專利名稱：海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記及其輔助育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記及其輔助育種方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)的扇貝養(yǎng)殖業(yè)在經(jīng)過(guò)最初階段的蓬勃發(fā)展以后，逐漸暴露出了許多亟待解決的問(wèn)題。長(zhǎng)期的近親繁育、累代養(yǎng)殖導(dǎo)致了近交衰退，使得海灣扇貝生長(zhǎng)緩慢、抗逆性降低。近年來(lái)環(huán)境惡化尤其是夏季高溫使扇貝機(jī)體代謝紊亂，經(jīng)常發(fā)生大規(guī)模死亡事件，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，加快育種核心前沿技術(shù)的研究和抗逆優(yōu)良品種的選育已成為保障扇貝養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。但由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)貝類抗熱機(jī)理及抗熱功能基因的研究較少，缺乏抗熱相關(guān)的分子標(biāo)記，導(dǎo)致貝類抗熱品種培育的研究進(jìn)展緩慢，很大程度上制約了扇貝養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定、健康和可持續(xù)發(fā)展。金屬硫蛋白是一類低分子量、富含巰基和能螯合金屬離子的蛋白質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)行使多種功能，例如參與生物體內(nèi)必需金屬元素的調(diào)節(jié)和非必需金屬元素的解毒作用，活性氧的清除以及機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖、衰老、腫瘤發(fā)生、免疫、應(yīng)激反應(yīng)等生理生化反應(yīng)。有研究表明，生物體受到熱脅迫時(shí)若干基因表達(dá)上調(diào)，其中金屬硫蛋白作為氧化還原系統(tǒng)的組分反應(yīng)尤為劇烈。研究表明金屬硫蛋白能夠廣泛清除包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥基(-HO)在內(nèi)的ROS類物質(zhì)，是一種內(nèi)源性抗氧化劑，同時(shí)它能進(jìn)一步調(diào)控其他抗氧化酶的表達(dá)，從而協(xié)助機(jī)體對(duì)抗氧化脅迫。目前關(guān)于貝類金屬硫蛋白的研究多集中在它對(duì)重金屬調(diào)控及活性氧清除等方面，但其多態(tài)性與貝類抗熱力強(qiáng)弱之間的關(guān)系研究仍未見(jiàn)報(bào)道，因此尋找扇貝金屬硫蛋白基因的多態(tài)性，并研究多態(tài)位點(diǎn)在耐熱相關(guān)不同種群中的分布特征，將為研究和利用金屬硫蛋白基因作為潛在的抗熱性標(biāo)記輔助選擇的候選基因奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記及其輔助育種方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為—種海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記，灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記為序列表SEQ ID No. I堿基序列所示，起始密碼子上游第337個(gè)堿基A為抗熱基因位點(diǎn)。海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的獲得，按如下步驟獲得I)海灣扇貝金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)部分序列的克?。灰院成蓉愰]殼肌的總DNA為模板，根據(jù)已知的金屬硫蛋白基因序列在啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)引物AiMTlpF和AiMTlpR擴(kuò)增得到 DNA 序列，待用；AiMTlpF 5 1 -atgtaagggcacttatgcttgatctttagt-3 1 和 AiMTlpR5' -agcagtcaggaccagcacagcca-3'；2)抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的篩選；對(duì)來(lái)自抗熱群體和熱敏感群體的各6個(gè)個(gè)體的12個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，其多態(tài)性位點(diǎn)為-488C/T，-450A/C, -447G/C，-440A、ins-del, -431T/C, -430G/A, -428A/T, -375T/C, -363T/G, -337A/C, -311T/A, -310A/T，-298G/T，-265A/G，-253A/G，-251T/C 和-118C/T ;再提取 50 個(gè)熱敏感個(gè)體和 50 個(gè)抗熱個(gè)體的基因組DNA后，針對(duì)-375T/C位點(diǎn)多態(tài)，首先PCR擴(kuò)增金屬硫蛋白啟動(dòng)子區(qū)序列，然后選用Mse I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，得-375T/T，-375T/C和-375C/C 3種基因型，以-337A/C位點(diǎn)多態(tài)，利用Bi-PASA PCR進(jìn)行分析，瓊脂糖凝膠電泳后，得-337A/A，-337A/C 和-337C/C 3 種基因型，經(jīng) Chi-square Test 分析，-337A/A 個(gè)體在抗熱群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于敏感群體，即-337A/A為抗熱相關(guān)的金屬硫蛋白基因標(biāo)記。海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記輔助育種方法，以在抗熱群體中高頻出現(xiàn)的金屬硫蛋白基因型作為抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記，將攜帶這種抗熱相關(guān)基因標(biāo)記的海灣扇貝進(jìn)行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)序列，研究其多態(tài)性；同時(shí)進(jìn)行熱脅迫處理實(shí)驗(yàn)，研究抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的遺傳規(guī)律及其與海灣扇貝耐熱能力的關(guān)系，從中篩選出既帶有抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記，耐熱能力又顯著提高的貝苗進(jìn)行多代繁殖和培育后即可建立抗熱新品種。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，本發(fā)明借助分子生物學(xué)技術(shù)，以海灣扇貝為材料首次發(fā)掘了我國(guó)養(yǎng)殖貝類抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記，初步建立了海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記輔助育種技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便快捷、選育效率高、周期短等特點(diǎn)，為貝類抗熱品種的培育開(kāi)辟了新的分子育種技術(shù)途徑，對(duì)養(yǎng)殖貝類抗熱品種的選育具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例提供的海灣扇貝金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)部分序列圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的海灣扇貝金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)序列圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的海灣扇貝金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)不同基因型的分型圖譜(其中(A)Mse I酶切圖譜M1為DL2000 Marker, I為-375T/T基因型酶切圖譜，2為-375T/C基因型酶切圖譜，3為-375C/C基因型酶切圖譜，M2為20bp Marker。(B)Bi-PASAPCR圖譜M1為DL2000 Marker, I為-337A/C基因型PCR圖譜，2為-337C/C基因型PCR圖譜，3為-337A/A基因型PCR圖譜。)。圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的海灣扇貝抗熱群體及敏感群體中金屬硫蛋白不同基因型的分布頻率以及相應(yīng)的卡方檢驗(yàn)圖。
具體實(shí)施例方式下面以海灣扇貝抗熱相關(guān)海灣扇貝金屬硫蛋白基因標(biāo)記及其輔助育種技術(shù)的建立為例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記，包括I.海灣扇貝金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)部分序列的克??；2.抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的篩選；3.攜帶抗熱相關(guān)基因標(biāo)記個(gè)體的快速篩查；I.海灣扇貝金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆 參照分子克隆所述方法從海灣扇貝閉殼肌中提取總DNA ;根據(jù)已知的金屬硫蛋白基因序列在其啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)引物，克隆得到一段617個(gè)堿基的DNA序列，連入T載體后進(jìn)行測(cè)序，獲得其核苷酸序列。2.抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的篩選對(duì)來(lái)自抗熱群體和熱敏感群體的各6個(gè)個(gè)體的12個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了 17處多態(tài)性位點(diǎn)；隨機(jī)選取50個(gè)熱敏感個(gè)體和50個(gè)抗熱扇貝個(gè)體，提取基因組DNA，針對(duì)-375T/C位點(diǎn)多態(tài)，首先PCR擴(kuò)增金屬硫蛋白啟動(dòng)子區(qū)序列，然后選用Mse I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)3種基因型，-375T/T，-375T/C和-375C/C。針對(duì)-337A/C位點(diǎn)多態(tài)，利用Bi-PASA PCR進(jìn)行分析，瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)3種基因型，-337A/A，-337A/C和-337C/C。-375位點(diǎn)的3種基因型個(gè)體在抗熱群體和熱敏感群體中出現(xiàn)的頻率無(wú)顯著差別，而-337A/A個(gè)體在抗熱群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于熱敏感群體， 而-337C/C個(gè)體在熱敏感群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于抗熱群體。因此，將-337C/C作為熱敏感相關(guān)的金屬硫蛋白基因標(biāo)記，而將-337A/A作為抗熱相關(guān)的金屬硫蛋白基因標(biāo)記。3.攜帶抗熱相關(guān)基因標(biāo)記個(gè)體的快速篩查取海灣扇貝個(gè)體全血I μ I作為模版，利用用Bi-PASA PCR進(jìn)行分析，瓊脂糖凝膠電泳分型后，選擇-337Α/Α個(gè)體作為抗熱個(gè)體。實(shí)施例I海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的獲得，按如下步驟獲得I.海灣扇貝金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆參照分子克隆所述方法，從海灣扇貝閉殼肌中提取總DNA ;根據(jù)已知的金屬硫蛋白基因序列在啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)引物 AiMTlpF (5' -atgtaagggcacttatgcttgatctttagt-3 ')和 AiMTlpR(5' -agcagtcaggaccagcacagcca-3')，按照以下程序進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增94°C變性5min ;之后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的恒定擴(kuò)增(94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin);最后在72°C保溫lOmin?？寺〉玫揭欢?17個(gè)堿基的DNA序列，連入T載體后進(jìn)行測(cè)序，獲得其核苷酸序列(參見(jiàn)圖I)。克隆的MT啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)有617bp，根據(jù)NNPP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，該片段具有四個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS1-TSS4)，若干個(gè)核心啟動(dòng)子元件TATA box和CAATbox。Patch軟件和TESS數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)，該序列含有不少潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括金屬應(yīng)答元件(MREs)，糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件(GREs)，抗氧化應(yīng)答元件(AREs)，熱激元件(HSE)和 SPI。2.海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的篩選對(duì)來(lái)自抗熱群體和熱敏感群體的各6個(gè)個(gè)體的12個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了 17處多態(tài)性位點(diǎn)(-488C/T，-450A/C, -447G/C, -440A ins-del, -431T/C, -430G/A, -428A/T, -375T/C, -363T/G, -337A/C, -311T/A, -310A/T, -298G/T, -265A/G, -253A/G, -251T/C和-118C/T)(參見(jiàn)圖2)。提取50個(gè)熱敏感個(gè)體和50個(gè)抗熱個(gè)體的基因組DNA后，針對(duì)-375T/C位點(diǎn)多態(tài)，首先PCR擴(kuò)增金屬硫蛋白啟動(dòng)子區(qū)序列，程序如下94°C變性5min ；接著35個(gè)循環(huán)的恒定擴(kuò)增(94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin);最后在72°C保溫IOmin。然后選用Mse I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。對(duì)于-375T等位基因，Mse I酶切后會(huì)產(chǎn)生大小分別為30，54，55，61，65，118，122和407bp的8個(gè)片段，而對(duì)于-375C等位基因則會(huì)產(chǎn)生大小分別為30，54，55，65，118，122和468bp的7個(gè)片段。取酶切產(chǎn)物10 μ L，加溴酚藍(lán)上樣緩沖液2 μ L，以180V電壓在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳120min。用O. 5 μ g/mL溴化乙錠染色后在紫外燈下觀察是否有468和407bp的兩條帶進(jìn)行分型，共發(fā)現(xiàn)3種基因型，-375T/T，-375T/C 和-375C/C。針對(duì)-337A/C 位點(diǎn)多態(tài)，以 AiMTlpP (5' -ttcaggttggaaagttcatgtaagggcact-3' ),AiMTlpQ(5; -caacacaccttcggaagacatcacagc-3' ),AiMTlpA(5' -ggggggggggcatattttgaacagttc-3' ) #口AiMTlpB(5, -ggggggggggctcagctagacatgat_3')為引物，利用Bi-PASA PCR進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)采用熱啟動(dòng)及降落程序來(lái)增強(qiáng)擴(kuò)增的特異性，反應(yīng)條件如下94°C變性5min ;之后進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的降落程序(94°C變性30s，復(fù)性溫度從63°C開(kāi)始，每進(jìn)行一個(gè)熱循環(huán)溫度降低O. 8°C，直降至55°C，變性時(shí)間為30s，72°C延伸30s);然后接25個(gè)循環(huán)的恒定擴(kuò)增(94°C變性30s ;55°C退火30s，72。。延伸30s);最后72°C保溫lOmin。對(duì)于-337A等位基因，Bi-PASA PCR會(huì)產(chǎn)生大小為226和559bp的2個(gè)片段，而對(duì)于-337C等位基因則會(huì)產(chǎn)生大小分別為384和559bp的2個(gè)片段。取PCR產(chǎn)物5 μ L，加溴酚藍(lán)上樣緩沖液I μ L，以120V電壓在2%瓊脂糖凝膠中電泳30min。用O. 5 μ g/mL溴化乙錠染色后在紫外燈下觀察帶型，發(fā)現(xiàn)3種基因型，-337A/A，-337A/C和-337C/C(參見(jiàn)圖3)。統(tǒng)計(jì)抗熱群體和感病群體中位點(diǎn)-375和-337的不同基因型個(gè)體出現(xiàn)的頻率(參見(jiàn)表I和圖4)，利用SPSS11. 5軟件進(jìn)行Chi-square Test分析后發(fā)現(xiàn)，_375不同基因型個(gè)體在抗熱群體和熱敏感群體中出現(xiàn)的頻率無(wú)顯著差異，而-337C/C個(gè)體在敏感群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于抗熱群體，-337A/A個(gè)體在抗熱群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于敏感群體(參見(jiàn)表I和圖4)。因此，-337C/C為熱敏感相關(guān)的金屬硫蛋白基因標(biāo)記，而-337A/A為是抗熱相關(guān)的金屬硫蛋白基因標(biāo)記。表I :海灣扇貝金屬硫蛋白不同基因型在抗熱群體和熱敏感群體中分布頻率的卡方檢驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記，其特征在于海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記為序列表SEQ ID No. I堿基序列所示，起始密碼子上游第337個(gè)堿基A為抗熱基因位點(diǎn)。
2.按權(quán)利要求I所述海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記，其特征在于海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的獲得，按如下步驟獲得 1)海灣扇貝金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)部分序列的克??；以海灣扇貝閉殼肌的總DNA為模板，根據(jù)已知的金屬硫蛋白基因序列在啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)引物AiMTIpF和AiMTIpR擴(kuò)增得到 DNA 序列，待用；AiMTlpF 5 ' -atgtaagggcacttatgcttgatctttagt-3 '和 AiMTlpR5' -agcagtcaggaccagcacagcca-3'； 2)抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的篩選；對(duì)來(lái)自抗熱群體和熱敏感群體的各6個(gè)個(gè)體的12個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，其多態(tài)性位點(diǎn)為-488C/T，-450A/C, -447G/C，-440Ains-del, -431T/C, -430G/A, -428A/T, -375T/C, -363T/G, -337A/C, -311T/A, -3IOA/T，-298G/T，-265A/G，-253A/G，-251T/C 和-118C/T ;再提取 50 個(gè)熱敏感個(gè)體和 50 個(gè)抗熱 個(gè)體的基因組DNA后，針對(duì)-375T/C位點(diǎn)多態(tài)，首先PCR擴(kuò)增金屬硫蛋白啟動(dòng)子區(qū)序列，然后選用Mse I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，得-375T/T，-375T/C和-375C/C 3種基因型，以-337A/C位點(diǎn)多態(tài)，利用Bi-PASA PCR進(jìn)行分析，瓊脂糖凝膠電泳后，得-337A/A，-337A/C 和-337C/C 3 種基因型，經(jīng) Chi-square Test 分析，-337A/A 個(gè)體在抗熱群體中出現(xiàn)的頻率顯著高于敏感群體，即-337A/A為抗熱相關(guān)的金屬硫蛋白基因標(biāo)記。
3.—種海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記輔助育種方法，其特征在于以在抗熱群體中高頻出現(xiàn)的金屬硫蛋白基因型作為抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記，將攜帶這種抗熱相關(guān)基因標(biāo)記的海灣扇貝進(jìn)行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)序列，研究其多態(tài)性；同時(shí)進(jìn)行熱脅迫處理實(shí)驗(yàn)，研究抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記的遺傳規(guī)律及其與海灣扇貝耐熱能力的關(guān)系，從中篩選出既帶有抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記，耐熱能力又顯著提高的貝苗進(jìn)行多代繁殖和培育后即可建立抗熱新品種。
全文摘要
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記及其輔助育種方法。海灣扇貝抗熱相關(guān)金屬硫蛋白基因標(biāo)記為序列表SEQ ID No.1堿基序列所示，起始密碼子上游第337個(gè)堿基A為抗熱基因位點(diǎn)。本發(fā)明首次篩選了海灣扇貝金屬硫蛋白基因的多態(tài)性位點(diǎn)并發(fā)掘了抗熱相關(guān)的金屬硫蛋白基因標(biāo)記，建立了抗熱基因標(biāo)記輔助育種方法。本發(fā)明具有針對(duì)性強(qiáng)、選育效率高、操作簡(jiǎn)便快捷等特點(diǎn)，適用于貝類抗熱相關(guān)標(biāo)記的篩選和抗熱優(yōu)良品種的選育。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102634514SQ201210039739
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者周智, 宋林生, 楊傳燕, 王玲玲, 邱麗梅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所