專(zhuān)利名稱(chēng)：小鼠皮膚黑色素細(xì)胞特異表達(dá)的載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物 技術(shù)領(lǐng)域，具體而言涉及一種在皮膚黑色素中特異表達(dá)，從而為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供高效表達(dá)的載體。
背景技術(shù)：
⑶K5-A是⑶K家族成員，研究表明⑶K5-A通過(guò)調(diào)節(jié)羊駝黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素的路徑上TYR和MClR等基因的表達(dá)，參與羊駝毛色形成，并在其表型和功能的維持中起重要的作用。為了將羊駝CDK5-A轉(zhuǎn)入絨山羊使其毛色表型發(fā)生變化成為可能，載體中承載的可表達(dá)序列(包含啟動(dòng)子、報(bào)告基因、FLAG標(biāo)簽以及目標(biāo)基因)的構(gòu)建是前提。該構(gòu)建技術(shù)主要應(yīng)用DNA重組技術(shù)定向地將不同的DNA片段進(jìn)行連接，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制進(jìn)行表達(dá)，從而產(chǎn)生新的目的遺傳性狀。該構(gòu)建的目的是將⑶K5-A基因接入真核表達(dá)載體中，通過(guò)自身攜帶的特異啟動(dòng)子以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的真核啟動(dòng)子使目的基因在特異細(xì)胞中表達(dá)。在設(shè)計(jì)該構(gòu)建時(shí)根據(jù)目的而對(duì)所涉及的DNA片段進(jìn)行修飾和改造。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)載體，理想的應(yīng)該是帶內(nèi)含子的基因組DNA，可是，由于一般基因組DNA都比較長(zhǎng)，獲取完整而又正確的序列非常困難，所以一般情況下用的是cDNA。而且，制備轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建時(shí)，首先必須將導(dǎo)入DNA進(jìn)行分離純化，并線(xiàn)性化。而在使用的載體上除了多克隆位點(diǎn)之外，還有很多其它酶切位點(diǎn)的，故用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切可以使DNA線(xiàn)性化。另外，還可以通過(guò)在設(shè)計(jì)的引物上額外加上限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，也可以解決該問(wèn)題。為了體現(xiàn)目標(biāo)基因是否進(jìn)行表達(dá)，在載體上需要一個(gè)報(bào)告基因，這樣報(bào)告基因的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以區(qū)分轉(zhuǎn)錄體是來(lái)源于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒還是來(lái)源于內(nèi)源性基因。同時(shí)，報(bào)告基因常含有一個(gè)Kozak —致序列(即該序列含有真核生物翻譯起始密碼子)，并在下游含有多聚A信號(hào)，因此在RNA聚合酶II作用下產(chǎn)生的mRNA能翻譯為蛋白質(zhì)。報(bào)告基因編碼區(qū)的上游插入了啟動(dòng)子，是DNA分子報(bào)告基因的mRNA、蛋白質(zhì)或酶水平可以反應(yīng)啟動(dòng)子的活性。對(duì)于細(xì)胞特異性啟動(dòng)子而言，啟動(dòng)子活性在表達(dá)的細(xì)胞系中與其在非表達(dá)的細(xì)胞系中具有很大差異，因此，為了使構(gòu)建在特異的細(xì)胞中表達(dá)，選擇細(xì)胞內(nèi)特異的啟動(dòng)子是必要的。目的基因在特異細(xì)胞中表達(dá)后，為了分析蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能以及篩選目的基因暫時(shí)不容易得到或特異細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的基因靶點(diǎn)，常在氨基端加一FLAG標(biāo)簽。Flag標(biāo)簽蛋白為編碼8個(gè)氨基酸的親水性多肽(DYKDDDDK)，一般不與目的蛋白發(fā)生相互作用，并且不會(huì)影響目的蛋白的生物活性和細(xì)胞內(nèi)定位，這樣利于對(duì)其進(jìn)行下游研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了提高⑶K5在黑色素細(xì)胞中的表達(dá)效率，構(gòu)建了含有⑶K5的載體。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案
本發(fā)明一方面涉及一種載體，其序列結(jié)構(gòu)為pMD18-T-TYRP2-CDK5-SV40intron/polyA，優(yōu)選的，其含有SEQ ID 7的DNA序列。本發(fā)明另一方面還涉及一種試劑盒，其含有上述載體，優(yōu)選的，在本發(fā)明的試劑盒中還包括輔助基因轉(zhuǎn)染的試劑。本發(fā)明另外一方面還涉及制備上述載體的試劑盒，其包括SEQ ID :1-6的引物。本發(fā)明另一方面還涉及上述載體的用途，其特征在于所述的載體用于體外黑色素細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。另一方面，本發(fā)明還涉及上述載體在調(diào)節(jié)動(dòng)物黑色素表達(dá)中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用是非治療目的的。
具體實(shí)施方式
(I)克隆小鼠TYRP2基因的啟動(dòng)子片段以小鼠基因組DNA為模板，PCR法擴(kuò)增獲得，經(jīng)純化后，進(jìn)行TA克隆。所用引物如下Try2P-F(SEQ ID 1) :5’ CGAGCTCGTAAATGCACACATCTGCATGC 3’ (Sac I)Try2P-R(SEQ ID :2) :5，GCCCGGGGCCGGCGTCCCACCTGGTTTC 3， (XmaI)(2)克隆羊駝⑶K5 cDNA片段，并帶有FLAG標(biāo)簽以羊駝cDNA為模板，引物中設(shè)計(jì)FLAG序列，PCR法擴(kuò)增獲得，經(jīng)純化后，進(jìn)行TA克隆。所用引物如下CDK5-Kozak-F(SEQ ID 3) :5， GCCCGGGGCCGCCACCATGCAGAAATACGAGAAACTGG3， (Xma I)CDK5-flag-R(SEQ ID 4) :5’CTCTAGACTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGGGAGGGCAGAAGTCGGAGA 3， (XbaI)(3)克隆 SV40 intron/polyA 片段以含有SV40的質(zhì)粒DNA (如pcDNAl. I)為模板，PCR法擴(kuò)增獲得，經(jīng)純化后，進(jìn)行TA克隆。所用引物如下SV40pA-F((SEQ ID 5) :5’ CTCTAGAGGATCTTTGTGAAGGAACCTTA 3’ (XbaI)SV40pA-R((SEQ ID :6)) :5’ CGTCGACTCGATCCAGACATGATAAGATA 3’ (Sail)(4)克隆 pMDl8-T-TYRP2_CDK5-SV40intron/polyA用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI and Sail消化環(huán)狀pMD18_T質(zhì)粒和SV40intron/polyA質(zhì)粒(第3步TA克隆后)，膠回收純化，并進(jìn)行連接，產(chǎn)生pMD18-T-SV40 intron/polyA克隆。
用限制性?xún)?nèi)切酶XmaI和XbaI消化上述獲得的pMD18-T-SV40intron/polyA質(zhì)粒以及羊駝⑶K5cDNA質(zhì)粒(第2步TA克隆后)，膠回收純化，并進(jìn)行連接，產(chǎn)生pMD 18-T-CDK5-SV40 intron/po IyA 克隆。 用限制性?xún)?nèi)切酶SacI和XmaI消化上述獲得的pMD18-T-CDK5_SV40intron/polyA質(zhì)粒以及TYRP2啟動(dòng)子質(zhì)粒(第I步TA克隆后)，膠回收純化，并進(jìn)行連接，產(chǎn)生pMD 18-T-TYRP2-CDK5-SV40 intron/po I yA 克隆。
(5)制備用于顯微注射的轉(zhuǎn)基因DNA用限制性?xún)?nèi)切酶SacI和SalI消化上述獲得的pMD18-T-TYRP2-CDK5_SV40intron/polyA質(zhì)粒，并進(jìn)行膠回收純化，產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)基因DNA。為了檢測(cè)構(gòu)建載體 pMD18-T-Try2P-CDK5A-SV40intron/polyA 的表達(dá)效率，首先進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染在6孔板的每孔中加入大約2ml正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基，接種3X105個(gè)黑色素細(xì)胞。在37°C條件下培養(yǎng)細(xì)胞約60%;在滅菌離心管中準(zhǔn)備試劑A和B (試劑A :對(duì)每孔細(xì)胞，使用125 u I不含血清的培養(yǎng)基稀釋2 ii g DNA ;試劑B :對(duì)每孔細(xì)胞，使用125 U I不合血清的培養(yǎng)基稀釋7 u I DNAfectin試劑)；將試劑A和B混合，室溫條件下孵育20min以促進(jìn)DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體的形成；移去細(xì)胞中的培養(yǎng)基，加入800 u I不含血清的培養(yǎng)基；將DNAfectin與DNA的復(fù)合物加入細(xì)胞中，輕柔搖動(dòng)培養(yǎng)板，確?；靹?；在37°C條件下保溫15小時(shí)；移去轉(zhuǎn)染試劑，每孔加入2ml含血清的完全培養(yǎng)；在37°C條件下培養(yǎng)細(xì)胞72小時(shí)后，收集所有細(xì)胞，并提取其總RNA，RT反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，對(duì)MClR和TYR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)收集SYRB-GREEN染料信號(hào)以示產(chǎn)生目的基因的產(chǎn)量。同時(shí)，用18S rRNA 做內(nèi)參。以檢測(cè)轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞中毛色基因的表達(dá)變化。RT 反應(yīng)體系10 ii I 反應(yīng)體系中含 5XPrime ScriptTMBuffer2 u I, PrimeScriptTMRT Enzyme Mixl 0.5 u I, Oligo dT Primer25pmol,隨機(jī)引物 50pmol,TotalRNAlu I, DEPC水加至lOyl。上述成分混勻后置于PCR儀器中，反應(yīng)條件為370C 15min，85°C 5s。RT 產(chǎn)物保存于-20°C備用。建立PCR 反應(yīng)體系10XReaction Buffer2. 5 U I, dNTPs (各 2. 5mM) 2. 0 U I,上下游引物(IOiiM)各 0. 5 iil，Taq DNA 聚合酶(2U)0. 2u I, cDNA 模板(500-1000ng) I. 0 u I,ddH2018. 3u I0按如下反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR所用引物如下
權(quán)利要求
1.一種載體，其序列結(jié)構(gòu)為pMD18-T-TYRP2-CDK5-SV40intron/polyA，優(yōu)選的，其含有SEQ ID 7 的 DNA 序列。
2.一種試劑盒，其含有權(quán)利要求I的載體，優(yōu)選的，在試劑盒中還包括輔助基因轉(zhuǎn)染的試劑。
3.一種制備權(quán)利要求I所述載體的試劑盒，其包括SEQ ID :1-6的引物。
4.權(quán)利要求I所述載體的用途，其特征在于所述的載體用于體外黑色素細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
5.權(quán)利要求I所述載體在調(diào)節(jié)動(dòng)物黑色素表達(dá)中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用是非治療目的的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了小鼠皮膚黑色素細(xì)胞特異表達(dá)的載體及其應(yīng)用，其序列為pMD18-T-TYRP2-CDK5-SV40intron/polyA。本發(fā)明的載體具有高的表達(dá)效率，對(duì)于調(diào)節(jié)動(dòng)物黑色素的表達(dá)具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102776234SQ20121004294
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者冀元?jiǎng)P, 楊?yuàn)檴? 白俊明, 范瑞文, 董常生, 謝建山 申請(qǐng)人:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)