取上皮細胞內(nèi)蓄積的依那普利及其代謝產(chǎn)物(依那普利拉)并利用UFLC對它們進行含量測定，檢測波長為215nm。結(jié)果表明依那普利在三維模型中的透膜系數(shù)降低(圖7)，同時上皮細胞內(nèi)依那普利拉與依那普利的濃度比有所提高(圖8)，以上結(jié)果證實三維模型中的酯酶活性有明 顯提高。
權(quán)利要求
1.一種人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于將一種間質(zhì)細胞混種于細胞外基質(zhì)中，鮮育后細胞外基質(zhì)凝固，然后在其上面種上兩種混合上皮細胞，共培養(yǎng)兩周以后，再于Transwell基底側(cè)接種一層免疫細胞，上述四種細胞共培養(yǎng)一周以后，得到分化完全的三維腸黏膜模型。
2.按照權(quán)利要求I所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述間質(zhì)細胞包括成纖維細胞在內(nèi)的所有腸黏膜內(nèi)存在的間質(zhì)細胞。
3.按照權(quán)利要求2所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述間質(zhì)細胞為成纖維細胞。
4.按照權(quán)利要求I所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述的細胞外基質(zhì)包括膠原、基質(zhì)膠在內(nèi)的所有天然類及合成類的細胞外基質(zhì)。
5.按照權(quán)利要求4所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述細胞外基質(zhì)為膠原。
6.按照權(quán)利要求I所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述的混合上皮細胞為黏液分泌細胞和結(jié)腸腺癌Caco-2細胞，黏液分泌細胞和Caco-2細胞的接種比例為I : 9 I : 3。
7.按照權(quán)利要求6所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述黏液分泌細胞包括耐甲氨蝶呤的結(jié)腸腺癌HT29-MTX細胞、適應(yīng)于半乳糖培養(yǎng)基的結(jié)腸腺癌HT29-H細胞在內(nèi)的所有具有黏液分泌功能的細胞。
8.按照權(quán)利要求7所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述黏液分泌細胞為HT29-MTX細胞。
9.按照權(quán)利要求I所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述免疫細胞包括巨噬細胞、淋巴細胞所有腸黏膜內(nèi)存在的具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫細胞。
10.按照權(quán)利要求9所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述免疫細胞為人單核白血病THP-I細胞來源的巨噬細胞。
11.按照權(quán)利要求I所述人源化三維腸黏膜模型的建立，其特征在于所述的共培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基為含胎牛血清FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺和抗生素多種成分優(yōu)化的細胞共培養(yǎng)培養(yǎng)基。
12.權(quán)利要求I所述建立的人源化三維腸黏膜模型適用于研究包括天然產(chǎn)物、化學(xué)合成藥物、生物藥物所有來源的用于人體的口服藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人源化三維腸黏膜模型的建立及其應(yīng)用，該模型主要基于小腸上皮正常的生理結(jié)構(gòu)特點，對傳統(tǒng)Caco-2單層細胞模型進行改進，即Caco-2細胞在加入細胞外基質(zhì)的基礎(chǔ)上，與黏液分泌細胞、間質(zhì)細胞以及免疫細胞進行共培養(yǎng)一段時間后，形成一種與體內(nèi)小腸上皮結(jié)構(gòu)類似、功能相近的三維腸黏膜結(jié)構(gòu)，利用它可以預(yù)測口服藥物分子的小腸上皮透膜能力及代謝程度；其主要作用是在體外研究藥物分子在小腸部位的跨膜轉(zhuǎn)運吸收及代謝過程。
文檔編號C12N5/071GK103255097SQ20121003558
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者楊凌, 李娜, 王秀麗 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所