專利名稱：一種抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(現(xiàn)名豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病)是1997年由加拿大學(xué)者首先報道的一種新病，是目前在世界范圍內(nèi)廣泛流行、對養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成巨大威脅的一種免疫抑制性病毒傳染病。PCV2型病毒(Porcine Circovirus Type 2,即豬圓環(huán)病毒2型)在豬場引起的極為普遍感染是我國豬場疫病復(fù)雜的重要原因，可以說它對養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)正常維持帶來了極大的困難，其對我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的影響目前受到了僅次于高致病性藍(lán)耳病的空前關(guān)注。為此，PCV2型病毒感染是我國養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)、與豬相關(guān)的生命科學(xué)研究與產(chǎn)品開發(fā)亟待解決 的重大問題，具有時間的緊迫性。雖然病毒學(xué)家和動物傳染病學(xué)家付出了艱辛的努力，一直在尋求免疫控制PCV2型病毒技術(shù)上的突破，面對豬群如此普遍的感染以及PCV2型病毒獨(dú)特的生物學(xué)特性，目前在該病的防治領(lǐng)域，從技術(shù)上取得的效果上收效甚微。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，為其提供了新的曙光。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，來控制豬圓環(huán)病毒2型病感染和減少其危害。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)步驟如下
步驟(I).設(shè)計(jì)能有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA。1-1.根據(jù)PCV2型病毒的基因組序列，以R印基因和Cap基因?yàn)槟康幕颍诿總€目的基因內(nèi)選取一段19bp長的核酸序列；該核酸序列不在5’和3’非翻譯區(qū)，且起始密碼子后75bp ;將選取的19bp核酸序列，與豬的基因組進(jìn)行比對，確定該19bp核酸序列是特異性的，只針對目的基因，與其他基因沒有相似性；根據(jù)以上原則設(shè)計(jì)針對Rep基因的靶向基因shRNA 139對，針對Cap基因的靶向基因shRNA 134對。1-2.體外靶向基因shRNA活性檢測；將合成的針對Rep基因和針對Cap基因的靶向基因shRNA序列經(jīng)退火反應(yīng)形成具有粘性末端的雙鏈，且直接連接到線性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體上,構(gòu)建成RNA干擾載體；將上述RNA干擾載體中的DNA,在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000 (Lipofectamine 2000, Invitrogen)介導(dǎo)下導(dǎo)入PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后對經(jīng)轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察，對成功轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞接種PCV2型病毒，接毒48 72小時后將上清懸液和PK15細(xì)胞分開收集，通過免疫熒光的方法分別測上清懸液和PK15細(xì)胞中的病毒TCID5tl,以病毒TCID5tl值判斷靶向基因shRNA活性及對PCV2型病毒的抑制作用，病毒TCID5tl值越大，靶向基因shRNA活性弱，對PCV2型病毒的抑制作用越小。
所述的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 載體購置于 Clonetech 公司。步驟(2).獲得能有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病感染的胚胎成纖維細(xì)胞克隆。2-1.構(gòu)建抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因載體。經(jīng)步驟1-2篩選出有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病感染的靶向基因shRNA,構(gòu)建抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因載體pGK-zsGFP-shRNA和 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA (構(gòu)建方法見專利號ZL200910152602. 8，發(fā)明名稱用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的PiggyBac轉(zhuǎn)座載體及其構(gòu)建方法)。2-2.克隆胚胎成纖維細(xì)胞。將步驟2-1構(gòu)建的抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因載體 pGK-zsGFP-shRNA 和 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0_shRNA 分別用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細(xì)胞；轉(zhuǎn)染24小時后,豬胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后用有限稀釋法克隆。在熒光顯微鏡下觀察這些經(jīng)克隆的豬胚胎成纖維細(xì)胞GFP的表達(dá)情況，選取含GFP的豬胚胎成纖維細(xì)胞。步驟(3)借助核移植、胚胎移植技術(shù)和常規(guī)育種技術(shù)培育抗圓環(huán)病毒2型轉(zhuǎn)基因豬。3-1.豬卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)。將豬的卵巢用39°C含雙抗的磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗滌多次，然后將卵巢放置于39°C水浴鍋中，用帶有18號針頭的20ml注射器抽吸卵巢上2 6mm的卵泡，將抽取的卵泡液注入無菌撿卵杯中，用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(PVA-TL-HEPES)緩沖液洗滌兩次。在實(shí)體顯微鏡下用撿卵針挑選出細(xì)胞質(zhì)均勻，并包裹有兩層以上致密卵丘細(xì)胞的卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體，并將它放在卵母細(xì)胞成熟液中，在5%C02 ’ 39°C下培養(yǎng)42 44小時，然后加入透明質(zhì)酸酶，漩渦振蕩I分鐘。3-2.制備供體細(xì)胞。將步驟2-2構(gòu)建的表達(dá)GFP的豬胚胎成纖維細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速進(jìn)行復(fù)蘇。復(fù)蘇后，豬胚胎成纖維細(xì)胞長至80 90%的匯合狀態(tài)時，加入從培養(yǎng)箱中取出胰酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液分裝到I. 5ml的離心管中，用含10%血清的PVA-TL-HEPES緩沖液洗一遍，然后離心力250Xg離心10分鐘，重懸在O. 5ml的磷 酸緩沖液中，如此處理后的豬胚胎成纖維細(xì)胞即為供體細(xì)胞，并放入4°C冰箱內(nèi)備用。進(jìn)行核移植操作前20min，將制備好的供體細(xì)胞從冰箱中取出放入39°C培養(yǎng)箱中孵育，用移液槍吸取10 μ I的細(xì)胞懸液加入已經(jīng)做好的操作滴內(nèi)，用石臘油覆蓋。3-3.采用盲吸法為成熟卵母細(xì)胞去核，在直徑IOOmm培養(yǎng)皿加入100μ I顯微操作液滴，再用礦物油覆蓋，39°C預(yù)熱后把供體細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞同時轉(zhuǎn)入顯微操作液滴，然后在裝配有顯微操作儀及恒溫臺的倒置顯微鏡上用內(nèi)徑20 30 μ m,外徑120 150 μ m的固定吸管吸持成熟卵母細(xì)胞，用內(nèi)徑20 25 μ m的去核/注射針使第一極體處于鐘表4點(diǎn)鐘位置，并從3點(diǎn)鐘處進(jìn)針，吸取第一極體及其臨近10 30%可能含有卵母細(xì)胞核的胞質(zhì)。3-4.去核的成熟卵母細(xì)胞的注核操作。在顯微操作臺培養(yǎng)皿的中央滴內(nèi)置入去核的成熟卵母細(xì)胞，每次置入10 15個，培養(yǎng)皿中央滴周圍的幾個滴內(nèi)置入供體細(xì)胞。首先用內(nèi)徑為15 20 μ m的注核針吸取小而圓的供體細(xì)胞，然后移動操作臺，將去核的成熟卵母細(xì)胞置于視野下，并用固定針固定，用注核針撥動去核的成熟卵母細(xì)胞，找到步驟3-3去核時在透明帶留下的進(jìn)針口，使進(jìn)針口在3點(diǎn)鐘位置并將內(nèi)徑為15 20 μ m的注射針通過該進(jìn)針口插入到透明帶下，將供體細(xì)胞注入去核的成熟卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)，構(gòu)成一個卵-供體細(xì)胞復(fù)合體，而后緩慢抽出注核針，并整理透明帶，使供體細(xì)胞與去核的成熟卵母細(xì)胞膜相互接觸，便于之后重組胚的融合。3-5.融合。將卵-供體細(xì)胞復(fù)合體移入融合液中，洗滌三次后移入融合槽中，用毛細(xì)實(shí)心玻璃管撥動卵-供體細(xì)胞復(fù)合體，使其接觸面與電流方向垂直，然后對卵-供體細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行電擊，電擊參數(shù)為120 volts, 30us, 2puls。將激活后的卵-供體細(xì)胞復(fù)合體迅速移入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中洗滌3 5次，然后置入39°C、5%C02、100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。3-6.胚胎移植入代孕母豬。選擇發(fā)情的母豬，于手術(shù)當(dāng)天早上對母豬禁食。手術(shù)前綁定母豬，并采用戊巴比妥鈉水溶液結(jié)合異氟烷方法麻醉。手術(shù)部位選擇在倒數(shù)第二對乳頭中間部位，用清水清洗手術(shù)部位及四周，擦干后用碘酒對手術(shù)部位及四周進(jìn)行消毒，消毒后用75%酒精脫碘。蓋上創(chuàng)巾布并暴露手術(shù)部位，沿腹中線依次切開皮膚、皮下肌肉，然后用刀柄或大的止血鉗鈍性分離皮下脂肪和腹膜。用手探入腹腔，尋找到子宮和卵巢，并慢慢牽引出腹腔，并用浸有37°C生理鹽水的紗布給卵巢和子宮保溫保濕。固定輸卵管，將裝 有卵一供體細(xì)胞復(fù)合體的外徑為2 3mm的玻璃管慢慢從輸卵管口插入，經(jīng)過I 2個彎曲之后小心將胚胎吹入輸卵管內(nèi)，并慢慢撤出玻璃管，將輸卵管傘重新包住卵巢，回復(fù)子宮和輸卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎。常規(guī)縫合腹腔，術(shù)后將受體母豬單獨(dú)隔離，連續(xù)4天使用抗生素消炎。每天仔細(xì)觀察記錄受體豬的生理情況，做好發(fā)情觀察。3-7.獲得抗圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬。胚胎移植后，對未返情的受體豬于28 30天時，進(jìn)行首次超聲波妊娠檢測，之后每周定時檢測一次，跟蹤胎兒發(fā)育情況，直至克隆豬出生。步驟(4).抗圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬基因組中目的插入基因檢測。4-1.抗圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬基因組中綠色熒光蛋白GFP和新霉素抗性基因Neomycirf插入片段的檢測。以獲得的轉(zhuǎn)基因豬臍帶組織為材料抽提基因組(模板)，分別設(shè)計(jì)GFP引物(CMV+GFP ^ 1689bp)和Neomycinr引物序列( 670bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的條件為94°C預(yù)變性5分鐘，再以940C /45sec，55°C /45sec，72°C /200sec，共35個循環(huán)，最后72°C延長10分鐘。有綠色熒光表現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因豬均可從基因組中擴(kuò)增獲得GFP基因和Neomycinlr基因，表明該兩基因分別被重組到豬基因組中。4-2.抗圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬基因組中shRNA插入片段的檢測。以獲得的轉(zhuǎn)基因豬臍帶組織為材料抽提基因組(模板)，設(shè)計(jì)shRNA擴(kuò)增正反引物序列正向引物序列AAGTAACAAAACTTTTATCG和反向引物序列ATTCCTTCATATTTGCATA (該序列包含載體序列LTR和酶切位點(diǎn)，C5，U6啟動子的序列，可擴(kuò)增出 310bp)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有熒光表現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因豬均可從基因組中擴(kuò)增獲得shRNA基因。本發(fā)明有益效果如下
抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬的培育將從遺傳的角度根除豬圓環(huán)病毒的感染，減少養(yǎng)豬的疫病控制成本，減少豬圓環(huán)病毒對環(huán)境的污染，為生命科學(xué)研究提供合格的實(shí)驗(yàn)用豬，同時，抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬開發(fā)成功將從根本改變疫病控制的傳統(tǒng)策略，開啟一個疫病控制研究的新時代。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，從育種的角度開辟控制豬圓環(huán)病毒2型感染和減少其危害的技術(shù)，是未來的重要發(fā)展趨勢。


圖I轉(zhuǎn)基因重組載體pGK-zsGFP-shRNA 圖2轉(zhuǎn)基因豬基因組中擴(kuò)增犾得shRNA基因序列。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。步驟(I).設(shè)計(jì)能有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA ； 1-1.根據(jù)PCV2型病毒的基因組序列，以R印基因和Cap基因?yàn)槟康幕?，在每個目
的基因內(nèi)選取一段19bp長的核酸序列；該核酸序列不在5’和3’非翻譯區(qū)，且起始密碼子后75bp ;將選取的19bp核酸序列，與豬的基因組進(jìn)行比對，確定該19bp核酸序列是特異性的，只針對目的基因，與其他基因沒有相似性；根據(jù)以上原則設(shè)計(jì)針對Rep基因的靶向基因shRNA 139對，針對Cap基因的靶向基因shRNA 134對。1-2.體外靶向基因shRNA活性檢測；將合成的針對Rep基因和針對Cap基因的靶向基因shRNA序列經(jīng)退火反應(yīng)形成具有粘性末端的雙鏈，且直接連接到線性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體上,構(gòu)建成RNA干擾載體；將上述RNA干擾載體中的DNA,在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000 (Lipofectamine 2000, Invitrogen)介導(dǎo)下導(dǎo)入PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后對經(jīng)轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察，對成功轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞接種PCV2型病毒，接毒48 72小時后將上清懸液和PK15細(xì)胞分開收集，通過免疫熒光的方法分別測上清懸液和PK15細(xì)胞中的病毒TCID5tl,以病毒TCID5tl值判斷靶向基因shRNA活性及對PCV2型病毒的抑制作用，病毒TCID5tl值越大，靶向基因shRNA活性弱，對PCV2型病毒的抑制作用越小。所述的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 載體購置于 Clonetech 公司。步驟(2).獲得能有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病感染的胚胎成纖維細(xì)胞克隆。2-1.構(gòu)建抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因載體。經(jīng)步驟1-2篩選出有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病感染的靶向基因shRNA,構(gòu)建抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因載體pGK-zsGFP-shRNA和 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA (構(gòu)建方法見專利號ZL200910152602. 8，發(fā)明名稱用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的PiggyBac轉(zhuǎn)座載體及其構(gòu)建方法)，如圖I所示。2-2.克隆胚胎成纖維細(xì)胞。將步驟2-1構(gòu)建的抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因載體 pGK-zsGFP-shRNA 和 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0_shRNA 分別用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細(xì)胞；轉(zhuǎn)染24小時后,豬胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后用有限稀釋法克隆。在熒光顯微鏡下觀察這些經(jīng)克隆的豬胚胎成纖維細(xì)胞GFP的表達(dá)情況，選取含GFP的豬胚胎成纖維細(xì)胞。步驟(3)借助核移植、胚胎移植技術(shù)和常規(guī)育種技術(shù)培育抗圓環(huán)病毒2型轉(zhuǎn)基因豬；
3-1.豬卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)。將豬的卵巢用39°C含雙抗的磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗滌多次，然后將卵巢放置于39°C水浴鍋中，用帶有18號針頭的20ml注射器抽吸卵巢上2 6mm的卵泡，將抽取的卵泡液注入無菌撿卵杯中，用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(PVA-TL-HEPES)緩沖液洗滌兩次。在實(shí)體顯微鏡下用撿卵針挑選出細(xì)胞質(zhì)均勻，并包裹有兩層以上致密卵丘細(xì)胞的卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體，并將它放在卵母細(xì)胞成熟液中，在5%C02 ’ 39°C下培養(yǎng)42 44小時，然后加入透明質(zhì)酸酶，漩渦振蕩I分鐘。3-2.制備供體細(xì)胞。將步驟2-2構(gòu)建的表達(dá)GFP的豬胚胎成纖維細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速進(jìn)行復(fù)蘇。復(fù)蘇后，豬胚胎成纖維細(xì)胞長至80 90%的匯合狀態(tài)時，加入從培養(yǎng)箱中取出胰酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液分裝到I. 5ml的離心管中，用含10%血清的PVA-TL-HEPES緩沖液洗一遍，然后離心力250Xg離心10分鐘，重懸在O. 5ml的磷酸緩沖液中，如此處理后的豬胚胎成纖維細(xì)胞即為供體細(xì)胞，并放入4°C冰箱內(nèi)備用。進(jìn)行核移植操作前20min，將制備好的供體細(xì)胞從冰箱中取出放入39°C培養(yǎng)箱中孵育，用移液槍吸取10 μ I的細(xì)胞懸液加入已經(jīng)做好的操作滴內(nèi)，用石臘油覆蓋。3-3.采用盲吸法為成熟卵母細(xì)胞去核，在直徑IOOmm培養(yǎng)皿加入100μ I顯微操作液滴，再用礦物油覆蓋，39°C預(yù)熱后把供體細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞同時轉(zhuǎn)入顯微操作液滴，然后在裝配有顯微操作儀及恒溫臺的倒置顯微鏡上用內(nèi)徑20 30 μ m,外徑120 150 μ m的固定吸管吸持成熟卵母細(xì)胞，用內(nèi)徑20 25 μ m的去核/注射針使第一極體處于鐘表4點(diǎn)鐘位置，并從3點(diǎn)鐘處進(jìn)針，吸取第一極體及其臨近10 30%可能含有卵母細(xì)胞核的胞質(zhì)。3-4.去核的成熟卵母細(xì)胞的注核操作。在顯微操作臺培養(yǎng)皿的中央滴內(nèi)置入去核的成熟卵母細(xì)胞，每次置入10 15個，培養(yǎng)皿中央滴周圍的幾個滴內(nèi)置入供體細(xì)胞。首先用內(nèi)徑為15 20 μ m的注核針吸取小而圓的供體細(xì)胞，然后移動操作臺，將去核的成熟卵母細(xì)胞置于視野下，并用固定針固定，用注核針撥動去核的成熟卵母細(xì)胞，找到步驟3-3去核時在透明帶留下的進(jìn)針口，使進(jìn)針口在3點(diǎn)鐘位置并將內(nèi)徑為15 20 μ m的注射針通過該進(jìn)針口插入到透明帶下，將供體細(xì)胞注入去核的成熟卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)，構(gòu)成一個卵-供體細(xì)胞復(fù)合體，而后緩慢抽出注核針，并整理透明帶,使供體細(xì)胞與去核的成熟卵母細(xì)胞膜相互接觸，便于之后重組胚的融合。3-5.融合。將卵-供體細(xì)胞復(fù)合體移入融合液中，洗滌三次后移入融合槽中，用毛細(xì)實(shí)心玻璃管撥動卵-供體細(xì)胞復(fù)合體，使其接觸面與電流方向垂直，然后對卵-供體細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行電擊，電擊參數(shù)為120 volts, 30us, 2puls。將激活后的卵-供體細(xì)胞復(fù)合體迅速移入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中洗滌3 5次，然后置入39°C、5%C02、100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。3-6.胚胎移植入代孕母豬。選擇發(fā)情的母豬，于手術(shù)當(dāng)天早上對母豬禁食。手術(shù)前綁定母豬，并采用戊巴比妥鈉水溶液結(jié)合異氟烷方法麻醉。手術(shù)部位選擇在倒數(shù)第二對乳頭中間部位，用清水清洗手術(shù)部位及四周，擦干后用碘酒對手術(shù)部位及四周進(jìn)行消毒，消毒后用75%酒精脫碘。蓋上創(chuàng)巾布并暴露手術(shù)部位，沿腹中線依次切開皮膚、皮下肌肉，然后用刀柄或大的止血鉗鈍性分離皮下脂肪和腹膜。用手探入腹腔，尋找到子宮和卵巢，并慢慢牽引出腹腔，并用浸有37°C生理鹽水的紗布給卵巢和子宮保溫保濕。固定輸卵管，將裝有卵一供體細(xì)胞復(fù)合體的外徑為2 3mm的玻璃管慢慢從輸卵管口插入，經(jīng)過I 2個彎曲之后小心將胚胎吹入輸卵管內(nèi)，并慢慢撤出玻璃管，將輸卵管傘重新包住卵巢，回復(fù)子宮和輸卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎。常規(guī)縫合腹腔，術(shù)后將受體母豬單獨(dú)隔離，連續(xù)4天使用抗生素消炎。每天仔細(xì)觀察記錄受體豬的生理情況，做好發(fā)情觀察。
權(quán)利要求
1.一種抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，其特征在于如下步驟 步驟(I).設(shè)計(jì)能有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA ； 1-1.根據(jù)PCV2型病毒的基因組序列，以R印基因和Cap基因?yàn)槟康幕?，在每個目的基因內(nèi)選取一段19bp長的核酸序列；該核酸序列不在5’和3’非翻譯區(qū)，且起始密碼子后75bp ;將選取的19bp核酸序列，與豬的基因組進(jìn)行比對，確定該19bp核酸序列是特異性的，只針對目的基因，與其他基因沒有相似性；根據(jù)以上原則設(shè)計(jì)針對Rep基因的靶向基因shRNA 139對，針對Cap基因的靶向基因shRNA 134對； 1-2.體外靶向基因shRNA活性檢測；將合成的針對Rep基因和針對Cap基因的靶向基因shRNA序列經(jīng)退火反應(yīng)形成具有粘性末端的雙鏈，且直接連接到線性化的RNAi-ReadyPSIREN-RetroQ-ZsGreen載體上，構(gòu)建成RNA干擾載體；將上述RNA干擾載體中的DNA，在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000介導(dǎo)下導(dǎo)入PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后對經(jīng)轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞進(jìn)行熒光 觀察，對成功轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞接種PCV2型病毒，接毒48 72小時后將上清懸液和PK15細(xì)胞分開收集，通過免疫熒光的方法分別測上清懸液和PK15細(xì)胞中的病毒TCID5tl,以病毒TCID50值判斷靶向基因shRNA活性及對PCV2型病毒的抑制作用，病毒TCID5tl值越大，靶向基因shRNA活性弱，對PCV2型病毒的抑制作用越??； 所述的 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 載體購置于 Clonetech 公司； 步驟(2).獲得能有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病感染的胚胎成纖維細(xì)胞克??； 2-1.構(gòu)建抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因載體；經(jīng)步驟1-2篩選出有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病感染的靶向基因shRNA,構(gòu)建抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因載體pGK-zsGFP-shRNA和PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA ； 2-2.克隆胚胎成纖維細(xì)胞；將步驟2-1構(gòu)建的抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因載體pGK-zsGFP-shRNA 和 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0_shRNA 分別用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體 2000 轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細(xì)胞；轉(zhuǎn)染24小時后，豬胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后用有限稀釋法克??；在熒光顯微鏡下觀察這些經(jīng)克隆的豬胚胎成纖維細(xì)胞GFP的表達(dá)情況，選取含GFP的豬胚胎成纖維細(xì)胞； 步驟(3)借助核移植、胚胎移植技術(shù)和常規(guī)育種技術(shù)培育抗圓環(huán)病毒2型轉(zhuǎn)基因豬； 3-1.豬卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)；將豬的卵巢用39°C含雙抗的磷酸緩沖液洗滌多次，然后將卵巢放置于39°C水浴鍋中，用帶有18號針頭的20ml注射器抽吸卵巢上2 6mm的卵泡，將抽取的卵泡液注入無菌撿卵杯中，用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液洗滌兩次；在實(shí)體顯微鏡下用撿卵針挑選出細(xì)胞質(zhì)均勻，并包裹有兩層以上致密卵丘細(xì)胞的卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體，并將它放在卵母細(xì)胞成熟液中，在5%C02，39°C下培養(yǎng)42 44小時，然后加入透明質(zhì)酸酶，漩渦振蕩I分鐘； 3-2.制備供體細(xì)胞；將步驟2-2構(gòu)建的表達(dá)GFP的豬胚胎成纖維細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速進(jìn)行復(fù)蘇；復(fù)蘇后，豬胚胎成纖維細(xì)胞長至80 90%的匯合狀態(tài)時，加入從培養(yǎng)箱中取出胰酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液分裝到I. 5ml的離心管中，用含10%血清的PVA-TL-HEPES緩沖液洗一遍，然后離心力250 Xg離心10分鐘，重懸在O. 5ml的磷酸緩沖液中，如此處理后的豬胚胎成纖維細(xì)胞即為供體細(xì)胞，并放入4°C冰箱內(nèi)備用；進(jìn)行核移植操作前20min，將制備好的供體細(xì)胞從冰箱中取出放入39 V培養(yǎng)箱中孵育，用移液槍吸取10 μ I的細(xì)胞懸液加入已經(jīng)做好的操作滴內(nèi)，用石臘油覆蓋；3-3.采用盲吸法為成熟卵母細(xì)胞去核，在直徑100_培養(yǎng)皿加入100 μ I顯微操作液滴，再用礦物油覆蓋，39°C預(yù)熱后把供體細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞同時轉(zhuǎn)入顯微操作液滴，然后在裝配有顯微操作儀及恒溫臺的倒置顯微鏡上用內(nèi)徑20 30 μ m,外徑120 150 μ m的固定吸管吸持成熟卵母細(xì)胞，用內(nèi)徑20 25 μ m的去核/注射針使第一極體處于鐘表4點(diǎn)鐘位置，并從3點(diǎn)鐘處進(jìn)針，吸取第一極體及其臨近10 30%可能含有卵母細(xì)胞核的胞質(zhì)； 3-4.去核的成熟卵母細(xì)胞的注核操作；在顯微操作臺培養(yǎng)皿的中央滴內(nèi)置入去核的成熟卵母細(xì)胞，每次置入10 15個，培養(yǎng)皿中央滴周圍的幾個滴內(nèi)置入供體細(xì)胞；首先用內(nèi)徑為15 20 μ m的注核針吸取小而圓的供體細(xì)胞,然后移動操作臺，將去核的成熟卵母細(xì)胞置于視野下，并用固定針固定，用注核針撥動去核的成熟卵母細(xì)胞，找到步驟3-3去核時在透明帶留下的進(jìn)針口，使進(jìn)針口在3點(diǎn)鐘位置并將內(nèi)徑為15 20 μ m的注射針通過該進(jìn)針口插入到透明帶下，將供體細(xì)胞注入去核的成熟卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)，構(gòu)成一個卵-供體細(xì)胞復(fù)合體，而后緩慢抽出注核針，并整理透明帶，使供體細(xì)胞與去核的成熟卵母 細(xì)胞膜相互接觸，便于之后重組胚的融合； 3-5.融合；將卵-供體細(xì)胞復(fù)合體移入融合液中，洗滌三次后移入融合槽中，用毛細(xì)實(shí)心玻璃管撥動卵-供體細(xì)胞復(fù)合體，使其接觸面與電流方向垂直，然后對卵-供體細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行電擊，電擊參數(shù)為120 volts, 30us, 2puls ;將激活后的卵-供體細(xì)胞復(fù)合體迅速移入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中洗滌3 5次，然后置入39°C、5%C02、100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時； 3-6.胚胎移植入代孕母豬；選擇發(fā)情的母豬，于手術(shù)當(dāng)天早上對母豬禁食；手術(shù)前綁定母豬，并采用戊巴比妥鈉水溶液結(jié)合異氟烷方法麻醉；手術(shù)部位選擇在倒數(shù)第二對乳頭中間部位，用清水清洗手術(shù)部位及四周，擦干后用碘酒對手術(shù)部位及四周進(jìn)行消毒，消毒后用75%酒精脫碘；蓋上創(chuàng)巾布并暴露手術(shù)部位，沿腹中線依次切開皮膚、皮下肌肉，然后用刀柄或大的止血鉗鈍性分離皮下脂肪和腹膜；用手探入腹腔，尋找到子宮和卵巢，并慢慢牽引出腹腔，并用浸有37°C生理鹽水的紗布給卵巢和子宮保溫保濕；固定輸卵管，將裝有卵一供體細(xì)胞復(fù)合體的外徑為2 3mm的玻璃管慢慢從輸卵管口插入,經(jīng)過I 2個彎曲之后小心將胚胎吹入輸卵管內(nèi)，并慢慢撤出玻璃管，將輸卵管傘重新包住卵巢，回復(fù)子宮和輸卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎；常規(guī)縫合腹腔，術(shù)后將受體母豬單獨(dú)隔離，連續(xù)4天使用抗生素消炎；每天仔細(xì)觀察記錄受體豬的生理情況，做好發(fā)情觀察； 3-7.獲得抗圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬；胚胎移植后，對未返情的受體豬于28 30天時，進(jìn)行首次超聲波妊娠檢測，之后每周定時檢測一次，跟蹤胎兒發(fā)育情況，直至克隆豬出生； 步驟(4).抗圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬基因組中目的插入基因檢測； 4-1.抗圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬基因組中綠色熒光蛋白GFP和新霉素抗性基因Neomycirf插入片段的檢測；以獲得的轉(zhuǎn)基因豬臍帶組織為材料抽提基因組，分別設(shè)計(jì)GFP弓丨物和Neomycinlr弓丨物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增的條件為94°C預(yù)變性5分鐘，再以940C /45sec，55°C /45sec，72°C /200sec，共35個循環(huán)，最后72°C延長10分鐘；有綠色熒光表現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因豬均可從基因組中擴(kuò)增獲得GFP基因和Neomycinlr基因，表明該兩基因分別被重組到豬基因組中； 4-2.抗圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬基因組中shRNA插入片段的檢測；以獲得的轉(zhuǎn)基因豬臍帶組織為材料抽提基因組，設(shè)計(jì)shRNA擴(kuò)增正反引物序列正向引物序列AAGTAACAAAACTTTTATCG和反向引物序列ATTCCTTCAT ATTTGCATA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有熒光表現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因豬均可從基因組中擴(kuò)增獲得shRNA基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法。目前在該病的防治領(lǐng)域，從技術(shù)上取得的效果上收效甚微。本發(fā)明方法首先設(shè)計(jì)能有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA；其次獲得能有效阻止豬圓環(huán)病毒2型病感染的胚胎成纖維細(xì)胞克??；然后借助核移植、胚胎移植技術(shù)和常規(guī)育種技術(shù)培育抗圓環(huán)病毒2型轉(zhuǎn)基因豬；最后檢測抗圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬基因組中目的插入基因。本發(fā)明從遺傳的角度根除豬圓環(huán)2型病毒的感染，減少養(yǎng)豬的疫病控制成本，減少豬圓環(huán)病毒對環(huán)境的污染，為生命科學(xué)研究提供合格的實(shí)驗(yàn)用豬，從根本改變疫病控制的傳統(tǒng)策略，開啟一個疫病控制研究的新時代。
文檔編號C12N15/85GK102851311SQ20121004229
公開日2013年1月2日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者周繼勇, 繆云根, 逄大欣, 曹晶晶, 金玉蘭, 歐陽紅生, 周芳, 袁婷 申請人:浙江大學(xué)