專利名稱：檢測(cè)Ⅱ類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的PCR引物組，以及利用該P(yáng)CR引物組鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng)的方法。
背景技術(shù)：
群體感應(yīng)(Quorum Sensing，QS)是指微生物群體某些基因的表達(dá)受到與群體密度相關(guān)的信號(hào)分子調(diào)控的現(xiàn)象。QS系統(tǒng)參與調(diào)控一系列生物學(xué)功能，如:菌體發(fā)光、抗生素的生物合成、毒性因子的產(chǎn)生、胞外多糖的合成、細(xì)菌叢集、生物膜形成、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移、穩(wěn)定生長(zhǎng)期的進(jìn)入等。QS系統(tǒng)被認(rèn)為參與調(diào)控II類細(xì)菌素的合成,該系統(tǒng)包括自誘導(dǎo)肽(autoinducingpeptide, AIP)、組氨酸蛋白激酶和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，又稱為三組分系統(tǒng)。AIP作為信號(hào)分子，用于指示細(xì)胞密度。當(dāng)AIP達(dá)到某一臨界的濃度閾值時(shí)，便可激活一系列特定基因的表達(dá)。Lactobacillus plantarum WCFSl、J51 與 L.plantarum Cll 具有相同的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由編碼自誘導(dǎo)肽的基因plnA、編碼組氨酸蛋白激酶的基因plnB、編碼感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的基因plnC和plnD組成。L.plantarum NC8與L.plantarum Cll具有相似的操縱子，其中P1NC8IF編碼自誘導(dǎo)肽，P1NC8HK編碼組氨酸蛋白激酶，plnD編碼感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白。對(duì)G-群體感應(yīng)的研究一般通過(guò)檢測(cè)其信號(hào)分子——高絲氨酸內(nèi)酯類來(lái)進(jìn)行確認(rèn)，而且其檢測(cè)方法已有很多報(bào)道和專利。群體感應(yīng)是調(diào)控II類細(xì)菌素合成的重要機(jī)制，產(chǎn)II類細(xì)菌素乳酸菌以小肽作為其信號(hào)分 子，但目前其檢測(cè)方法尚未確立，這也成為限制其群體感應(yīng)研究的巨大障礙。雖然已發(fā)現(xiàn)許多產(chǎn)II類細(xì)菌素乳酸菌，但其細(xì)菌素的產(chǎn)生是否受到群體感應(yīng)調(diào)控尚未形成一套有效的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的PCR引物組。本發(fā)明所提供的PCR引物組由9個(gè)引物對(duì)組成，第一個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的特異于自誘導(dǎo)肽基因的引物對(duì)I ;第二個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的特異于自誘導(dǎo)肽基因的引物對(duì)2 ;第三個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的特異于組氨酸蛋白激酶基因的引物對(duì)3 ;第四個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成為特異于組氨酸蛋白激酶基因的引物對(duì)4 ;第五個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的特異于組氨酸蛋白激酶基因的引物對(duì)5 ;第六個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列11和序列12所不的兩條單鏈DNA組成的特異于感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)6 ;第七個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA組成的特異于感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因基因的引物對(duì)7 ;第八個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列15和序列16所示的兩條單鏈DNA組成的特異于感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)8 ;第九個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列17和序列18所不的兩條單鏈DNA組成的特異于組氣酸蛋白激酶基因和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)9。含有上述PCR引物組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述PCR引物組的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法包括將所述PCR引物組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。上述PCR試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法包括如下步驟:將所述PCR引物組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)包裝在同一試劑盒內(nèi)=PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、4種dNTP和ddH20。上述PCR引物組在制備用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否含有群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因?yàn)樽哉T導(dǎo)肽基因、組氨酸蛋白激酶基因和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因。鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否含有群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因?yàn)樽哉T導(dǎo)肽基因、組氨酸蛋白激酶基因和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因。所述方法包括下述(I)和(2)的步驟:所述(I)為如下A)-1):A)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生 菌的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)I進(jìn)行PCR反應(yīng)； B)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)2進(jìn)行PCR反應(yīng)；C)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)3進(jìn)行PCR反應(yīng)；D)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)4進(jìn)行PCR反應(yīng)；E)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)5進(jìn)行PCR反應(yīng)；F)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)6進(jìn)行PCR反應(yīng)；G)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)7進(jìn)行PCR反應(yīng)；H)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)8進(jìn)行PCR反應(yīng)；I)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)9進(jìn)行PCR反應(yīng)；(2)檢測(cè)步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否含有所述群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因，即所述自誘導(dǎo)肽基因、所述組氨酸蛋白激酶基因和所述感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因:
若引物對(duì)I的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?450bp的DNA片段，和/或引物對(duì)2的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?114bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌含有自誘導(dǎo)肽基因或候選含有自誘導(dǎo)肽基因；若引物對(duì)I的PCR產(chǎn)物不含有450bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)2的PCR產(chǎn)物也不含有114bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌不含有自誘導(dǎo)肽基因或候選不含有自誘導(dǎo)肽基因；若引物對(duì)3的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?165bp的DNA片段，和/或引物對(duì)4的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?758bp的DNA片段，和/或引物對(duì)5的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?927bp的DNA片段，和/或引物對(duì)9的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?1727bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌含有組氨酸蛋白激酶基因或候選含有組氨酸蛋白激酶基因；若弓丨物對(duì)3的PCR產(chǎn)物不含有165bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)4的PCR產(chǎn)物不含有758bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)5的PCR產(chǎn)物不含有927bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)9的PCR產(chǎn)物不含有1727bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌不含有組氨酸蛋白激酶基因或候選不含有組氨酸蛋白激酶基因；若引物對(duì)6的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?108bp的DNA片段，和/或引物對(duì)7 的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?414bp的DNA片段，和/或引物對(duì)8的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?1249bp的DNA片段，和/或引物對(duì)9的PCR產(chǎn)物含有(或?yàn)?1727bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因或候選含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因；若引物對(duì)6的PCR產(chǎn)物不含有108bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)7的PCR產(chǎn)物不含有414bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)8的PCR產(chǎn)物不含有1249bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)9的PCR產(chǎn)物不含有1727bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌不含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因或候選不含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因利用上述鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否含有群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的方法在獲得存在或候選存在群體感應(yīng)系統(tǒng)的II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述應(yīng)用為將利用上述方法鑒定得到的滿足如下a)_c)條件的II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌作為存在或候選存在群體感應(yīng)系統(tǒng)的II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌:a)含有或候選含有自誘導(dǎo)肽基因；b)含有或候選含有組氨酸蛋白激酶基因；c)含有或候選含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因。所述II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌為乳酸菌，可為乳桿菌(如植物乳桿菌(L.plantarum)),在本發(fā)明的實(shí)施例中具體為類植物乳桿菌(L.paraplantarum)L-XMl。本發(fā)明通過(guò)PCR擴(kuò)增群體感應(yīng)系統(tǒng)三組分的基因，從而確認(rèn)群體感應(yīng)系統(tǒng)的存在，這使得從II類細(xì)菌素中大規(guī)模高通量篩選受群體感應(yīng)調(diào)控的菌株成為了可能。


圖1為鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的流程圖。其中，QS表示群體感應(yīng)系統(tǒng)。圖2為鑒定或輔助鑒定類植物乳桿菌(L.paraplantarum) L-XMl是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng)的電泳結(jié)果。其中，A為引物對(duì)I擴(kuò)增出的自誘導(dǎo)肽基因特異性片段的電泳圖出為用引物對(duì)3擴(kuò)增出的組氨酸蛋白激酶基因特異性片段的電泳圖；C為用引物對(duì)5擴(kuò)增出的組氨酸蛋白激酶基因特異性片段的電泳圖；D為用引物對(duì)9擴(kuò)增出的組氨酸蛋白激酶基因和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因特異性片段的電泳圖；E為用引物對(duì)8擴(kuò)增出的感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因特異性片段的電泳圖。A-E中，泳道M均為BM2000DNA ladder ;泳道I均為相應(yīng)基因PCR產(chǎn)物；泳道2均為陰性對(duì)照。圖3為利用液體脫脂乳培養(yǎng)基檢測(cè)或輔助檢測(cè)待檢細(xì)菌產(chǎn)生II類細(xì)菌素是否存在群體感應(yīng)調(diào)控現(xiàn)象的流程圖。圖4為自誘導(dǎo)物誘導(dǎo)II類細(xì)菌素產(chǎn)生的抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，A實(shí)驗(yàn)組(經(jīng)自誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的液體脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)物的抑菌效果)為對(duì)照組I (用等量MRS液體培養(yǎng)基代替自誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的液體脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)物的抑菌效果)；(:為對(duì)照組2(自誘導(dǎo)物的抑菌效果，濃度為5 μ L/10mL，用新鮮MRS培養(yǎng)基稀釋))；D為對(duì)照組3 (L.paraplantarumL-XM160h培養(yǎng)物與自誘導(dǎo)物(終濃度5 μ L/10mL)的混合物的抑菌效果)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。MRS培養(yǎng)基:稱取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，K2HP04.3Η20 2g，檸檬酸三銨 2g，NaAC 5g，葡萄糖 20g，MgSO4.7Η20 0.58g，MnSO4.Η20 0.25g，吐溫 801mL，溶于 IOOOmL蒸餾水中，121°C滅菌20min。實(shí)施例1、鑒定或輔助鑒定類植物乳桿菌(L.paraplantarum)L-XMl是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng) 一、利用本發(fā)明的方法鑒定或輔助鑒定類植物乳桿菌(L.paraplantarum)L-XMl (原編號(hào)為Yl，現(xiàn)經(jīng)鑒定正式命名為L(zhǎng).paraplantarum L-XMl，參見:桂萌，張曉瓊，于沐洋，武瑞贊，李平蘭.耐熱·乳酸菌肉品天然發(fā)酵劑的篩選鑒定.肉類研究，2011，25(8):1-5)是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng)(實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示)。具體操作如下:1、基因組DNA提取將類植物乳桿菌(L.paraplantarum) L-XMl以5% (體積比)的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，取2mL，13800 Xg離心lmin，收集菌體。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA kit)(天根生化科技(北京)有限公司目錄號(hào):DP302-02)提取基因組DNA，具體操作方法參見試劑盒說(shuō)明書。2、PCR 擴(kuò)增PCR擴(kuò)增的目的基因涉及如下基因:編碼群體感應(yīng)系統(tǒng)組分自誘導(dǎo)肽(或自誘導(dǎo)肽前體)的基因；編碼群體感應(yīng)系統(tǒng)組分組氨酸蛋白激酶的基因；編碼群體感應(yīng)系統(tǒng)組分感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的基因。PCR擴(kuò)增所用的引物共涉及9個(gè)引物對(duì):第一個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的特異于自誘導(dǎo)肽基因的引物對(duì)I ;第二個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的特異于自誘導(dǎo)肽基因的引物對(duì)2 ;第三個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的特異于組氨酸蛋白激酶基因的引物對(duì)3 ;第四個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成為特異于組氨酸蛋白激酶基因的引物對(duì)4 ;第五個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的特異于組氨酸蛋白激酶的引物對(duì)5 ;第六個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列11和序列12所不的兩條單鏈DNA組成的特異于感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)6 ；第七個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA組成的特異于感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)7 ;第八個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列15和序列16所示的兩條單鏈DNA組成的特異于感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)8 ;第九個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列17和序列18所示的兩條單鏈DNA組成的特異于組氨酸蛋白激酶基因和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)9。針對(duì)上述9個(gè)引物對(duì)的不同，設(shè)置9個(gè)不同的PCR反應(yīng)體系。每個(gè)反應(yīng)體系包括2 X Taq PCR Master Mix，模板DNA (步驟⑴提取的基因組DNA) 10ng，上下游引物(濃度均為IOpmol μ Γ1)各I μ L，ddH20補(bǔ)足至25 μ L。當(dāng)上游引物為序列I所示引物時(shí)，下游引物為序列2所示引物；當(dāng)上游引物為序列3所示引物時(shí)，下游引物為序列4所示引物；當(dāng)上游引物為序列5所示引物時(shí)，下游引物為序列6所示引物；當(dāng)上游引物為序列7所示引物時(shí)，下游引物為序列8所示引物；當(dāng)上游引物為序列9所示引物時(shí)，下游引物為序列10所示引物；當(dāng)上游引物為序列11所示引物時(shí)，下游引物為序列12所示引物；當(dāng)上游引物為序列13所示引物時(shí)，下游引物為序列14所示引物；當(dāng)上游引物為序列15所示引物時(shí)，下游引物為序列16所示引物；當(dāng)上游引物為序列17所示引物時(shí)，下游引物為序列18所示引物。上述9個(gè)不同的PCR反應(yīng)體系，均同時(shí)設(shè)置以ddH20代替模板的陰性對(duì)照。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，退火30s (不同引物的退火溫度不同，具體見表I)，72°C延 伸，延伸時(shí)間依據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度確定，約1000bp/min，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物。 表IPCR擴(kuò)增所用弓丨物
權(quán)利要求
1.用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的PCR引物組，由9個(gè)引物對(duì)組成，第一個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的特異于自誘導(dǎo)肽基因的引物對(duì)I ;第二個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的特異于自誘導(dǎo)肽基因的引物對(duì)2 ;第三個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的特異于組氨酸蛋白激酶基因的引物對(duì)3 ;第四個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成為特異于組氨酸蛋白激酶基因的引物對(duì)4;第五個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的特異于組氨酸蛋白激酶的引物對(duì)5 ;第六個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的特異于感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)6 ;第七個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列13和序列14所不的兩條單鏈DNA組成的特異于感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)7 ;第八個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列15和序列16所示的兩條單鏈DNA組成的特異于感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)8 ;第九個(gè)引物對(duì)是由序列表中的序列17和序列18所不的兩條單鏈DNA組成的特異于組氨酸蛋白激酶基因和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的引物對(duì)9。
2.含有權(quán)利要求I所述的PCR引物組的試劑盒。
3.權(quán)利要求I所述PCR引物組的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權(quán)利要求I所述PCR引物組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
4.權(quán)利要求2所述PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求I所述PCR引物組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、4種dNTP和ddH20。
5.權(quán)利要求I所述的PCR引物組在制備用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否含有群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的試劑盒中的應(yīng)用，所述群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因?yàn)樽哉T導(dǎo)肽基因、組氨酸蛋白激酶基因和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因。
6.鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否含有群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的方法，所述群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因?yàn)樽哉T導(dǎo)肽基因、組氨酸蛋白激酶基因和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因，其特征在于所述方法包括下述(I)和(2)的步驟 所述⑴為如下A)-I) A)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求I中所述引物對(duì)I進(jìn)行PCR反應(yīng)； B)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求I中所述引物對(duì)2進(jìn)行PCR反應(yīng)； C)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求I中所述引物對(duì)3進(jìn)行PCR反應(yīng)； D)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求I中所述引物對(duì)4進(jìn)行PCR反應(yīng)； E)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求I中所述引物對(duì)5進(jìn)行PCR反應(yīng)； F)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求I中所述引物對(duì)6進(jìn)行PCR反應(yīng)； G)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求I中所述引物對(duì)7進(jìn)行PCR反應(yīng)； H)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2中所述引物對(duì)8進(jìn)行PCR反應(yīng)； I)以待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2中所述引物對(duì)9進(jìn)行PCR反應(yīng)； (2)檢測(cè)步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否含有所述群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因 若引物對(duì)I的PCR產(chǎn)物含有450bp的DNA片段，和/或引物對(duì)2的PCR產(chǎn)物含有114bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌含有自誘導(dǎo)肽基因或候選含有自誘導(dǎo)肽基因；若引物對(duì)I的PCR產(chǎn)物不含有450bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)2的PCR產(chǎn)物也不含有114bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌不含有自誘導(dǎo)肽基因或候選不含有自誘導(dǎo)肽基因；若引物對(duì)3的PCR產(chǎn)物含有165bp的DNA片段，和/或引物對(duì)4的PCR產(chǎn)物含有758bp的DNA片段，和/或引物對(duì)5的PCR產(chǎn)物含有927bp的DNA片段，和/或引物對(duì)9的PCR產(chǎn)物含有1727bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌含有組氨酸蛋白激酶基因或候選含有組氨酸蛋白激酶基因；若引物對(duì)3的PCR產(chǎn)物不含有165bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)4的PCR產(chǎn)物不含有758bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)5的PCR產(chǎn)物不含有927bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)9的PCR產(chǎn)物不含有1727bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌不含有組氨酸蛋白激酶基因或候選不含有組氨酸蛋白激酶基因；若引物對(duì)6的PCR產(chǎn)物含有108bp的DNA片段，和/或引物對(duì)7的PCR產(chǎn)物含有414bp的DNA片段，和/或引物對(duì)8的PCR產(chǎn)物含有1249bp的DNA片段，和/或引物對(duì)9的PCR產(chǎn)物含有1727bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因或候選含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因；若引物對(duì)6的PCR產(chǎn)物不含有108bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)7的PCR產(chǎn)物不含有414bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)8的PCR產(chǎn)物不含有1249bp的DNA片段，同時(shí)引物對(duì)9的PCR產(chǎn)物不含有1727bp的DNA片段，則所述待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌不含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因或候選不含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因。
7.權(quán)利要求6的方法在獲得存在或候選存在群體感應(yīng)系統(tǒng)的II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將利用權(quán)利要求6的方法鑒定得到的滿足如下a)_c)條件的II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌作為存在或候選存在群體感應(yīng)系統(tǒng)的II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌 a)含有或候選含有自誘導(dǎo)肽基因； b)含有或候選含有組氨酸蛋白激酶基因； c)含有或候選含有感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PCR引物組，或權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌為乳酸菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PCR引物組或方法，其特征在于所述II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌為乳桿菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的PCR引物組或方法，其特征在于所述II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌為類植物乳桿菌(L. paraplantarum) L-XMl或植物乳桿菌(L. plantarum)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)II類細(xì)菌素產(chǎn)生菌是否存在群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的PCR引物組。本發(fā)明所提供的PCR引物組為如下由18條引物組成，分別為序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17和序列18所示的DNA單鏈組成。本發(fā)明通過(guò)PCR擴(kuò)增群體感應(yīng)系統(tǒng)三組分的基因，從而確認(rèn)群體感應(yīng)系統(tǒng)的存在，這使得從II類細(xì)菌素中大規(guī)模高通量篩選受群體感應(yīng)調(diào)控的菌株成為了可能。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103255204SQ20121003965
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者李平蘭, 張香美, 趙斌, 張旭, 尚楠 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)