專利名稱：高靈敏度實(shí)時熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸檢測領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及高靈敏度的實(shí)時熒光檢測方法及其中所用的檢測試劑盒和試劑等。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)九十年代發(fā)明的Taqman探針(Taqman Probe)和分子信標(biāo)技術(shù)(Molecular Beacon)極大的促進(jìn)了熒光實(shí)時(Real-Time)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在核酸檢測方面的應(yīng)用和發(fā)展。在實(shí)時PCR檢測中，通常使用標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的特異性核酸作為探針，在PCR擴(kuò)增的過程中來實(shí)施實(shí)時檢測。例如，中國專利文獻(xiàn)CN101131347A就公開了快速檢測日本血吸蟲的熒光定量PCR試劑盒，包括正向引物、反向引物和熒光探針，用于熒光定量PCR檢測日本血吸蟲的DNA ;又如，中國專利文獻(xiàn)CN101591716A公開了香蕉苞片花葉病毒實(shí)時熒光RT-PCR檢測試劑，包括弓I物和熒光標(biāo)記的探針，用于RT-PCR檢測香蕉苞片花葉病毒的RNA。
然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在實(shí)時PCR的實(shí)際應(yīng)用中，Taqman探針會使整個檢測的熒光本底值升高，導(dǎo)致熒光AR值的降低，從而降低檢測的靈敏度；而使用分子信標(biāo)探針，雖然可以有效降低熒光本底值，但是同時會降低檢測值，從而也會縮小AR值，而且縮小的幅度甚至?xí)^使用Taqman探針，有可能進(jìn)一步降低檢測的靈敏度。
為此，本發(fā)明人經(jīng)過長期實(shí)踐摸索，令人意外地發(fā)明了一種新的高靈敏度的實(shí)時 PCR檢測方法，其能夠提高靈敏度，克服Taqman探針和分子信標(biāo)技術(shù)等現(xiàn)有技術(shù)的不足。另外，該方法特異性強(qiáng)，能夠有效減少熒光本底過高而容易產(chǎn)生的非特異性熒光信號起跳的現(xiàn)象，并且該方法的檢測結(jié)果可靠而穩(wěn)定，適于產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。另外，本發(fā)明人還發(fā)明了能用于該實(shí)時PCR檢測方法中的試劑盒，以及其中的引物、探針等試劑。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供了新的實(shí)時PCR檢測靶核酸的方法和應(yīng)用。本發(fā)明還提供了用于實(shí)時PCR檢測靶核酸的試劑盒和其中的試劑，包括引物和/或探針。
具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中靶核酸的方法，其包括
(I)將樣品與PCR擴(kuò)增試劑和熒光標(biāo)記的探針混合，其中探針的核酸部分包括第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列，而且第一互補(bǔ)序列和第二互補(bǔ)序列能夠互補(bǔ)配對；和
(2)進(jìn)行PCR，并實(shí)時檢測熒光。
熒光標(biāo)記是實(shí)時PCR中常用的技術(shù)，通常在探針的核酸部分的一端(優(yōu)選是5’ 端)連接熒光基團(tuán)(如，已經(jīng)商品化的FAM)，并在另一端(優(yōu)選是3’端)連接淬滅基團(tuán)(如，已經(jīng)商品化的ECLIPSE)。因此，在本文中，探針包括核酸部分以及分別連接在核酸部分兩端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，優(yōu)選由核酸部分以及分別連接在核酸部分兩端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)組成。優(yōu)選在本發(fā)明的檢測方法中，探針的核酸部分從5’端到3’端依次由第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列組成。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，探針為FAM-AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT-ECLIPSE，其中核酸部分為 AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，探針為FAM-CATGTGGTGG CTTCAACATGAT-ECLIPSE，其中核酸部分為 CATGTGGTGGCTTCAACATGAT。
在本文中，樣品是潛在可能含有靶核酸的離體樣品，如食品、血液、血液制品、唾液、醫(yī)療用品或藥品等。本發(fā)明的檢測方法所針對的目標(biāo)一靶核酸，可以是任何適合實(shí)時PCR檢測的核酸，如基因或基因片段，包括DNA和RNA，可以是單鏈核酸，也可以是雙鏈核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)技術(shù)實(shí)質(zhì)來判斷所用的核酸種類。經(jīng)過本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)， 采用本發(fā)明的檢測方法，不但可以檢測RNA，也可以檢測DNA。例如，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，可以檢測HCV (丙型肝炎病毒，其為RNA病毒)的NS2基因(RNA)和HBV (乙型肝炎病毒，其為DNA病毒)的S基因(DNA)。這些核酸能夠在一定程度上表征HCV和HBV的存在性。因此，本發(fā)明的檢測方法中靶核酸是RNA或DNA，優(yōu)選是HCV RNA或HBVDNA。例如HBV S基因或HCV NS2基因。
需要指出的是，本發(fā)明的檢測方法用于對離體樣品的檢測，檢測的直接結(jié)果是靶核酸的存在性與否，而并非診斷結(jié)果。即使對于利用本發(fā)明的檢測方法檢測人或動物的血液樣品中HCV或HBV的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在與否，還需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生或取樣人員判斷檢測出的靶核酸是來自于血液中的HCV或HBV還是取樣時不慎污染的HCV或 HBV，而不能直接得到疾病的診斷結(jié)果或健康狀況；即使靶核酸表征了 HCV和HBV的存在與否，由于在肝功能正常的HCV或HBV攜帶者中，有些攜帶者的病毒檢測結(jié)果可自然轉(zhuǎn)陰，有些可以終身不發(fā)病，還需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)人或動物的體質(zhì)、病史、臨床癥狀等綜合情況才能判斷出是否會造成疾病或?qū)】禒顩r有影響，因此無法根據(jù)該靶核酸的存在而直接判斷其攜帶者是否患有丙型或乙型肝炎或有患病風(fēng)險(xiǎn)度，所以直接目的不是診斷。所以， 本發(fā)明的檢測方法不是診斷方法。
在本發(fā)明的檢測方法中，PCR擴(kuò)增試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。通常，PCR擴(kuò)增試劑包括能擴(kuò)增靶核酸序列的引物對、DNA聚合酶和dNTP，另外還可以包括緩沖液。其中，大量試劑已經(jīng)商品化，例如DNA聚合酶(如，Taq聚合酶)、dNTP(dATP, dTTP，dCTP和 dGTP)和緩沖液，通常包括在廠商的PCR擴(kuò)增試劑盒中。
另外在本發(fā)明的檢測方法中，PCR是RT-PCR。這樣，本發(fā)明的檢測方法可以直接檢測RNA。RT-PCR及其擴(kuò)增試劑也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。通常，RT-PCR擴(kuò)增試劑在通常的PCR擴(kuò)增試劑的基礎(chǔ)上，還包括反轉(zhuǎn)錄酶，如已經(jīng)商品化的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶等。另外為了防止樣品中的RNA被快速降解，RT-PCR擴(kuò)增試劑還可以包括RNase抑制劑，如已經(jīng)商品化的RNasin等。目前有許多廠商可以直接提供RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，包括以上所有RT-PCR 所需的試劑。
在本發(fā)明的檢測方法中，引物對用于擴(kuò)增靶核酸，優(yōu)選引物對是用于擴(kuò)增HCVRNA 或HBVDNA的引物對，更優(yōu)選是用于擴(kuò)增HBV S基因或HCVNS2基因的引物對。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，引物對是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和CGGCGATTGAGACCTTCGT ； 在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，引物對是TCGCCATATTACAAGCGCTACA和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。經(jīng)本發(fā)明人研究，這些具體的引物對特別適合本發(fā)明具體實(shí)施方式
中的PCR步驟。
在本文中，如果未加特別說明，核酸序列的表示都是依照5’端到3’端的次序進(jìn)行的；核酸的“互補(bǔ)配對”表示一條或一部分單鏈核酸上的各個堿基從5’端到3’端依次與另一條或另一部分單鏈核酸上的各個堿基從3’端到5’端互補(bǔ)，包括A與T互補(bǔ)、C與G互補(bǔ)。 這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的術(shù)語。例如，靶核酸特異性序列與靶核酸的一部分特異性片段能夠互補(bǔ)配對；而AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT中的“AGAAC”和“GITCT”能夠互補(bǔ)配對。
靶核酸特異性序列可以根據(jù)靶核酸來設(shè)計(jì)。優(yōu)選在本發(fā)明的檢測方法中，靶核酸特異性序列的長度為8 20個堿基，優(yōu)選為9 15個堿基，更優(yōu)選為10 12個堿基。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，靶核酸特異性序列為TCCCTCGCCTCG。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，靶核酸特異性序列為GGTGGCTTCA。
第一互補(bǔ)序列和第二互補(bǔ)序列處于同一條單鏈核酸上，分別位于靶核酸特異性序列，這兩條互補(bǔ)序列能夠互補(bǔ)配對。其中，“第一”、“第二”只用于區(qū)分序列，不對序列結(jié)構(gòu)構(gòu)成限定。例如，第一互補(bǔ)序列和/或第二互補(bǔ)序列也可以分別與靶核酸的部分序列互補(bǔ)配對，通常第一互補(bǔ)序列和第二互補(bǔ)序列中有一條序列與靶核酸的部分序列互補(bǔ)配對。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，第一互補(bǔ)序列與靶核酸的部分序列互補(bǔ)配對，第一互補(bǔ)序列和靶核酸特異性序列的整體都是對靶核酸具有特異性，而第二互補(bǔ)序列與第一互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對。優(yōu)選在本發(fā)明的檢測方法中，第一互補(bǔ)序列和第二互補(bǔ)序列的長度相等。例如，第一互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5個堿基的長度；而第二互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5 個堿基的長度。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，第一互補(bǔ)序列為AGAAC，而第二互補(bǔ)序列為GTTCT。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，第一互補(bǔ)序列為CATGT，而第二互補(bǔ)序列為 ACATG。
延伸序列可以在連接在第一互補(bǔ)序列的5’端，也可以連接第二互補(bǔ)序列的3’端， 優(yōu)選是后者。優(yōu)選在本發(fā)明的檢測方法中，延伸序列的長度為2 5個堿基，優(yōu)選為2 3 個堿基，更優(yōu)選為2個堿基。延伸序列是高AT含量的序列，例如AT含量大于60%，優(yōu)選大于80%,最優(yōu)選所有核苷酸均選自A和T。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，延伸序列為AT。
PCR通常包括變性、退火和延伸這三個步驟，RT-PCR還進(jìn)一步包括反轉(zhuǎn)錄步驟。例如，在42°C左右進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在大于90°C進(jìn)行變性，在50 65°C進(jìn)行退火，在約72°C進(jìn)行延伸。優(yōu)選在本發(fā)明的檢測方法中，PCR的退火溫度為55 65°C，更優(yōu)選為58 63°C，最優(yōu)選為60°C。也優(yōu)選在本發(fā)明的檢測方法中，PCR的退火時間為20 60秒，更優(yōu)選為25 40秒，最優(yōu)選為30秒。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的檢測方法可以不包括延伸步驟，仍舊能夠完成檢測，這樣可以縮短檢測時間。因此優(yōu)選在本發(fā)明的檢測方法中，PCR沒有延伸步驟。
在第二方面，本發(fā)明提供了樣品中靶核酸的檢測試劑盒，其包括PCR擴(kuò)增試劑和熒光標(biāo)記的探針，其中探針的核酸部分包括第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列。
優(yōu)選在本發(fā)明的檢測試劑盒中，探針的核酸部分從5’端到3’端依次由第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列組成。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，探針為FAM-AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT-ECLIPSE，其中核酸部分為AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，探針為FAM-CATGTGGTGG CTTCAACATGAT-ECLIPSE，其中核酸部分為 CATGTGGTGGCTTCAACATGAT。
在本發(fā)明的檢測試劑盒中，PCR擴(kuò)增試劑包括能擴(kuò)增靶核酸序列的引物對、DNA聚合酶和dNTP，另外還可以包括緩沖液。這樣可以進(jìn)行常規(guī)的PCR。進(jìn)一步優(yōu)選為了進(jìn)行 RT-PCR，PCR擴(kuò)增試劑是RT-PCR擴(kuò)增試劑。RT-PCR擴(kuò)增試劑包括能擴(kuò)增靶核酸序列的引物對、DNA聚合酶、dNTP和反轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)選還包括RNase抑制劑。
優(yōu)選在本發(fā)明的檢測試劑盒中，引物對是用于擴(kuò)增HCVRNA或HBVDNA的引物對，更優(yōu)選是用于擴(kuò)增HBV S基因或HCV NS2基因的引物對。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中， 引物對是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和CGGCGATTGAGACCTTCGT ;在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，引物對是 TCGCCATATTACAAGCGCTACA 和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。經(jīng)本發(fā)明人研究， 這些具體的引物對特別適合本發(fā)明具體實(shí)施方式
中的PCR步驟。
優(yōu)選在本發(fā)明的檢測試劑盒中，靶核酸特異性序列的長度為8 20個堿基，優(yōu)選為9 15個堿基,更優(yōu)選為10 12個堿基。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，祀核酸特異性序列為TCCCTCGCCTCG。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，靶核酸特異性序列為 GGTGGCTTCA。
優(yōu)選在本發(fā)明的檢測試劑盒中，第一互補(bǔ)序列和第二互補(bǔ)序列的長度相等。例如， 第一互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5個堿基的長度；而第二互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5個堿基的長度。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，第一互補(bǔ)序列為AGAAC，而第二互補(bǔ)序列為GTTCT。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，第一互補(bǔ)序列為CATGT，而第二互補(bǔ)序列為ACATG。
優(yōu)選在本發(fā)明的檢測試劑盒中，延伸序列的長度為2 5個堿基，優(yōu)選為2 3個堿基，更優(yōu)選為2個堿基。延伸序列是高AT含量的序列，例如AT含量大于60%，優(yōu)選大于 80%,最優(yōu)選所有核苷酸均選自A和T。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，延伸序列為AT。
在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的試劑盒在制備用于檢測樣品中靶核酸的方法的檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用。檢測產(chǎn)品包括本發(fā)明第二方面的試劑盒。優(yōu)選檢測產(chǎn)品還可以進(jìn)一步包括其他與檢測樣品中靶核酸相關(guān)的制品。例如，檢測樣品中靶核酸的方法可以是本發(fā)明第一方面的方法，因此優(yōu)選，檢測產(chǎn)品還包括記載本發(fā)明第一方面的方法的說明書。又如，本發(fā)明第二方面的試劑盒可以和熒光PCR儀搭配出售，因此優(yōu)選檢測產(chǎn)品還包括熒光PCR儀。
在第四方面，本發(fā)明提供了探針，其核酸部分包括第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列。該探針優(yōu)選是熒光標(biāo)記的探針，可以用于本發(fā)明第一、第二和第三方面中。
優(yōu)選在本發(fā)明的探針中，靶核酸特異性序列的長度為8 20個堿基，優(yōu)選為9 15個堿基，更優(yōu)選為10 12個堿基。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，靶核酸特異性序列為TCCCTCGCCTCG。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，靶核酸特異性序列為GGTGGCTTCA。
優(yōu)選在本發(fā)明的探針中，第一互補(bǔ)序列和第二互補(bǔ)序列的長度相等。例如，第一互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5個堿基的長度；而第二互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5個堿基的長度。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，第一互補(bǔ)序列為AGAAC，而第二互補(bǔ)序列為GTTCT。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，第一互補(bǔ)序列為CATGT，而第二互補(bǔ)序列為 ACATG。
優(yōu)選在本發(fā)明的探針中，延伸序列的長度為2 5個堿基，優(yōu)選為2 3個堿基， 更優(yōu)選為2個堿基。延伸序列是高AT含量的序列，例如AT含量大于60%，優(yōu)選大于80%， 最優(yōu)選所有核苷酸均選自A和T。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，延伸序列為AT。
優(yōu)選在本發(fā)明的探針的核酸部分從5’端到3’端依次由第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列組成。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，探針為FAM-AG AACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT-ECLIPSE，其中核酸部分為 AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，探針為FAM-CATGTGGTGGCTTCAACATGAT-ECLIPSE，其中核酸部分為 CATGTGGTGGCTTCAACATGAT。
在第五方面，本發(fā)明提供了引物對，其選自擴(kuò)增HBV S基因的引物對和擴(kuò)增HCV NS2基因的引物對，其中擴(kuò)增HBV S基因的引物是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和 CGGCGATTGAGACCTTCGT,擴(kuò)增 HCV NS2 基因的引物對是 TCGCCATATTACAAGCGCTACA 和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。
本發(fā)明的有益效果在于，降低熒光本底并提高熒光檢測信號，具有很高的信噪比， 提高了檢測的靈敏度和特異性；檢測應(yīng)用的范圍廣，可以針對DNA和RNA的檢測；縮短檢測時間，提高檢測效率；可以使用常規(guī)的熒光PCR儀進(jìn)行，節(jié)約了檢測成本；檢測結(jié)果可靠而穩(wěn)定，適于產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。
為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。


圖I為檢測核酸(DNA)的結(jié)果比較圖，其中各曲線編號所使用的探針和模板為1， 本發(fā)明優(yōu)化的探針，陽性模板；2，對照探針1，陽性模板；3，對照探針1，陰性模板；4，對照探針2，陽性模板；5，本發(fā)明優(yōu)化的探針陰性模板；6，對照探針2，陰性模板。
圖2為檢測核酸(RNA)結(jié)果圖，的結(jié)果比較圖，其中各曲線編號所使用的探針和模板為山本發(fā)明優(yōu)化的探針，陽性模板；2，對照探針1，陽性模板；3，對照探針1，陰性模板; 4，對照探針2，陽性模板；5，本發(fā)明優(yōu)化的探針陰性模板；6，對照探針2，陰性模板。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)行說明，其中引物、探針的合成、試劑以及樣品均可通過商業(yè)渠道獲得，實(shí)驗(yàn)步驟如有未盡之處，均可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(科學(xué)出版社，2002)等教課書和實(shí)驗(yàn)手冊，并可以按照商業(yè)化的酶、試劑和設(shè)備的廠商說明來進(jìn)行。
實(shí)施例IDNA序列的檢測
我們設(shè)計(jì)了針對HBV S基因序列的引物和探針，委托北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司合成了如下PCR擴(kuò)增引物和探針(包括對照探針)，以含有HBV(乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA) 定性及定量國家參考品，編號300009，可根據(jù)規(guī)定購自中國食品藥品檢定研究院，用純化水分別稀釋)I X 102IU/ml (陽性)、20IU/ml (靈敏度I)及10IU/ml (靈敏度2)的水溶液或純水(陰性)分別作為模板，在ABI 7500突光PCR儀(可購自Applied Biosystems公司) 上進(jìn)行PCR檢測
正向引物CGAGGCAGGTCCCCTAGAA
反向引物CGGCGATTGAGACCTTCGT
傳統(tǒng)的Taqman特異性方法使用的探針(對照探針I(yè)): FAM-AGAACTCCCTCGCCTCG-ECLIPSE，其核酸的5’端標(biāo)記有熒光染料FAM，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán) ECLIPSE
傳統(tǒng)的分子信標(biāo)方法使用的探針(對照探針2) FAM- GCACG AGAACTCCCTCGCCTCG CGTGC -ECLIPSE,其核酸的5’端標(biāo)記有熒光染料FAM，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)ECLIPSE，其中斜體字部分是互補(bǔ)配對序列
本發(fā)明優(yōu)化的探針FAM-v4GA4CTCCCTCGCCTCG GTTCTAT -ECLIPSE,其核酸的 5’ 端標(biāo)記有熒光染料FAM，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)ECLIPSE，其中斜體字部分是互補(bǔ)配對序列， 粗體字部分是延伸序列
PCR反應(yīng)體系
模板40|ilI Ox緩沖液6|ildNTP (IOOmM)各 0.12|ilTaq 聚合酶(5U/|il)0.5|il正向引物(IOOmM)0.2|il反向引物(IOOmM)0.2|il探針(IOOmM)0.1 |ilH2O補(bǔ)足至60|il
以上的反應(yīng)體系中，模板分別取陽性模板、陰性模板或靈敏度1、2模板，探針分別取上述對照探針1、2或本發(fā)明優(yōu)化的探針，PCR反應(yīng)的步驟為94°C 10分鐘，45個循環(huán) (940C 10秒，60°C 30秒)，并在60°C檢測熒光信號。
檢測結(jié)果如圖I和表I所示，在相同檢測條件下，使用本發(fā)明優(yōu)化的新擴(kuò)增體系 (含新型探針)檢測HBV(DNA)樣品，取得的陰性及陽性樣品檢測的熒光本底值均較低，而陽性樣品檢測時取得的熒光信號值大，其ARn(熒光信號值與熒光本底的差值)值高，實(shí)時熒光檢測的Ct值(Ct值與待檢模板數(shù)量成反比)最小，檢測靈敏度高；使用對照探針2檢測HBV(DNA)樣品，雖然熒光本底值與本發(fā)明相似，但是熒光信號值較小，其ARn值很低，因此在檢測低濃度樣本時，因ARn值過低無法檢出，降低了檢測靈敏度；使用對照探針I(yè)檢測 HBV (DNA)樣品，熒光本底值較大，雖然其陽性樣本的熒光信號值較高，但因熒光本底值過高而降低了 △ Rn值，使低濃度樣本不易穩(wěn)定的檢出，且過高的熒光本底容易產(chǎn)生非特異的熒光信號起跳，從而降低了檢測特異性?？梢?，本發(fā)明優(yōu)化的擴(kuò)增體系在實(shí)現(xiàn)高信噪比的同時達(dá)到了高特異性及高靈敏度的DNA檢測效果，特別是在低濃度樣本檢測時能達(dá)到更好的可靠性和穩(wěn)定性，經(jīng)測試，相對于傳統(tǒng)方法，本發(fā)明優(yōu)化的方法檢測DNA樣品約能提高靈敏度 5-10 倍。
表I檢測HBV核酸的結(jié)果比較表
權(quán)利要求
1.檢測樣品中靶核酸的方法，其包括(1)將樣品與PCR擴(kuò)增試劑和熒光標(biāo)記的探針混合，其中探針的核酸部分包括第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列，而且第一互補(bǔ)序列和第二互補(bǔ)序列能夠互補(bǔ)配對，優(yōu)選探針的核酸部分從5’端到3’端依次由第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列組成；和(2)進(jìn)行PCR，并實(shí)時檢測熒光。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中靶核酸是RNA或DNA，優(yōu)選是HCVRNA或HBVDNA，例如 HBV S基因或HCVNS2基因。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中PCR擴(kuò)增試劑包括能擴(kuò)增靶核酸序列的引物對、DNA聚合酶和dNTP。
4.權(quán)利要求I或3所述的方法，其中PCR是RT-PCR;優(yōu)選其中PCR擴(kuò)增試劑還包括反轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)選還包括RNase抑制劑。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中引物對是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和 CGGCGATTGAGACCTTCGT,或者是 TCGCCATATTACAAGCGCTACA 和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。
6.權(quán)利要求I所述的方法，其中，靶核酸特異性序列為8 20個堿基的長度，優(yōu)選為9 15個堿基的長度，更優(yōu)選為 10 12個堿基的長度，最優(yōu)選為TCCCTCGCCTCG或GGTGGCTTCA ；第一互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5個堿基的長度，最優(yōu)選為AGAAC或CATGT ；第二互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5個堿基的長度，最優(yōu)選為GTTCT或ACATG ;和/或，延伸序列為2 5個堿基的長度，優(yōu)選為2 3個堿基的長度，更優(yōu)選為2個堿基的長度，最優(yōu)選為AT。
7.權(quán)利要求I所述的方法，其中PCR沒有延伸步驟，優(yōu)選PCR的退火溫度為55 65°C， 更優(yōu)選為58 63°C，最優(yōu)選為60°C ;和/或，優(yōu)選PCR的退火時間為20 60秒，更優(yōu)選為 25 40秒，最優(yōu)選為30秒。
8.樣品中靶核酸的檢測試劑盒，其包括PCR擴(kuò)增試劑和熒光標(biāo)記的探針，其中探針的核酸部分包括第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列，而且第一互補(bǔ)序列和第二互補(bǔ)序列能夠互補(bǔ)配對，優(yōu)選探針的核酸部分從5’端到3’端依次由第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列組成。
9.權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中PCR擴(kuò)增試劑包括能擴(kuò)增靶核酸序列的引物對、DNA 聚合酶和dNTP。
10.權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中PCR擴(kuò)增試劑是RT-PCR擴(kuò)增試劑，其包括能擴(kuò)增靶核酸序列的引物對、DNA聚合酶、dNTP和反轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)選還包括RNase抑制劑。
11.權(quán)利要求9或10所述的試劑盒，其中引物對是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和 CGGCGATTGAGACCTTCGT,或者是 TCGCCATATTACAAGCGCTACA 和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。
12.權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中靶核酸特異性序列為8 20個堿基的長度，優(yōu)選為9 15個堿基的長度，更優(yōu)選為 10 12個堿基的長度，最優(yōu)選為TCCCTCGCCTCG或GGTGGCTTCA ；第一互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5個堿基的長度，最優(yōu)選為AGAAC或CATGT ；第二互補(bǔ)序列分別為4 8個堿基的長度，優(yōu)選為5 7個堿基的長度，更優(yōu)選為5個堿基的長度，最優(yōu)選為GTTCT或ACATG ;和/或，延伸序列為2 5個堿基的長度，優(yōu)選為2 3個堿基的長度，更優(yōu)選為2個堿基的長度，最優(yōu)選為AT。
13.權(quán)利要求8 12所述的試劑盒在制備用于檢測樣品中靶核酸的方法的檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中檢測樣品中靶核酸的方法是權(quán)利要求I 7所述的方法。
15.權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，檢測產(chǎn)品還包括記載權(quán)利要求I 7所述的方法的說明書和/或熒光PCR儀。
16.權(quán)利要求I 15中所用的探針或引物對。
全文摘要
高靈敏度實(shí)時熒光檢測方法。本發(fā)明提供了檢測樣品中靶核酸的方法，其包括，將樣品與PCR擴(kuò)增試劑和熒光標(biāo)記的探針混合，其中探針的核酸部分包括第一互補(bǔ)序列、靶核酸特異性序列、第二互補(bǔ)序列和延伸序列，而且第一互補(bǔ)序列和第二互補(bǔ)序列能夠互補(bǔ)配對；和進(jìn)行PCR，并實(shí)時檢測熒光。本發(fā)明還提供了檢測試劑盒、制備檢測產(chǎn)品的應(yīng)用以及其中使用的引物、探針等試劑。
文檔編號C12Q1/68GK102534033SQ20121003830
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者劉明霞, 張文艷, 陳悅科 申請人:蘇州華益美生物科技有限公司