專利名稱:鼠傷寒沙門氏菌特異性pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種禽類及其制品安全檢驗(yàn)領(lǐng)域的PCR檢測方法及其中的核酸和引物對,具體是一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法。
背景技術(shù):
鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)是沙門氏菌致病常見的血清型之一,以嬰幼兒感染最常見,臨床癥狀主要為發(fā)熱、惡心、嘔吐和腹瀉。該菌為革蘭氏陰性桿菌,屬沙門氏菌B群,不形成芽孢,無莢膜,但有鞭毛。該菌在自然界分布廣泛,在外界環(huán)境中抵抗力較強(qiáng),常溫下可迅速繁殖,耐低溫 、干燥,不耐熱,對酸、紫外線和各種化學(xué)消毒劑均敏感。該菌可分608個(gè)噬菌體型,20個(gè)不同的生化型,在自然界進(jìn)化過程中,形成了哥本哈根變種、賓斯變種及0型變種三個(gè)變種。該菌的檢測主要依靠傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法(參見國標(biāo)GB/T4789. 4-2008),該方法需經(jīng)選擇性增菌培養(yǎng),并通過生化反應(yīng)及血清學(xué)測試鑒定,雖然結(jié)果可靠,但操作復(fù)雜,通常要3 5天才能得出檢測結(jié)果,不利于及時(shí)診斷病因,查找病源,控制病情的蔓延。之后,許多研究學(xué)者建立了如熒光抗體技術(shù)、免疫磁珠富集法、ELLSA、自動(dòng)酶聯(lián)免疫熒光法、免疫組化、顯色培養(yǎng)基法、DNA探針技術(shù)等檢測方法,但在實(shí)踐中都有不同程度的局限性。PCR技術(shù)具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),逐步應(yīng)用于沙門氏菌的檢疫之后,對沙門氏菌病診斷和防治工作起到了積極作用。有學(xué)者先后以鼠傷寒沙門氏菌fimA、fimY、fliC、fljB等基因?yàn)槟康幕?,對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行特異性PCR檢測,但是由于靶位點(diǎn)特異性不強(qiáng),PCR結(jié)果產(chǎn)生假陽性,因而產(chǎn)生判斷困難。另外,有學(xué)者根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌16S DNA、spvC、invB、fimA基因設(shè)計(jì)4對引物,通過多重PCR方法檢測鼠傷寒沙門氏菌,但與普通PCR相比,多重PCR的成本、實(shí)驗(yàn)技術(shù)等要求都相對較高。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn),尚未發(fā)明與本發(fā)明的鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法、核酸及引物有關(guān)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法。采用本發(fā)明的檢測方法檢測鼠傷寒沙門氏菌,檢測時(shí)間短,成本低,更加具有實(shí)用性,檢測結(jié)果特異,結(jié)果判定簡單。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明設(shè)計(jì)一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法,包括如下步驟步驟一,根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA序列中保守且特異的STM4493基因序列SEQ ID NO 1設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對;所述引物對具體為正向引物序列如SEQ ID NO 2所示,反向引物序列如SEQ ID NO 3所示。步驟二,提取樣品DNA,PCR法擴(kuò)增;PCR檢測體系具體為=IOXPCR反應(yīng)緩沖液2. 5u L, 25mmol/L 的 Mg2+2. Ou L, 2. 5mmol/L 的 dNTPl. Ou L,5uM 引物對 I u L, Taq 酶 IU,模板溶液0. 5 2 ii L,最后用雙蒸水補(bǔ)至25ii L ;PCR檢測體系擴(kuò)增參數(shù)具體為95°C預(yù)變性5min后開始擴(kuò)增循環(huán),每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?5°C變性30s,52°C退火30s,72°C延伸30s ;共35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸lOmin,降溫至16°C,結(jié)束。步驟三,凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,判斷樣品是否含鼠傷寒沙門氏菌;所述判斷具體為凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,紫外燈照射下觀察,若在456bp位置存在單一擴(kuò)增條帶,則說明樣品中含鼠傷寒沙門氏菌;若沒有,則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下的有益效果采用本發(fā)明檢測鼠傷寒沙門氏菌,檢測時(shí)間短,檢測成本低;避免了采用傳統(tǒng)鑒定方法操作繁瑣、耗時(shí)長、檢出率底、假陽性較多等缺點(diǎn)。同時(shí),本發(fā)明可用于檢測某些抗血清不能檢測出的菌株,如抗原不表達(dá)的菌株,彌補(bǔ)免疫檢測的缺陷,更具實(shí)用性;本發(fā)明檢測的靶點(diǎn)具有單一特異性,檢測結(jié)果特異,結(jié)果判定簡單。
圖I為實(shí)施例2中鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法特異性評價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果圖;圖2為實(shí)施例3中鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法靈敏性評價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York Cold Spring Habor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法的建立步驟一,設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增鼠傷寒沙門氏菌的引物對通過生物信息學(xué)分析,從鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA序列中篩選出保守且特異的STM4493基因,將之作為檢測鼠傷寒沙門氏菌的靶基因,基因序列如SEQ ID NO : I所示;將STM4493基因DNA序列輸入軟件Primer Premier 5. 0中設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對,設(shè)置GC%范圍為40% 60%,產(chǎn)物大小范圍為100 500bp,從備選引物對中選擇引物對,引物對序列如下(引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成)上游引物5_’AAATGTGCTTGAGGCGTTAG-3’(SEQ ID NO 2);下游引物5_’CGTGCGGCGATGTTAGIT-3’ (SEQ ID NO :3)步驟二,DNA模板制備將鼠傷寒沙門氏菌接菌至IOml的LB液體培養(yǎng)基中,在37°C增菌8h后,取Iml菌液,放入I. 5ml離心管中;12,000r/min離心IOmin,棄上清液,加入200 y L無菌雙蒸水重新懸浮菌體,12,000r/min離心5min,棄上清液,收集菌體。用100 U L無菌雙蒸水重新懸浮菌體,在沸水浴中煮15min,立即取出,在-20°C放置30min。在37°C解凍后,12,000r/min離心5min,取上清液放置-20°C備用。
步驟三,鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法的建立PCR檢測的25iiL反應(yīng)體系具體為,10XPCR反應(yīng)緩沖液2. 5iiL,25mmol/L的Mg2+2. Ou L, 2. 5mmol/L 的 dNTPl. Ou L,5uM 引物對 I y L,Taq 酶 1U,模板溶液 I y L,最后用雙蒸水補(bǔ)至25ii L ;PCR檢測體系擴(kuò)增參數(shù)具體為95°C預(yù)變性5min ;之后開始擴(kuò)增循環(huán),每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?5°C變性30s,52°C退火30s,72°C延伸30s ;共35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸IOmin,降溫至16°C,結(jié)束。步驟四,結(jié)果判定所述判斷具體為取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 y L,在2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析,在紫外燈照射下進(jìn)行觀察,如果電泳結(jié)果在456bp位置出現(xiàn)單一擴(kuò)增條帶,則說明樣品中含鼠傷寒沙門氏菌;如果電泳結(jié)果在456bp位置沒有出現(xiàn)456bp單一擴(kuò)增條帶,則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。結(jié)果取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 U L,2%的瓊脂糖凝膠電泳后,紫外燈照射下,在456bp位 置可觀察到單一擴(kuò)增條帶,說明所建立的PCR能成功檢測出鼠傷寒沙門氏菌。實(shí)施例2鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法特異性評價(jià)實(shí)驗(yàn)步驟一,DNA模板制備按照實(shí)施例I步驟二分別提取鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)、甲型副傷寒沙門氏菌(S. Paratyphi A)、乙型副傷寒沙門氏菌(S. Paratyphi B)、丙型副傷寒沙門氏菌(S. Paratyphi C)、豬霍亂沙門氏菌(S. Choleraesuls)、雞白痢沙門氏菌(S. Pullorosis)、鴨沙門氏菌(S. Anatis)、雞沙門氏菌(S. Gallinarum)、都柏林沙門氏菌(S. Dublin)、腸炎沙門氏菌(S. Enteritidis)、海德爾堡沙門氏菌(S. Heidelberg)、山夫登堡沙門氏菌(S. Senftenberg)基因組 DNA 模板。步驟二,鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法特異性評價(jià)試驗(yàn)按照實(shí)施例I步驟三中PCR反應(yīng)體系,取步驟一中制備各菌株的DNA模板I ii L作為PCR反應(yīng)模板分別添加到PCR反應(yīng)體系中,空白對照以I U L的無菌雙蒸水為模板;然后按照實(shí)施例I步驟三中PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。步驟三,結(jié)果判定取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 y L,在2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析,在紫外燈照射下進(jìn)行觀察,若電泳結(jié)果在456bp位置出現(xiàn)單一擴(kuò)增條帶,則說明樣品中含鼠傷寒沙門氏菌;若出現(xiàn)在456bp位置沒有出現(xiàn)456bp單一擴(kuò)增條帶,則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。結(jié)果圖I及表I為鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法特異性評價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果。
RsiI-M
Salmonella Typhimurium50115-13I+
Salmonella choleraesulsASI. 1190I一
Salmonella Paratyphi AATCC 9150I-
Salmonella Paratyphi BCMCC 50004I-
Salmonella Paratyphi CCMCC 50118I-
權(quán)利要求
1.一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法,其特征在于,包括如下步驟步驟一,根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌全基因組DNA序列中保守且特異的STM4493基因序列SEQID NO :1設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對;所述引物對為正向引物序列如SEQ ID NO :2所示,反向引物序列如SEQ ID NO 3所示;步驟二,提取樣品DNA,PCR法擴(kuò)增;PCR檢測體系具體為=IOXPCR反應(yīng)緩沖液2. 5 μ L,25mmol/L 的 Mg2+2. O μ L,2. 5mmol/L 的 dNTPl. 0 μ L, 5 μ M 引物對 I μ L, Taq 酶 IU,模板溶液O.5 2μ L,最后用雙蒸水補(bǔ)至25 μ L。PCR檢測體系擴(kuò)增參數(shù)具體為95°C預(yù)變性5min ;之后開始擴(kuò)增循環(huán),每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?5°C變性30s,52°C退火30s,72°C延伸30s ;共35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸lOmin,降溫至16 °C,結(jié)束;步驟三,凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,判斷樣品是否含有鼠傷寒沙門氏菌;所述判斷具體為凝膠電泳檢測,紫外燈照射下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物在456bp位置是否存在單一擴(kuò)增條帶,若存在,則說明樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌;若沒有,則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鼠傷寒沙門氏菌特異性PCR檢測方法,包括如下步驟根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌全基因組序列中保守且特異的STM4493基因序列SEQ ID1設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO3;提取樣品DNA,PCR法擴(kuò)增;凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,判斷樣品是否含鼠傷寒沙門氏菌;所述判斷具體為若電泳結(jié)果在456bp出現(xiàn)單一擴(kuò)增條帶,則說明樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌;若未出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增條帶,則樣品中不含鼠傷寒沙門氏菌。采用本發(fā)明檢測鼠傷寒沙門氏菌,檢測時(shí)間短,成本低,檢測結(jié)果特異,結(jié)果判定簡單。
文檔編號C12Q1/68GK102618634SQ20121004235
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者汪銘書, 程安春, 陳孝躍, 黃靜瑋 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)