專利名稱：一種提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞工程和組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞工程和組織工程領(lǐng)域中，需要使用一定數(shù)量的種子細(xì)胞-體細(xì)胞，并且要求體細(xì)胞有一定的增殖活性，這兩者對生物工程領(lǐng)域中恢復(fù)和重建組織和器官的結(jié)構(gòu)和功能有著至關(guān)重要的影響。但由于體細(xì)胞體外增殖能力有限，少量的體細(xì)胞不能通過增殖獲取足量的體細(xì)胞，而且體細(xì)胞在體外長時間培養(yǎng)后，隨著分裂次數(shù)的增加，增殖能力逐漸下降，細(xì)胞的增殖活性下降，嚴(yán)重影響了細(xì)胞工程和組織工程體外構(gòu)建的成功。由于體細(xì)胞增殖能力受到自身和環(huán)境等許多因素的影響，通過調(diào)節(jié)這些相關(guān)因素，可以提高體細(xì)胞的增殖活性，并在短時間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的體細(xì)胞。
目前許多研究表明，使用增殖活性強(qiáng)的細(xì)胞與增殖活性弱的細(xì)胞共同培養(yǎng)，能有效促進(jìn)增殖能力弱的細(xì)胞的增殖性能。干細(xì)胞是一種增殖能力極強(qiáng)的細(xì)胞，具有很強(qiáng)的細(xì)胞增殖、自我更新的特性，它能提供干細(xì)胞微環(huán)境，分泌可溶性蛋白，細(xì)胞表面分子，以及細(xì)胞外基質(zhì)等營養(yǎng)和支持細(xì)胞，提高體細(xì)胞增殖能力。將干細(xì)胞與體細(xì)胞共同培養(yǎng)，能提供有利于細(xì)胞增殖的體外微環(huán)境，通過直接和間接兩方面的作用提高體細(xì)胞的增殖活性。首先干細(xì)胞通過與體細(xì)胞直接接觸，直接促進(jìn)體細(xì)胞的增殖；其次干細(xì)胞通過旁分泌作用分泌各種有利于細(xì)胞生長的因子，包括腦源性神經(jīng)生長因子(⑶NF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子(⑶NF)、肝細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β 1、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和肝細(xì)胞生長因子等提高體細(xì)胞的增殖活性。通過以上兩點，體細(xì)胞與干細(xì)胞混合共培養(yǎng)最終能在提高體細(xì)胞增殖活力的同時，快速獲得滿足需要量的體細(xì)胞。但該方法具有以下缺陷1.移植細(xì)胞中存在的未分化的胚胎干細(xì)胞會在被移植體內(nèi)形成腫瘤。由于干細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力，并能多向分化為不同的細(xì)胞，移植后可以形成多種腫瘤，主要包括畸胎癌和畸胎瘤。2.干細(xì)胞在體外細(xì)胞培養(yǎng)中容易出現(xiàn)分化，可以轉(zhuǎn)化為不需要的其他各個胚層的細(xì)胞，成為混雜細(xì)胞，無法去除。所以當(dāng)我們獲得了需要的足夠量的高活性體細(xì)胞后，如何去除不再需要的干細(xì)胞，僅得到單純的體細(xì)胞，是目前尚待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在既能在保留體細(xì)胞的原有特性的同時提高體細(xì)胞增殖活性，又能避免干細(xì)胞的影響，僅獲得單純的體細(xì)胞的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟
a、將自殺基因轉(zhuǎn)染入干細(xì)胞中；
b、將體細(xì)胞與已經(jīng)轉(zhuǎn)染了自殺基因的干細(xì)胞共培養(yǎng)；
C、體細(xì)胞完成增殖目的后，啟動干細(xì)胞中的自殺基因，去除干細(xì)胞。
在體細(xì)胞與已經(jīng)轉(zhuǎn)染了自殺基因的干細(xì)胞共培養(yǎng)過程中，當(dāng)干細(xì)胞分化后或不再具有促進(jìn)體細(xì)胞增殖的作用時，可以通過特定的藥物前體啟動自殺基因去除干細(xì)胞，再次添加新鮮的已經(jīng)轉(zhuǎn)染了自殺基因的干細(xì)胞，新鮮的已經(jīng)轉(zhuǎn)染了自殺基因的干細(xì)胞可以繼續(xù)提高體細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)體細(xì)胞的快速增殖，如此可重復(fù)若干次，直至達(dá)到所需要的體細(xì)胞的量，并提高體細(xì)胞的增殖活性。
所述的自殺基因是指某些能表達(dá)特定的酶類的基因，這些酶類能將某些無毒或者低毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，從而導(dǎo)致攜帶該基因的細(xì)胞凋亡。所述的自殺基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脫氨酶(Cytosine deaminase，CD)基因、Ε· coli-gpt、細(xì)胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450 reductase)基因、硝基還原酶(Nitroreductase)基因、羧肽酶(Carboxyp印tidase G2)基因、e.coli-DeoD 基因(表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和FAS基因等自殺基因中的一種或一種以上。
所述的轉(zhuǎn)染方法包括病毒或非病毒的轉(zhuǎn)染方法，其中所述的病毒轉(zhuǎn)染方法包括利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，單純皰疹病毒載體，EB病毒載體，細(xì)小病毒載體，痘病毒載體等載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法中一種或一種以上；所述的非病毒轉(zhuǎn)染方法包括化學(xué)和物理的方法，包括陽離子聚合物，磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，人工脂質(zhì)體法，DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，直接注射法，電穿孔法，激光輻射法，磁性微粒法和基因槍等轉(zhuǎn)染方法中的一種或一種以上。
所述的干細(xì)胞可以為胚胎干細(xì)胞，成體干細(xì)胞或其他任何干細(xì)胞中的一種或一種以上?？梢允褂枚喾N干細(xì)胞，利用不同干細(xì)胞對體細(xì)胞的不同支持、營養(yǎng)作用，從而促進(jìn)體細(xì)胞的增殖。
所述的體細(xì)胞包括組織器官中各種胚層細(xì)胞，具體可為皮膚、心血管、膀胱、韌帶、 骨、神經(jīng)、肝、腸道、血液、角膜、結(jié)膜或鞏膜細(xì)胞的任何一種或一種以上。
所述的共培養(yǎng)是指將體細(xì)胞與干細(xì)胞混合接觸培養(yǎng)。
所述的啟動自殺基因方法為使用能與細(xì)胞中攜帶的自殺基因編碼的特異性酶類起作用的低毒或無毒的藥物前體而導(dǎo)致攜帶該基因的干細(xì)胞凋亡的方法。所述的藥物前體包括無環(huán)鳥苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韋(ganciclovir，GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巰基黃嘌呤、環(huán)磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IF0、CB1954, MeP_dR、 F-araA、CMDA、6-Thiopurines、ara-C、dFdC、異環(huán)磷酰胺和 MTX-α -ρ印tides 中的一種或一種以上。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)轉(zhuǎn)染的自殺基因來選擇其相對應(yīng)的藥物前體，再與自殺基因編碼的特異性酶類其作用，從而引起攜帶該基因的干細(xì)胞凋亡。根據(jù)自殺基因選擇藥物前體的知識屬于本領(lǐng)域的常規(guī)知識?？梢酝ㄟ^使用一種或者多種自殺基因，分別使用一種或者多種不同的藥物前體來啟動各自相應(yīng)的自殺基因的方法，或者啟動自殺基因時，藥物前體使用不同的濃度或者不同的使用次數(shù)的方法，達(dá)到調(diào)整干細(xì)胞凋亡的時間、速度和數(shù)量的目的，最終通過調(diào)節(jié)這些參數(shù)來靈活控制干細(xì)胞的生長和凋亡數(shù)量，影響體細(xì)胞的增殖，以適應(yīng)不同的細(xì)胞工程或組織工程的需求。
本發(fā)明將攜帶有自殺基因的干細(xì)胞與體細(xì)胞混合共同培養(yǎng)，干細(xì)胞的存在提高了體細(xì)胞的增殖活性，從而使少量的體細(xì)胞能在短時間內(nèi)快速生長，獲得足夠數(shù)量的體細(xì)胞， 當(dāng)體細(xì)胞的數(shù)量足夠時，啟動干細(xì)胞攜帶的自殺基因，誘導(dǎo)干細(xì)胞凋亡，從而避免現(xiàn)有技術(shù)中干細(xì)胞與體細(xì)胞共培養(yǎng)時，由于干細(xì)胞的高增殖能力，并能多向分化為不同的細(xì)胞，移植后可以形成多種腫瘤的缺點和干細(xì)胞在體外細(xì)胞培養(yǎng)中容易出現(xiàn)分化，可以轉(zhuǎn)化為不需要的其他各個胚層的細(xì)胞，成為混雜細(xì)胞，無法去除的缺點，最終得到單純的，具有高增殖活性的體細(xì)胞，并且移植后無成瘤性，或者移植后可以有效去除。這不僅是細(xì)胞工程和組織工程的重大突破，而且也為下一代臨床應(yīng)用開拓了新的途徑。本發(fā)明可以使用一種或者多種干細(xì)胞，一次或者多次添加干細(xì)胞，一次或者多次啟動自殺基因，并可以通過隨時靈活調(diào)整這些參數(shù)，調(diào)整獲得需要數(shù)量的體細(xì)胞的時間和增殖活性以滿足不同需求。本發(fā)明原理可靠，步驟簡便，結(jié)果穩(wěn)定，極易應(yīng)用于各種生物工程領(lǐng)域的實驗研究和臨床治療。
具體實施例方式
以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
本發(fā)明的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法的具體步驟為
a.將干細(xì)胞轉(zhuǎn)染入自殺基因采用病毒轉(zhuǎn)染或非病毒轉(zhuǎn)染的方法，將胸苷激酶 (Thymidine kinase,TK)基因、胞嘧啶脫氨酶(Cytosine deaminase,CD)基因、Ε· coli-gpt、 細(xì)胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450 reductase)基因、硝基還原酶 (Nitroreductase)基因、羧肽酶(Carboxyp印tidase G2)基因、E. coli-DeoD 基因(表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和FAS基因等自殺基因中的任何一種或一種以上導(dǎo)入干細(xì)胞中。
b.使用的干細(xì)胞可以為胚胎干細(xì)胞或者成體干細(xì)胞的一種或者一種以上。
c.使用的體細(xì)胞可以為各種胚層來源的細(xì)胞。包括皮膚、心血管、膀胱、韌帶、骨、 肝、腸道、血液、神經(jīng)、角膜、結(jié)膜或鞏膜細(xì)胞中的任何一種或一種以上。
d.將導(dǎo)入了自殺基因的干細(xì)胞與體細(xì)胞行直接混合接觸共培養(yǎng)。
e.體細(xì)胞的增殖活性升高，并快速獲得足夠的細(xì)胞量。
f.使用特異性的藥物前體，能和自殺基因表達(dá)的特異性酶類起反應(yīng)，將無毒性的特定藥物前體成分代謝為細(xì)胞毒性產(chǎn)物，最終導(dǎo)致干細(xì)胞凋亡。這種藥物前體包括無環(huán)鳥苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韋(ganciclovir，GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巰基黃嘌呤、環(huán)磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IF0、CB1954、MeP-dR、F_araA、CMDA, 6-Thiopurines、ara_C、dFdC、異環(huán)磷酰胺和MTX- α -peptides等所有可以與相應(yīng)自殺基因編碼的特異性酶類起作用，從而導(dǎo)致攜帶該基因的干細(xì)胞凋亡的藥物前體的一種或一種以上。
g.使用特異性藥物前體的次數(shù)可以為一次或一次以上，濃度可以為高濃度也可以為低濃度，目的都是在去除干細(xì)胞成分，保留單純的體細(xì)胞的同時，提高體細(xì)胞的增殖活性，并快速獲得需要的細(xì)胞量。
h.所述的基因轉(zhuǎn)染方法包括病毒和非病毒的轉(zhuǎn)染方法的一種或一種以上。
i.其中所述的病毒轉(zhuǎn)染方法包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，單純皰疹病毒載體，EB病毒載體，細(xì)小病毒載體，痘病毒載體等載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法中的一種或一種以上， 所述的非病毒轉(zhuǎn)染方法包括化學(xué)和物理的方法，包括陽離子聚合物，磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法， 人工脂質(zhì)體法，DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，直接注射法，電穿孔法，激光輻射法，磁性微粒法和基因槍等轉(zhuǎn)染方法中的一種或一種以上。
實施例1
本實施例的目的是短時間內(nèi)獲得足夠量的高活性角膜上皮細(xì)胞注本實施例所用的自殺基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脫氨酶(Cytosine deaminase, CD)基因、Ε·coli—gpt、細(xì)胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、石肖基還原 Bl (Nitroreductase)基因、幾月太Bl (Carboxypeptidase G2)基因、e. coli-DeoD基因(表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和 FAS基因等任何一種自殺基因的一種或一種以上，干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞的一種或一種以上，轉(zhuǎn)染辦法包括病毒和非病毒的轉(zhuǎn)染方法的一種或一種以上，啟動自殺基因的時間為一次或一次以上，啟動自殺基因的藥物為無環(huán)鳥苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韋 (ganciclovir, GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巰基黃嘌呤、環(huán)磷酰胺、6-甲基嘌呤_2_脫氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IF0、CB1954、MeP-dR、F-araA、CMDA、6_Thiopurines、ara_C、dFdC、異環(huán)磷酰胺和MTX-α -ρ印tides等所有可以與相應(yīng)自殺基因編碼的特異性酶類起作用，從而導(dǎo)致攜帶該基因的干細(xì)胞凋亡的藥物前體的一種或一種以上。其效果和以下相同。
1.將小鼠胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染自殺基因采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中。
2.將兔角膜上皮細(xì)胞與帶有自殺基因的小鼠胚胎干細(xì)胞行直接混合接觸共培養(yǎng)， 培養(yǎng)液為小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.體外培養(yǎng)獲得需要的兔角膜上皮細(xì)胞細(xì)胞量的增殖時間從14天縮短到5天，并且結(jié)果顯示，兔角膜上皮細(xì)胞的增殖活性提高。其中代表兔角膜上皮增殖功能的角膜上皮細(xì)胞克隆形成率由9. 95%從提高到了 34.2%，流式細(xì)胞儀檢測代表兔角膜上皮細(xì)胞低分化標(biāo)志的P63從12%提高到了 72%左右，Κ 67從增長到60%，細(xì)胞進(jìn)入S/&期的量從14%增加到32%。
4. 一次性添加使用針對TK自殺基因編碼的特異性酶類起作用的特定的藥物前體更昔洛韋20ymol/L到培養(yǎng)液中。更昔洛韋與自殺基因表達(dá)的特異性酶類起反應(yīng)，將無毒性的更昔洛韋代謝為三磷酸化產(chǎn)物GCT-TP，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，3天后小鼠胚胎干細(xì)胞全部凋亡。
5.經(jīng)檢測，培養(yǎng)皿中僅保留兔角膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞量不減少，細(xì)胞增殖活性高，處于DNA合成期的細(xì)胞不變，免疫組化實驗顯示細(xì)胞表達(dá)的低分化標(biāo)志p63不減少，克隆形成率實驗證實細(xì)胞的增殖能力不影響。
實施例2
本實施例的目的是短時間內(nèi)獲得足夠量的高活性人皮膚表皮細(xì)胞注本實施例所用的自殺基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脫氨酶(Cytosine deaminase, CD)基因、Ε·coli—gpt、細(xì)胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、石肖基還原Bl (Nitroreductase)基因、幾月太Bl (Carboxypeptidase G2)基因、e. coli-DeoD基因(表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和 FAS基因等任何一種自殺基因的一種或一種以上，干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞的一種或一種以上，轉(zhuǎn)染辦法包括病毒和非病毒的轉(zhuǎn)染方法的一種或一種以上，啟動自殺基因的時間為一次或一次以上，啟動自殺基因的藥物為無環(huán)鳥苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韋 (ganciclovir, GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巰基黃嘌呤、環(huán)磷酰胺、6-甲基嘌呤_2_脫氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IFO、CB1954、MeP-dR、F-araA、CMDA、6_Thiopurines、ara_C、dFdC、異環(huán)磷酰胺和MTX- α -peptides等所有可以與相應(yīng)自殺基因編碼的特異性酶類起作用，從而導(dǎo)致攜帶該基因的細(xì)胞凋亡的藥物前體的一種或一種以上。其效果和以下相同。
1.將人臍帶血干細(xì)胞轉(zhuǎn)染自殺基因采用腺病毒載體轉(zhuǎn)染的方法，將胞嘧啶脫氨酶(Cytosine deaminase,⑶)基因，導(dǎo)入人臍帶血干細(xì)胞中；將人胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染自殺基因使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)導(dǎo)入人胚胎干細(xì)胞中。
2.將帶有自殺基因的人臍帶血干細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞與人皮膚表皮細(xì)胞直接混合接觸共培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.體外培養(yǎng)獲得第一個需要的人皮膚表皮細(xì)胞細(xì)胞量的增殖時間從11天縮短到 4天，并且結(jié)果顯示，人皮膚表皮細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，代表皮膚干細(xì)胞的(^/G1期細(xì)胞比例從 36%提高到55%，克隆形成率由11. 2%提高到23. 6%，流式細(xì)胞儀檢測顯示細(xì)胞表達(dá)的低分化標(biāo)志K19從21%提高到32%。
4.添加藥物前體5-氟胞嘧啶，該藥物前體能與該人臍帶血干細(xì)胞中的CD自殺基因表達(dá)的特異性酶類起反應(yīng)，將無毒性的5-氟胞嘧啶代謝為5-氟尿嘧啶，產(chǎn)生細(xì)胞毒性， 最終導(dǎo)致人臍血干細(xì)胞1天后全部凋亡。
5.體外培養(yǎng)獲得第二個需要的人皮膚表皮細(xì)胞細(xì)胞量的增殖時間從3天縮短到 2天，并且結(jié)果顯示，人皮膚表皮細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，代表皮膚干細(xì)胞的(^/G1期細(xì)胞比例從 55%提高到85%，克隆形成率由23. 6%提高到36. 9%，流式細(xì)胞儀檢測顯示細(xì)胞表達(dá)的低分化標(biāo)志K19從32%提高到41 %。
6. 一次性添加使用針對TK自殺基因編碼的特異性酶類起作用的特定的藥物前體更昔洛韋20ymol/L到培養(yǎng)液中。更昔洛韋與自殺基因表達(dá)的特異性酶類起反應(yīng)，將無毒性的更昔洛韋代謝為三磷酸化產(chǎn)物GCT-TP，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，3天后胚胎干細(xì)胞全部凋亡。
7.經(jīng)檢測，培養(yǎng)皿中僅保留人皮膚表皮細(xì)胞，不影響其增殖活性，代表皮膚干細(xì)胞的(^/G1期細(xì)胞比例不變，流式細(xì)胞儀檢測顯示細(xì)胞表達(dá)的低分化標(biāo)志K19比例不減少克隆形成率實驗證實細(xì)胞的增殖能力不影響。
實施例3
本實施例的目的是短時間內(nèi)獲得足夠量的高活性貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞。注本實施例所用的自殺基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脫氨酶(Cytosine deaminase, CD)基因、Ε· coli—gpt、細(xì)胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、石肖基還原Bl (Nitroreductase)基因、幾月太Bl (Carboxypeptidase G2)基因、e. coli-DeoD基因(表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和 FAS基因等任何一種自殺基因的一種或一種以上，干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞的一種或一種以上，轉(zhuǎn)染辦法包括病毒和非病毒的轉(zhuǎn)染方法的一種或一種以上，啟動自殺基因的時間為一次或一次以上，啟動自殺基因的藥物為無環(huán)鳥苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韋 (ganciclovir, GCv), 5-氟胞嘧啶、6-巰基黃嘌呤、環(huán)磷酰胺、6-甲基嘌呤_2_脫氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IFO、CB1954、MeP-dR、F-araA, CMDA、6_Thiopurines、ara_C、dFdC、異環(huán)磷酰胺和MTX- α -peptides等所有可以與相應(yīng)自殺基因編碼的特異性酶類起作用，從而導(dǎo)致攜帶該基因的細(xì)胞凋亡的藥物前體的一種或一種以上。其效果和以下相同。
1.將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染入自殺基因采用磷酸鈣共沉淀的方法，將細(xì)胞色素P4502B1基因?qū)肴斯撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞中。
2.將貓的角膜內(nèi)皮細(xì)胞與帶有自殺基因的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接混合接觸共培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.體外培養(yǎng)獲得需要的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞量的增殖時間從21天縮短到12天，并且結(jié)果顯示，貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，流式細(xì)胞儀檢測代表細(xì)胞增殖性的Ki67陽性細(xì)胞從3. 2%增殖到9. 4%，克隆形成率由1. 3%提高到2. 2%，細(xì)胞進(jìn)入S/&期的細(xì)胞由 16. 4%±曾力口至Ij 30. 9%。
4. 一次性添加藥物前體環(huán)磷酰胺，與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的自殺基因表達(dá)的特異性酶類起反應(yīng)，將無毒性的環(huán)磷酰胺代謝為有細(xì)胞毒性的4-0HCPA，最終導(dǎo)致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2天后全部凋亡。
5.經(jīng)檢測，培養(yǎng)皿中僅保留貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞，不影響其增殖活性，處于DNA合成期和&期的細(xì)胞量不變，克隆形成率實驗證實細(xì)胞的增殖能力不影響。
實施例4:
本實施例的目的是短時間內(nèi)獲得足夠量的高活性兔結(jié)膜上皮細(xì)胞注本實施例所用的自殺基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脫氨酶(Cytosine deaminase, CD)基因、Ε·coli—gpt、細(xì)胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、石肖基還原Bl (Nitroreductase)基因、幾月太Bl (Carboxypeptidase G2)基因、E. coli-DeoD基因(表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和 FAS基因等任何一種自殺基因的一種或一種以上，干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞的一種或一種以上，轉(zhuǎn)染辦法包括病毒和非病毒的轉(zhuǎn)染方法的一種或一種以上，啟動自殺基因的時間為一次或一次以上，啟動自殺基因的藥物為無環(huán)鳥苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韋 (ganciclovir, GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巰基黃嘌呤、環(huán)磷酰胺、6-甲基嘌呤_2_脫氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IF0、CB1954、MeP-dR、F-araA、CMDA、6_Thiopurines、ara_C、dFdC、異環(huán)磷酰胺和MTX-α -ρ印tides等所有可以與相應(yīng)自殺基因編碼的特異性酶類起作用，從而導(dǎo)致攜帶該基因的細(xì)胞凋亡的藥物前體的一種或一種以上。其效果和以下相同。
1.將人脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)染自殺基因采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)導(dǎo)入人脂肪干細(xì)胞中。
2.將兔結(jié)膜上皮細(xì)胞與帶有自殺基因的人脂肪干細(xì)胞直接混合接觸共培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為人脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.體外培養(yǎng)獲得需要的兔結(jié)膜上皮細(xì)胞量的增殖時間從16天縮短到8天，并且結(jié)果顯示，兔結(jié)膜上皮細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，代表細(xì)胞增殖性能的克隆形成率由14%提高到 22%，代表細(xì)胞增殖能力的MTT實驗BrdU吸光度由1. 45提高到3. 65。組織學(xué)顯示細(xì)胞規(guī)則排列，胞漿豐富。
4.分兩次培養(yǎng)添加藥物前體更昔洛韋。與干細(xì)胞中的TK自殺基因表達(dá)的特異性酶類起反應(yīng)，將更昔洛韋代謝為三磷酸化產(chǎn)物GCT-TP，產(chǎn)生細(xì)胞毒性產(chǎn)物，最終導(dǎo)致人脂肪干細(xì)胞3天后全部凋亡。
5.經(jīng)檢測，培養(yǎng)皿中僅保留兔結(jié)膜上皮細(xì)胞，不影響其增殖活性，代表細(xì)胞增殖能力的MTT實驗結(jié)果不變，克隆形成率實驗不變，證實兔結(jié)膜細(xì)胞的增殖能力，保持高增長活性。
權(quán)利要求
1.一種提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟a、將自殺基因轉(zhuǎn)染入干細(xì)胞中；b、將體細(xì)胞與已經(jīng)轉(zhuǎn)染了自殺基因的干細(xì)胞共培養(yǎng)；C、體細(xì)胞完成增殖目的后，啟動干細(xì)胞中的自殺基因，去除干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，在體細(xì)胞與已經(jīng)轉(zhuǎn)染了自殺基因的干細(xì)胞共培養(yǎng)過程中，當(dāng)干細(xì)胞分化后或不再具有促進(jìn)體細(xì)胞增殖的作用時，啟動自殺基因去除干細(xì)胞，再次添加新鮮的已經(jīng)轉(zhuǎn)染了自殺基因的干細(xì)胞，如此可重復(fù)若干次，直至體細(xì)胞完成增殖目的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的自殺基因為胸苷激酶基因、胞嘧啶脫氨酶基因、E. coli-gpt、細(xì)胞色素P450基因、硝基還原酶基因、羧肽酶基因、E. coli-DeoD基因、白喉毒素基因和FAS基因中的一種或一種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)染方法為病毒或非病毒的轉(zhuǎn)染方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的病毒轉(zhuǎn)染方法為利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，單純皰疹病毒載體，EB病毒載體，細(xì)小病毒載體和痘病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法中一種或一種以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的非病毒轉(zhuǎn)染方法為陽離子聚合物，磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，人工脂質(zhì)體法，DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，直接注射法，電穿孔法，激光輻射法，磁性微粒法和基因槍法中的一種或一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞，成體干細(xì)胞或其他任何干細(xì)胞中的一種或一種以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的體細(xì)胞為皮膚、心血管、膀胱、韌帶、骨、神經(jīng)、肝、腸道、血液、角膜、結(jié)膜和鞏膜細(xì)胞的任何一種或一種以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的共培養(yǎng)是指將體細(xì)胞與干細(xì)胞混合接觸培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述的啟動自殺基因是指利用低毒或無毒的藥物前體與干細(xì)胞中攜帶的自殺基因編碼的特異性酶類起作用而導(dǎo)致攜帶該基因的干細(xì)胞凋亡而去除干細(xì)胞，所述的藥物前體為無環(huán)鳥苷、更昔洛韋、5-氟胞嘧啶、6-巰基黃嘌呤、環(huán)磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷、 ara-M、BVDU、CPA、IF0、CB1954、MeP-dR、F-araA、CMDA、6-Thiopurines、ara-C、dFdC、異環(huán)磷酰胺和MTX-α -ρ印tides中的一種或一種以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高體細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞共培養(yǎng)方法。它是將自殺基因轉(zhuǎn)染入干細(xì)胞中；將體細(xì)胞與已經(jīng)轉(zhuǎn)染了自殺基因的干細(xì)胞共培養(yǎng)；體細(xì)胞完成增殖目的后，啟動干細(xì)胞中自殺基因，去除干細(xì)胞。本發(fā)明將攜帶有自殺基因的干細(xì)胞與體細(xì)胞共同培養(yǎng)，干細(xì)胞的存在提高了體細(xì)胞的增殖活性，使少量的體細(xì)胞能在短時間內(nèi)快速生長，獲得足夠數(shù)量的體細(xì)胞，當(dāng)體細(xì)胞的數(shù)量足夠時，啟動干細(xì)胞攜帶的自殺基因，誘導(dǎo)干細(xì)胞凋亡，得到單純的具有高增殖活性的體細(xì)胞，移植后無成瘤性，這不僅是細(xì)胞工程和組織工程的重大突破，而且也為下一代臨床應(yīng)用開拓了新的途徑。本發(fā)明原理可靠，步驟簡便，結(jié)果穩(wěn)定，極易應(yīng)用于各種生物工程領(lǐng)域的實驗研究和臨床治療。
文檔編號C12N5/07GK102559578SQ20121004113
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月22日
發(fā)明者周強(qiáng), 武征, 王智崇 申請人:中山大學(xué)中山眼科中心