專利名稱：一種阿爾茨海默病致病基因及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子病理學領(lǐng)域技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種阿爾茨海默病致病基因及其應用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD)是一種漸進性的神經(jīng)退行性疾病，已成為老年癡呆的主要病因。AD的臨床癥狀主要表現(xiàn)為進行性記憶力減退、認知功能下降和精神行為異常等，最終帶來極高的病死率和致殘率。AD病理特征為大腦皮層及海馬區(qū)的 β淀粉樣肽(β-amyloid peptide, Αβ )在胞外沉積并形成老年斑(senile plaque, SP)、 腦神經(jīng)細胞內(nèi)tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)、 神經(jīng)元突觸功能異常及錐體神經(jīng)細胞丟失。AD分可為家族性AD(familial Alzheimer’s disease,FAD)和散發(fā)性AD(sporadic Alzheimer’s disease, SAD),其中FAD發(fā)病年齡通常早于65歲?，F(xiàn)有究結(jié)果表明25-40% 的AD病例與遺傳因素有關(guān)，雙生子研究認為這一比例可高達80%。FAD呈常染色體顯性遺傳，約30-50%的致病突變來自三個基因位于21號染色體(21q. 21. I)的APP (amyloid precursor protein gene),位于 14 號染色體(14q24. 3)的 PSEN-1 (presenilin-1 gene), 和位于I號染色體(lq42. I)的PSEN-2 (presenilin-2 gene)。APP基因含有18個外顯子， 其中外顯子16、17編碼APP分解產(chǎn)物A β，而A β為老年斑的主要成分；PSEN_1含有3個非編碼外顯子(Εχ1Α，1Β，2)和10個編碼外顯子(Ex 3-12) ;PSEN_2含有3個非編碼外顯子 (Ex 1,2,3)和10個編碼外顯子(Ex 4-13)。APP基因由于基因轉(zhuǎn)錄后剪接方式的不同，所得的mRNA可翻譯生成數(shù)種亞型， 其中最主要的為 APP695(NM_201414)，APP751 (NM_201413), APP770 (NM_000484)。三者的區(qū)別在于APP751比APP695多出一段Kunitz蛋白酶抑制物同源序列(Kunitz protease inhibitor,KPI) ,APP770比APP695多出一段KPI序列和0X-2抗原序列，其中APP695在腦
組織中表達量最多。APP在胞內(nèi)可經(jīng)過兩條途徑水解，(I)不產(chǎn)生Αβ的途徑ΑΡΡ首先被α分泌酶(a-secretase)水解，產(chǎn)生胞外域sAPPa和一個IOkD的羧基端片段(C-terminal fragment)，即 CTFa 或 C83, C83 經(jīng) Y 分泌酶(Y -secretase)水解產(chǎn)生一個 3kD 的 P3 和 APP胞內(nèi)區(qū)(APP intracellular domain, AI CD)并很快被進一步降解；(2)產(chǎn)生Αβ的途徑ΑΡΡ 首先被 β 分泌酶(β -site of APP cleaving enzyme I, BACE I)水解，產(chǎn)生胞外域sAPPe和一個12kD的羧基端片段即CTFe或C99，C99在Y分泌酶作用下產(chǎn)生A β 40或 42和Al⑶(也稱CTFy)，其中A β 42容易聚集，是老年斑的主要病理成分。大多數(shù)FAD基因突變改變APP蛋白的加工過程，導致A β 42增加或A β 42/40相對水平增高。Goate等(1991)報道了第一個發(fā)生于FAD的APP突變。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)32種 APP基因突變(包括三體型)可導致FAD，所有已發(fā)現(xiàn)的APP基因點突變都位于其16和17號外顯子，如位于 16 號外顯子的 APP ΚΜ670/67INL (Swedish APP，g. [269498G > T ;269499A >C]) (Mullan M，1992)、APPAsp678Asn (Tottori APP，g. 269520G > A) (ffakutani Y，2004)，位于 17 號外顯子的 APP Thr714Ile (Austrian APP，g. 275333C > T) (De Jonghe C，2000)、APP Leu723Pro(Australian APP, g. 275360T > C)(Kwok JB,1998)和 APP Lys724Asn(Belgian APP，g. 275364G > C) (Theuns J，2006)等。所有已知的APP基因突變體數(shù)據(jù)可參閱網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫 www. mo I gen. ua. ac. be/ADMutations。盡管FAD只占AD總量約5 %，但鑒定AD基因致病突變對于家族性AD患者親屬的早期臨床診斷、深入了解AD生物學和發(fā)病機理、建立細胞和動物疾病模型、提供藥物治療靶點和藥物開發(fā)平臺都具有重要意義和價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種阿爾茨海默病致病基因及其編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的還在于提供包含上述阿爾茨海默病致病基因的重組載體和細胞。本發(fā)明的目的還在于提供一種阿爾茨海默病致病基因的外顯子及包含該外顯子的重組載體及細胞。本發(fā)明的目的還在于提供上述阿爾茨海默病致病基因的外顯子在制備診斷阿爾茨海默病的藥物及制備細胞或動物疾病模型中的應用。一種阿爾茨海默病致病基因，其cDNA核酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。一種阿爾茨海默病致病基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N02 所示。一種重組載體，所述重組載體包含阿爾茨海默病致病基因。上述重組載體的原始載體為真核表達載體pcDNA3. I,或者腺病毒骨架質(zhì)粒 AdEasy-I和穿梭質(zhì)粒載體pShuttleCMV。一種重組細胞，包含上述含阿爾茨海默病致病基因的重組載體。上述重組細胞的原始細胞為腺病毒包裝細胞HEK293。一種阿爾茨海默病致病基因的外顯子，其核酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。一種重組載體，包含阿爾茨海默病致病基因的外顯子。一種重組細胞，包含上述含阿爾茨海默病致病基因的外顯子的重組載體。上述阿爾茨海默病致病基因的外顯子在制備診斷阿爾茨海默病的藥物及制備細胞或動物疾病模型中的應用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的阿爾茨海默病致病基因，對該基因突變的檢測可能用于輔助AD患者的基因診斷，利于明確AD患者的分子診斷及分子分型。本發(fā)明可以對AD的發(fā)病機理提供重要線索，對AD的診斷治療具有十分重要的意義。本發(fā)明所述重組真核表達質(zhì)粒載體和腺病毒載體，可用于在多種宿主細胞中高效表達所述阿爾茨海默病致病基因突變體，建立細胞和動物模型，研究AD致病基因突變的細胞及分子機制或用于篩選抗AD藥物。


圖I T017患者家系APP基因17號外顯子測序結(jié)果圖；圖中，①②T017測序結(jié)果；③④Τ018測序結(jié)果；⑤⑥Τ019測序結(jié)果；⑦⑧T020測序結(jié)果。圖2 TO17患者家系圖；圖中，II.I. T018，正常；II. 2. T019，AD，帶有 APP K724M 突變；II. 3. T017，先證者， 帶有APP K724M突變；III. 1.T020，尚未到發(fā)病年齡，帶有APP K724M突變。圖3 Megaprimer-PCR法第一次PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；圖中，M DNA Marker DL2000 ； I :Megaprimer-PCR 法第一次 PCR 產(chǎn)物。圖4 Megaprimer-PCR法第二次PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；圖中，M DNA Marker DL2000 ；I :Megaprimer_PCR 法第二次 PCR 產(chǎn)物。圖5重組腺病毒質(zhì)粒pAd_APP695K724M的Pac I酶切鑒定圖；圖中，M DNA Marker DL15000 ；1 :pAPP695K724M。圖6正常HEK293細胞及HEK293細胞包裝腺病毒后病變結(jié)果圖；圖中，a :正常HEK293細胞；b HEK293細胞包裝腺病毒后病變圖。圖7 腺病毒 Ad_APP695K724M 的 Western Blot 鑒定圖；圖中，I HEK293細胞裂解物上清；2 HEK293感染了 Ad_APP695K724M的細胞裂解物上清；較大分子量條帶為APP，下面條帶為GAPDH。圖8多克隆細胞株的建立；圖中，左為G418處理8天后的多克隆細胞株；中為G418處理12天后的多克隆細胞株；右為G418處理15天后的多克隆細胞株。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件 (例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社) 或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例I阿爾茨海默病致病基因與AD發(fā)病關(guān)系的驗證發(fā)明人采集到AD、FTD病人及親屬樣本，詳見表I。表I AD樣本收集情況
權(quán)利要求
1.一種阿爾茨海默病致病基因，其特征在于，其CDNA核酸序列如序列表中SEQ ID NO: I所示。
2.一種阿爾茨海默病致病基因編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2 所示。
3.—種重組載體，其特征在于，所述重組載體包含權(quán)利要求I所述的阿爾茨海默病致病基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述重組載體，其特征在于，所述重組載體的原始載體為真核表達載體pcDNA3. 1，或者腺病毒骨架質(zhì)粒AdEasy-I和穿梭質(zhì)粒載體pShuttleCMV。
5.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞包含權(quán)利要求3所述的重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞的原始細胞為腺病毒包裝細胞HEK293。
7.—種阿爾茨海默病致病基因的外顯子，其特征在于，其核酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。
8.—種重組載體，其特征在于，所述重組載體包含權(quán)利要求7所述的阿爾茨海默病致病基因的外顯子。
9.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞包含權(quán)利要求8所述的重組載體。
10.權(quán)利要求7所述阿爾茨海默病致病基因的外顯子在制備診斷阿爾茨海默病的藥物及制備細胞或動物疾病模型中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于分子病理學領(lǐng)域技術(shù)領(lǐng)域的一種阿爾茨海默病致病基因及其應用，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明還涉及含有所述阿爾茨海默病致病基因的重組載體、含有該重組載體的重組細胞、阿爾茨海默病致病基因的編碼蛋白以及阿爾茨海默病致病基因的外顯子。本發(fā)明所述阿爾茨海默病致病基因的外顯子，對該基因的檢測可能用于AD患者的基因分子診斷，或利于明確AD患者親屬的發(fā)病風險預測。本發(fā)明可以對AD的發(fā)病機理提供重要線索，含有所述阿爾茨海默病致病基因的外顯子載體可用于制備AD細胞或動物模型。
文檔編號C12N5/10GK102604959SQ201210041609
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者何金生, 周淑杰, 張瑩, 彭向雷, 管小亭, 鄭妍鵬 申請人:北京交通大學