專利名稱：提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株及構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株及構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
富馬酸是一種重要的基本化工原料和精細(xì)化工產(chǎn)品，廣泛用于涂料、樹脂、醫(yī)藥、 增塑劑等領(lǐng)域。工業(yè)上可用于生產(chǎn)不飽和樹脂和醇酸樹脂，以及用作生產(chǎn)電泳漆的原料。 與苯乙烯的共聚物是生產(chǎn)玻璃鋼的原料，與乙酸乙烯的共聚物是優(yōu)良的粘合劑。食品級(jí)富馬酸是口味純正的酸味劑，用作飲料、酒類、糕點(diǎn)以及腌菜等的酸味劑，并起著食品防腐劑、 抗氧化劑和PH調(diào)節(jié)劑的作用。將富馬酸與碳酸鈉反應(yīng)制備的富馬酸鈉是一種食品添加劑的風(fēng)味增強(qiáng)劑；飼料級(jí)富馬酸及其酸類能提高飼料中有機(jī)物質(zhì)的吸收率和生物學(xué)利用率， 減少機(jī)體能量消耗，所以還具有促進(jìn)增重等作用。同時(shí)，以富馬酸為原料可以進(jìn)一步合成多種高價(jià)值衍生物。富馬酸和醇類在硫酸催化劑的作用下進(jìn)行酯化反應(yīng)可生成富馬酸酯，近代已開發(fā)出一系列的富馬酸酯類防霉防蛀劑，如富馬酸二甲酯(DMF)、二乙酯(DEF)、二丙酯(DPF)、二丁酯(DBF)、單甲酯(MMF)等，其代表性產(chǎn)品富馬酸二甲酯為國(guó)外八十年代開發(fā)的一類低毒、高效、價(jià)廉、廣譜的新型防霉防腐劑，較苯甲酸、山梨酸、脫氫醋酸、丙酸及相應(yīng)的鹽具有用量少、成本低、效果好等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)外早已廣泛應(yīng)用于食品防霉劑行業(yè)。以富馬酸作為原料，可以進(jìn)一步合成多種藥品，富馬酸鈉與硫酸亞鐵的置換產(chǎn)物富馬酸亞鐵已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上治療人體的小紅血球貧血病，其他諸如富馬酸奎地平，富馬酸酮替芬，富馬酸氯馬斯汀片，富馬酸比索洛爾片劑等都已在國(guó)內(nèi)外上市使用。另外，富馬酸作為一種重要的四碳平臺(tái)化合物，還可以通過(guò)酶催化轉(zhuǎn)化、酯化、加氫等工藝生產(chǎn)L-天冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、1，4_ 丁二醇、Y-丁內(nèi)酯和四氫呋喃等四碳化合物。微生物發(fā)酵法制備富馬酸的常用菌種為米根霉、少根霉、無(wú)根根霉以及黑根霉，Tsao教授等報(bào)道了利用米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸(Appl Environ Microbiol，1996，62 : 四31.)，通過(guò)對(duì)米根霉合成富馬酸代謝途經(jīng)分析，葡萄糖通過(guò)糖酵解過(guò)程生成丙酮酸，丙酮酸在經(jīng)TCA和反TCA途徑生成富馬酸的同時(shí)，還可在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下生成乳酸，乳酸途徑的存在大大削弱了富馬酸的積累能力。研究人員嘗試通過(guò)菌株誘變手段篩選乳酸缺陷型菌株，但一直受限于低篩選效率和篩選方法不恰當(dāng)?shù)认拗埔蛩氐闹萍s，未能獲得遺傳穩(wěn)定的低產(chǎn)乳酸米根霉菌株。 米根霉在經(jīng)歷了一定時(shí)間的常規(guī)培養(yǎng)后，IdhL在產(chǎn)物積累中漸漸起到主導(dǎo)作用，從而使得米根霉積累乳酸的能力逐步提高，嚴(yán)重影響了富馬酸的合成。因此通過(guò)某種技術(shù)手段阻斷 IdhL基因?qū)⒏淖兲即x流的分配，減弱或完全剔除乳酸代謝支路，從而達(dá)到提高富馬酸代謝通量的目的。而如何有效抑制IdhL活性以及在代謝遷移的基礎(chǔ)上，進(jìn)行代謝流調(diào)控，重新分配代謝通量，將是實(shí)現(xiàn)利用基因敲除技術(shù)改造R. oryzae高通量積累富馬酸的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下—種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)乳酸脫氫酶基因IdhL的克隆以提取的米根霉細(xì)胞基因組DNA為模板，分別以序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2為上、下游引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出SEQ ID No. 5所示的乳酸脫氫酶IdhL基因序列，提純，將提純后的乳酸脫氫酶IdhL基因序列與pMDIS-simple-T載體連接，得到重組 pMD18-simpIe-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定，酶切所述重組pMD18_simpIe-T載體，得到包含酶切位點(diǎn)的IdhL基因片段；(2)包含真菌啟動(dòng)子序列、反向IdhL基因序列以及終止子序列的重組片段構(gòu)建利用Not I, Xho I將步驟(1)獲得的片段反向插入到SEQ ID No. 7所示的質(zhì)粒 PGAPZB啟動(dòng)子的下游，獲得重組質(zhì)粒pGAP^-ldhL，用Bgl II，BamH I酶切重組質(zhì)粒所述 pGAP^-ldhL，得到包含真菌啟動(dòng)子序列、反向IdhL基因序列以及終止子序列AOXl的重組片段 pGAP-ldhL-AOXl ；(3)潮霉素抗性基因的克隆以SEQ ID No. 8所示的質(zhì)粒pDx-Los為模板，以序列表SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4為上、下游引物，PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物提純，與pMD18-Simple-T 載體連接，得到重組pMD18-simpIe-T載體，酶切所述重組pMD18_simpIe-T載體，得到SEQ ID No. 6所示的包含酶切位點(diǎn)的潮霉素抗性基因片段；(4)含有抗性基因重組基因片段的構(gòu)建將步驟⑵獲得的重組片段與步驟(3)獲得的基因片段利用BamH I位點(diǎn)進(jìn)行連接，用限制性內(nèi)切酶EcoR I驗(yàn)證片段連接順序，篩選潮霉素抗性基因片段位于 pGAP-ldhL-AOXl片段下游的連接子，得到重組片段pGAP-ldhL-AOXl-chac/ ；(5)重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH I,Hind III將所述重組片段pGAP-ldhL-AOXl-chac/ 插入質(zhì)粒 PCAMB3300，得到重組質(zhì)粒 ρ CAMB3300-pGAP-ldhL-A0Xl-chaoE ；(6)重組根癌膿桿菌的獲得將步驟( 獲得的重組質(zhì)粒ρ CAMB3300pGAP-ldhL-A0Xl-chaoK通過(guò)電擊直接轉(zhuǎn)化根癌膿桿菌LBA4404，涂布含50 μ g/mL的卡那霉素LB平板培養(yǎng)基，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行分子鑒定陽(yáng)性克隆，得到含有重組質(zhì)粒P CAMB3300pGAP-ldhL-A0Xl-chaoE的根癌膿桿菌基因工程菌株，命名為 Agrobacterium tumefaciens LBA4404-pCAMB3300-pGAP-ldhL-A0Xl -chaoE(7)重組米根霉菌株的獲得①將步驟(6)獲得的菌株接種于含卡那霉素、利福霉素和鏈霉素的LB培養(yǎng)基中， ^-32°C，180-220r/min搖床培養(yǎng)30_4池，離心收集菌體，用等體積的IM培養(yǎng)基重懸菌體， 培養(yǎng)5-8h，使菌細(xì)胞終濃度達(dá)到IOll-IO12個(gè)/mL ；所述卡那霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為 40-60 μ g/mL,所述利福霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為40-60 μ g/mL,所述鏈霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為20-40 μ g/mL ；
②將米根霉孢子液接種于YPD固體培養(yǎng)基中，33-35°C培養(yǎng)6_8天；用無(wú)菌水洗脫收集新鮮孢子，重懸于用20g/l的無(wú)菌CaCl2水溶液中，使米根霉孢子濃度達(dá)到IO8-IO9個(gè)/ mL ；取步驟①和②獲得的重懸菌液各50 μ L加入含有乙酰丁香酮、卡那霉素和潮霉素的IM培養(yǎng)基中，在28-320C，180-220r/min培養(yǎng)12_16h ；稀釋IO"6倍，取200 μ L稀釋液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS培養(yǎng)基平板，并置于33-35°C培養(yǎng)40_50h ；將玻璃紙轉(zhuǎn)接到含有潮霉素的YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)90-100h，篩選陽(yáng)性米根霉基因工程菌株，并進(jìn)行基因水平上的分子鑒定，命名為Miizopus oryzae CM 08/LDH_，所述乙酰丁香酮在IM培養(yǎng)基中的濃度為 200 μ mol/L,卡那霉素在IM培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL,潮霉素在IM培養(yǎng)基中的濃度為 50 μ g/mL,所述潮霉素在YPD培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL。上述方法構(gòu)建的一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株lihizopus oryzae CM 08/ LDH-。上述一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株在以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的用途。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的菌株在充分好氧條件下利用葡萄糖發(fā)酵高濃度積累富馬酸，解決了傳統(tǒng)米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸副產(chǎn)物乳酸含量較高的問(wèn)題。分批補(bǔ)料發(fā)酵完畢可利用150g/L的葡萄糖，得到富馬酸120g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率80%，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1. 2g/L/h ；在相同條件下，原始菌株利用150g/L的葡萄糖，得到80g/L的富馬酸，生產(chǎn)強(qiáng)度僅為0. 8g/L/h，與野生米根霉菌株相比，本發(fā)明的重組菌株的生產(chǎn)富馬酸的最終發(fā)酵濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度得到顯著提高。與目前文獻(xiàn)所報(bào)道利用野生米根霉菌株發(fā)酵產(chǎn)富馬酸過(guò)程相比較，提高了生產(chǎn)強(qiáng)度，縮短了生產(chǎn)時(shí)間，副產(chǎn)物乳酸的濃度顯著降低，目標(biāo)產(chǎn)物濃度提升明顯，從而降低了發(fā)酵液中富馬酸的分離難度和分離成本，為微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)生物基來(lái)源的富馬酸奠定了良好的基石出。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明作任何的限制。實(shí)施例1一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)乳酸脫氫酶基因IdhL的克隆以提取的米根霉細(xì)胞基因組DNA為模板，分別以序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2為上、下游引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出SEQ ID No. 5所示的乳酸脫氫酶IdhL基因序列，提純，將提純后的乳酸脫氫酶IdhL基因序列與pMDIS-simple-T載體連接，得到重組 pMD18-Simple-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定，酶切所述重組pMD18_simple-Τ載體，得到包含酶切位點(diǎn)的IdhL基因片段；(2)包含真菌啟動(dòng)子序列、反向IdhL基因序列以及終止子序列的重組片段構(gòu)建利用Not I, Xho I將步驟(1)獲得的片段反向插入到SEQ ID No. 7所示的質(zhì)粒 PGAPZB啟動(dòng)子的下游，獲得重組質(zhì)粒pGAP^-ldhL，用Bgl II，BamH I酶切重組質(zhì)粒所述pGAP^-ldhL，得到包含真菌啟動(dòng)子序列、反向IdhL基因序列以及終止子序列AOXl的重組片段 pGAP-ldhL-AOX 1 ；(3)潮霉素抗性基因的克隆以SEQ ID No. 8所示的質(zhì)粒pDx-Los為模板，以序列表SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4為上、下游引物，PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物提純，與pMD18-Simple-T 載體連接，得到重組pMD18-simpIe-T載體，酶切所述重組pMD18_simpIe-T載體，得到SEQ ID No. 6所示的包含酶切位點(diǎn)的潮霉素抗性基因片段；(4)含有抗性基因重組基因片段的構(gòu)建將步驟⑵獲得的重組片段與步驟(3)獲得的基因片段利用BamH I位點(diǎn)進(jìn)行連接，用限制性內(nèi)切酶EcoR I驗(yàn)證片段連接順序，篩選潮霉素抗性基因片段位于 pGAP-ldhL-AOXl片段下游的連接子，得到重組片段pGAP-ldhL-AOXl-chac/ ；(5)重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH I,Hind III將所述重組片段pGAP-ldhL-AOXl-chac/ 插入質(zhì)粒 PCAMB3300，得到重組質(zhì)粒 ρ CAMB3300-pGAP-ldhL-A0Xl-chaoE ；(6)重組根癌膿桿菌的獲得將步驟( 獲得的重組質(zhì)粒ρ CAMB3300pGAP-ldhL-A0Xl-chaoK通過(guò)電擊直接轉(zhuǎn)化根癌膿桿菌LBA4404，涂布含50 μ g/mL的卡那霉素LB平板培養(yǎng)基，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行分子鑒定陽(yáng)性克隆，得到含有重組質(zhì)粒P CAMB3300pGAP-ldhL-A0Xl-chaoE的根癌膿桿菌基因工程菌株，命名為 Agrobacterium tumefaciens LBA4404-pCAMB3300-pGAP-ldhL-A0Xl -chaoE(7)重組米根霉菌株的獲得①將步驟(6)獲得的菌株接種于含卡那霉素、利福霉素和鏈霉素的LB培養(yǎng)基中， 300C，200r/min搖床培養(yǎng)36h，離心收集菌體，用等體積的IM培養(yǎng)基重懸菌體，培養(yǎng)他，使菌細(xì)胞終濃度達(dá)到IO11個(gè)/mL ；所述卡那霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL，所述利福霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL,所述鏈霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為30 μ g/mL ；②將米根霉孢子液接種于YPD固體培養(yǎng)基中，34°C培養(yǎng)7天；用無(wú)菌水洗脫收集新鮮孢子，重懸于用20g/l的無(wú)菌CaCl2水溶液中，使米根霉孢子濃度達(dá)到IO9個(gè)/mL ；取步驟①和②獲得的重懸菌液各50 μ L加入含有乙酰丁香酮、卡那霉素和潮霉素的IM培養(yǎng)基中，在30°C，200r/min培養(yǎng)14h ；稀釋10_6倍，取200 μ L稀釋液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS培養(yǎng)基平板，并置于34°C培養(yǎng)40-50h ；將玻璃紙轉(zhuǎn)接到含有潮霉素的YPD 培養(yǎng)基上培養(yǎng)95h，篩選陽(yáng)性米根霉基因工程菌株，并進(jìn)行基因水平上的分子鑒定，命名為 Rhizopusoryzae CM 08/LDH-，所述乙酰丁香酮在IM培養(yǎng)基中的濃度為200 μ mol/L，卡那霉素在IM培養(yǎng)基中的濃度為50μ g/mL，潮霉素在IM培養(yǎng)基中的濃度為50μ g/mL，所述潮霉素在YPD培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL。實(shí)施例2一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)乳酸脫氫酶基因IdhL的克隆同實(shí)施例1步驟(1)(2)包含真菌啟動(dòng)子序列、反向IdhL基因序列以及終止子序列的重組片段構(gòu)建
同實(shí)施例1步驟O)(3)潮霉素抗性基因的克隆同實(shí)施例1步驟(3)(4)含有抗性基因重組基因片段的構(gòu)建同實(shí)施例1步驟(5)重組質(zhì)粒的構(gòu)建同實(shí)施例1步驟(5)(6)重組根癌膿桿菌的獲得同實(shí)施例1步驟(6)(7)重組米根霉菌株的獲得①將步驟(6)獲得的菌株接種于含卡那霉素、利福霉素和鏈霉素的LB培養(yǎng)基中， 280C，220r/min搖床培養(yǎng)42h，離心收集菌體，用等體積的IM培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)他，使菌細(xì)胞終濃度達(dá)到IO12個(gè)/mL ；所述卡那霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為60 μ g/mL，所述利福霉素在 LB培養(yǎng)基中的濃度為60 μ g/mL,所述鏈霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為40 μ g/mL ；②將米根霉孢子液接種于YPD固體培養(yǎng)基中，33°C培養(yǎng)8天；用無(wú)菌水洗脫收集新鮮孢子，重懸于用20g/l的無(wú)菌CaCl2水溶液中，使米根霉孢子濃度達(dá)到IO8個(gè)/mL ；取步驟①和②獲得的菌液各50 μ L加入含有乙酰丁香酮、卡那霉素和潮霉素的 IM培養(yǎng)基中，在^°C，220r/min培養(yǎng)16h ；稀釋10_6倍，取200 μ L稀釋液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS培養(yǎng)基平板，并置于35°C培養(yǎng)40h ；將玻璃紙轉(zhuǎn)接到含有潮霉素的YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)90h，篩選陽(yáng)性米根霉基因工程菌株，并進(jìn)行基因水平上的分子鑒定，命名為Miizopus oryzae CM08/LDH—，所述乙酰丁香酮在IM培養(yǎng)基中的濃度為200 μ mol/L,卡那霉素在IM培養(yǎng)基中的濃度為50μ g/mL，潮霉素在IM培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL，所述潮霉素在YPD培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL。實(shí)施例3一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)乳酸脫氫酶基因IdhL的克隆同實(shí)施例1步驟(1)(2)包含真菌啟動(dòng)子序列、反向IdhL基因序列以及終止子序列的重組片段構(gòu)建同實(shí)施例1步驟O)(3)潮霉素抗性基因的克隆同實(shí)施例1步驟(3)(4)含有抗性基因重組基因片段的構(gòu)建同實(shí)施例1步驟(5)重組質(zhì)粒的構(gòu)建同實(shí)施例1步驟(5)(6)重組根癌膿桿菌的獲得同實(shí)施例1步驟(6)(7)重組米根霉菌株的獲得①將步驟(6)獲得的菌株接種于含卡那霉素、利福霉素和鏈霉素的LB培養(yǎng)基中，320C，180r/min搖床培養(yǎng)30h，離心收集菌體，用等體積的IM培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)證，使菌細(xì)胞終濃度達(dá)到IO11個(gè)/mL ；所述卡那霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為40 μ g/mL，所述利福霉素在 LB培養(yǎng)基中的濃度為40 μ g/mL,所述鏈霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為20 μ g/mL ；②將米根霉孢子液接種于YPD固體培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)6天；用無(wú)菌水洗脫收集新鮮孢子，重懸于用20g/l的無(wú)菌CaCl2水溶液中，使米根霉孢子濃度達(dá)到IO9個(gè)/mL ；取步驟①和②獲得的菌液各50 μ L加入含有乙酰丁香酮、卡那霉素和潮霉素的IM 培養(yǎng)基中，在32°C，180r/min培養(yǎng)12h ；稀釋10_6倍，取200 μ L稀釋液涂布鋪有玻璃紙的 IM+AS培養(yǎng)基平板，并置于33°C培養(yǎng)50h ；將玻璃紙轉(zhuǎn)接到含有潮霉素的YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)100h，篩選陽(yáng)性米根霉基因工程菌株，并進(jìn)行基因水平上的分子鑒定，命名為lihizopus oryzae CM 08/LDH—，所述乙酰丁香酮在IM培養(yǎng)基中的濃度為200 μ mol/L,卡那霉素在IM 培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL,潮霉素在IM培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL,所述潮霉素在YPD 培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL。實(shí)施例4對(duì)重組菌與野生米根霉菌株發(fā)酵培養(yǎng)，步驟如下將原始的米根霉和新構(gòu)建的Miizopus oryzae CM 08/LDH_菌在下面的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵(1)原始的米根霉菌株，其命名為Rhizopus oryzae CICC 40506 ；(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/l，磷酸二氫鉀0.8g/l，硫酸銨2g/l，硫酸鎂0.6g/l， 硫酸鋅0. 13g/l，硫酸亞鐵0. 01g/l，滅菌完畢用無(wú)菌稀硫酸調(diào)節(jié)初始pH至3. 0用于種子生
長(zhǎng)培養(yǎng)。種子培養(yǎng)500ml三角瓶，裝液量100ml，培養(yǎng)溫度33 °C，孢子接種量 5.0X 107/100ml種子液，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)14h，此為一級(jí)種子液。一級(jí)種子液以 10%接種量接種至新的無(wú)菌培養(yǎng)基成分中培養(yǎng)14h即為二級(jí)種子液；二級(jí)種子液以10%接種量接種至新的無(wú)菌培養(yǎng)基成分中培養(yǎng)14h即為三級(jí)種子液；二、三級(jí)種子培養(yǎng)基組分以及其余各參數(shù)均同一級(jí)種子液。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/l，磷酸二氫鉀0. 8g/l，尿素0. 2g/l，硫酸鎂0. 6g/l， 硫酸鋅0. 13g/l，硫酸亞鐵0. 01g/l，碳酸鈣50g/l。培養(yǎng)條件7L發(fā)酵罐，裝液量4L，接種三級(jí)種子液，接種量10 %，發(fā)酵溫度35。C， 轉(zhuǎn)速 300rpm/min，通空氣策略發(fā)酵 O-Mh lvvm, 24-36h 0. 6vvm, 36-48h Ovvm, 48-60h 0. 6vvm,60-72h lvvm,72h開始之后維持通氣量lwm，大約至72h，發(fā)酵結(jié)束見表1。表1:
權(quán)利要求
1.提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟(1)乳酸脫氫酶基因IdhL的克隆以提取的米根霉細(xì)胞基因組DNA為模板，分別以序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 為上、下游引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出SEQ ID No. 5所示的乳酸脫氫酶IdhL基因序列， 提純，將提純后的乳酸脫氫酶IdhL基因序列與pMDIS-simple-T載體連接，得到重組 pMD18-simpIe-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定，酶切所述重組pMD18_simpIe-T載體，得到包含酶切位點(diǎn)的IdhL基因片段；(2)包含真菌啟動(dòng)子序列、反向IdhL基因序列以及終止子序列的重組片段構(gòu)建利用Not I, Xho I將步驟⑴獲得的片段反向插入到SEQ ID No. 7所示的質(zhì)粒PGAP^啟動(dòng)子的下游，獲得重組質(zhì)粒pGAP^-ldhL，用Bgl II，BamH I酶切重組質(zhì)粒 pGAP^-ldhL，得到包含真菌啟動(dòng)子序列、反向IdhL基因序列以及終止子序列AOXl的重組片段 pGAP-ldhL-AOXl ；(3)潮霉素抗性基因的克隆以SEQ ID No. 8所示的質(zhì)粒pDx-Los為模板，以序列表SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4 為上、下游引物，PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物提純，與pMDIS-simple-T載體連接，得到重組pMD18-simple-T載體，酶切所述重組pMD18-simple-T載體，得到SEQ ID No. 6 所示的包含酶切位點(diǎn)的潮霉素抗性基因片段；(4)含有抗性基因重組基因片段的構(gòu)建將步驟( 獲得的重組片段與步驟C3)獲得的基因片段利用BamH I位點(diǎn)進(jìn)行連接，用限制性內(nèi)切酶EcoR I驗(yàn)證片段連接順序，篩選潮霉素抗性基因片段位于pGAP-ldhL-AOXl 片段下游的連接子，得到重組片段pGAP-ldhL-AOXl-chac/ ；(5)重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH I，Hind III將所述重組片段pGAP-ldhL-AOXl-chac/插入質(zhì)粒 PCAMB3300，得到重組質(zhì)粒 ρ CAMB3300-pGAP-ldhL-A0Xl-chaoE ；(6)重組根癌膿桿菌的獲得將步驟( 獲得的重組質(zhì)粒P CAMB3300pGAP-ldhL-A0Xl-chaoK通過(guò)電擊直接轉(zhuǎn)化根癌膿桿菌LBA4404，涂布含50 μ g/mL的卡那霉素LB平板培養(yǎng)基，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行分子鑒定陽(yáng)性克隆，得到含有重組質(zhì)粒P CAMB3300pGAP-ldhL-A0Xl-chaoE的根癌膿桿菌基因工程菌株，命名為 Agrobacterium tumefaciens LBA4404-pCAMB3300-pGAP-ldhL-A0Xl_chaEO ；(7)重組米根霉菌株的獲得①將步驟(6)獲得的菌株接種于含卡那霉素、利福霉素和鏈霉素的LB培養(yǎng)基中， 28-320C，180-220r/min搖床培養(yǎng)30_4濁，離心收集菌體，用等體積的IM培養(yǎng)基重懸經(jīng)離心后的菌體，培養(yǎng)5-8h，使菌細(xì)胞終濃度達(dá)到IOll-IO12個(gè)/mL ；所述卡那霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為40-60 μ g/mL,所述利福霉素在LB培養(yǎng)基中的濃度為40-60 μ g/mL,所述鏈霉素在 LB培養(yǎng)基中的濃度為20-40 μ g/mL ；②將米根霉孢子液接種于YPD固體培養(yǎng)基中，33-35°C培養(yǎng)6-8天；用無(wú)菌水洗脫收集新鮮孢子，重懸于用20g/l的無(wú)菌CaCl2水溶液中，使米根霉孢子濃度達(dá)到IO8-IO9個(gè)/mL ；取步驟①和②獲得的重懸菌液各50 μ L加入含有乙酰丁香酮、卡那霉素和潮霉素的IM培養(yǎng)基中，在^-32°C，180-220r/min培養(yǎng)12_16h ；稀釋1(Γ6倍，取200 μ L稀釋液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS培養(yǎng)基平板，并置于33-35°C培養(yǎng)40_50h ；將玻璃紙轉(zhuǎn)接到含有潮霉素的YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)90-100h，篩選陽(yáng)性米根霉基因工程菌株，并進(jìn)行基因水平上的分子鑒定，命名為Miizopus oryzae CM 08/LDH—，所述乙酰丁香酮在IM培養(yǎng)基中的濃度為 200 μ mol/L,卡那霉素在IM培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL,潮霉素在IM培養(yǎng)基中的濃度為 50 μ g/mL,所述潮霉素在YPD培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL。
2.權(quán)利要求1的的方法構(gòu)建的一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株Miizopusoryzae CM08/LD!T。
3.權(quán)利要求2的一種提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株在以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了提高富馬酸產(chǎn)量的基因工程菌株及構(gòu)建方法及其應(yīng)用，構(gòu)建方法為(1)乳酸脫氫酶基因ldhL的克??；(2)包含真菌啟動(dòng)子序列、反向ldhL基因序列以及終止子序列的重組片段構(gòu)建；(3)潮霉素抗性基因的克??；(4)含有抗性基因重組基因片段的構(gòu)建；(5)重組質(zhì)粒的構(gòu)建；(6)重組根癌膿桿菌的獲得；(7)重組米根霉菌株的獲得本發(fā)明的菌株在充分好氧條件下利用葡萄糖發(fā)酵高濃度積累富馬酸，與野生米根霉菌株相比，副產(chǎn)物乳酸含量低，生產(chǎn)富馬酸的最終發(fā)酵濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度得到顯著提高，縮短了生產(chǎn)時(shí)間，從而降低了發(fā)酵液中富馬酸的分離難度和分離成本，為微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)生物基來(lái)源的富馬酸奠定了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P7/46GK102559736SQ20121004471
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者萬(wàn)屹東, 尤吉, 朱建國(guó), 王偉, 芮新生, 陸瑾連 申請(qǐng)人:常茂生物化學(xué)工程股份有限公司