專利名稱：同時檢測柑桔4種重要病原的一步法多重pcr檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農業(yè)分子生物領域，具體的說，涉及一種同時檢測柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR檢測方法。
背景技術：
我國目前已確定有5種嫁接傳播病害，包括黃龍病，衰退病，碎葉病，裂皮病和溫州蜜柑萎縮病。由于應用無病毒苗木，溫州蜜柑萎縮病在田間發(fā)生分布很少。柑桔衰退病是柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的一種重要病害,廣泛分布于世界各柑桔產區(qū)，嚴重威脅著世界上以酸橙為砧木的柑桔產區(qū)和對CTV莖陷點株系敏感的葡萄柚、甜橙等品種的安全。柑桔裂皮病是由柑桔裂皮病類病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd)引起的一種世界范圍的重要柑桔病害，是限制我國柑桔產量的一種重要的嫁接傳播性類病毒，主要為害以積、積橙和菜檬作站木的柑桔品種，弓I起站木部樹皮開裂、植株矮化等癥狀，并導致病樹落花落果嚴重，枯枝多，嚴重時全株死亡。柑桔碎葉病是由柑桔碎葉病毒(Citrus tatter-leaf virus, CTLV)引起的一種柑桔病害,主要危害以積及其雜種作砧木的柑桔，我國浙江、廣東、四川和重慶等省市均有此病的發(fā)生。柑桔黃龍病(HLB) 是一種在柑桔生產上危害極其嚴重的類細菌病害，該病的亞洲種病原物為Candidatus liberobacter asiaticus,是我國南部柑桔產區(qū)的毀滅性病害,是國內植物檢疫對象。柑桔這4種重要嫁接傳播病原物在果園中經(jīng)常以兩種或兩種以上病原混合侵染為害，危害輕者可引起樹勢衰退，產量下降，品質變劣；重者可引起成片柑桔樹的死亡，對柑桔高產優(yōu)質生產構成嚴重障礙。傳統(tǒng)的柑桔病毒病和類病毒病檢測方法主要以指示植物鑒定，一般采用Etrog香櫞作為指示植物鑒定CEVd，目前鑒定CTV采用墨西哥來檬和酸橙等5種指示植物，CTLV通常采用臘斯克枳橙作為指示植物進行鑒定，雖然指示植物進行病毒病鑒定沿用至今，但煩瑣耗時。黃龍病病原物上世紀70年代電鏡觀察為診斷黃龍病的重要手段，但電鏡的檢出率較低。目前也有檢測CTV和CTLV潰瘍病病菌的ELISA檢測方法，雖然應用免疫學方法檢出速度快，但特異性和靈敏度相對比較差。而PCR法具有快速、靈敏和準確的特點，作為一種強有力的檢測工具已廣泛應用于各種病害的檢驗與診斷。但常規(guī)PCR技術一次只能檢測一種病原物，如果反應體系中含有兩種以上的病原物，則需進行多次進行PCR，不但操作復雜，而且費用較高。多重PCR(Multiplex PCR)是近幾年興起的一項新技術，該技術在同一反應管內同時加入多對引物，擴增完成后可同時檢測出多種目的核酸片段，滿足同時分析不同DNA序列的需要，它具有高效快捷、高度特異敏感、降低實驗成本、加速實驗進程等優(yōu)點。目前已建立了 CTV、CEVd、CTLV的單一 RT-PCR分子檢測技術，建立了黃龍病的PCR 技術，但尚未見4種重要嫁接傳播病害的一步法多重PCR體系的報道。建立穩(wěn)定靈敏的同時檢測柑桔4種重要嫁接傳播病原一步法多重PCR檢測技術體系，有利于摸清田間4種病害發(fā)生狀況，實施柑桔多種病毒病和類病毒病的高效快速檢測，同時利于加快莖尖嫁接脫毒苗的評價，推進引進品種和推廣苗木的無毒化進程，確保柑桔安全生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、靈敏、準確能同時檢測柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR檢測方法，適合田間樣品的大規(guī)模測定和莖尖嫁接脫毒苗的快速評價。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明選用已經(jīng)報道柑桔嫁接傳播病原的引物對，如下柑桔衰退病毒引物為上游引物5’ -ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3 ’下游引物5’ -TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAA CA-3 ’柑桔裂皮病類病毒引物為上游引物5’ -GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3，下游引物5’ -CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3 ’柑桔碎葉病毒引物為上游引物5’-TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3’下游引物5’-TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’黃龍病病菌引物上游引物5’ -GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3，下游引物5，-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’(RT)-PCR擴增所需試劑如下柑桔衰退病毒引物0. 13ym0l/L，柑桔裂皮病類病毒引物0. 5ymol/L，柑桔碎葉病毒引物0· 16 μ mol/L，黃龍病病菌引物0.4ymol/L，Mg2+ 為 2. 7mmol/L, dNTP 為 O. 5mmol/L,6mM DTT，RT/Taq 酶，2 X RT-PCR Buffer，滅菌去離子水。(RT)-PCR 擴增條件為55°C,30min ；94°C,5min ；94°C,30s ；68°C,80s ;35 個循環(huán)； 68°C,7min0本發(fā)明具體按如下步驟進行I、總核酸提取(I)取樣、研磨由于CTV、CTLV, CEVd和韌皮部桿菌Ca. L. asiaticus在柑桔植株內有各自的分布特點，在進行多重PCR檢測時確定在柑桔植株上的取樣部位對檢測出4種病原至關重要。在柑桔植株內韌皮部桿菌Ca. L. asiaticus在老葉中脈的全年檢出率最高； 在通過蚜蟲以半持久性方式傳播的初侵染柑桔植株內CTV由葉片通過維管系統(tǒng)的韌皮部篩管作長距離轉運，因而在感病植株內病毒的分布是從從莖頂部到莖基部逐步遞減的，特別是在柚類中CTV分布不均勻，應用DTBIA方法檢測，在嫩皮和嫩葉檢測率相對較高；CTLV 和CEVd在皮和葉均可作為取樣部位。因此檢測時應取柑桔植株近基部老葉中脈，同時要取嫩葉的中脈或嫩皮，從同一植株的不同方位取樣，每個樣品重復抽提3次，這樣可以降低這 4種病原的漏檢率，提高檢測的可靠性。取10-15mg皮或葉脈于無菌eppendorf管,液氮研磨；(2)依次加入60 μ L TES緩沖液和60 μ L飽和酚氯仿異戊醇(25 : 24 : I)， 混勻，
(3) 7CTC水浴 5-10min, 12000rpm 離心 5min，(4)吸取40 μ L上清液由Sephadex G-50-80層析柱中，5000rpm離心4min,收集洗脫液，_20°C保存。上述層析柱制備為加少量TNE平衡的玻璃珠到O. 5mL的Eppendorf管底(先用燒紅的細針頭在最底部打孔)再將此管放入2mL離心管中，并向O. 5mL的Eppendorf管內加滿用 TNE 飽和的 Sephdex G-50, 5000rpm,離心 3min,取出 O. 5mL 的 Eppendorf 管置入 I. 5mL 的Eppendorf管中即可制成。2、(RT)-PCR 擴增將I μ L總核酸提取液在94°C變性，冰水浴2min后，加入RT-PCR擴增所需試劑，利用PCR儀進行擴增。(RT) -PCR 擴增所需體系如下2 X RT-PCR Buffer 液 5 μ L，dNTP O. 3 μ L, DTT O. 6yL, MgSO4O. 3 μ L, RT/Taq酶O. 4 μ L，正向引物混合液0. 715 μ L，反向引物混合液 O. 715 μ L,用滅菌去離子水補足體積至10 μ L。體系中含各病原引物終濃度如下柑桔衰退病毒引物0. 13ymol/L，柑桔裂皮病類病毒引物0. 5μπι01/1，柑桔碎葉病毒引物0. 16μπι01/1，黃龍病病菌引物0.4μπιΟ1/ L,內參泛素基因引物0. 24 μ mol/L。(RT)-PCR 擴增條件為55°C,30min ；94°C,5min ；94°C,30s ；68°C,80s ;35 個循環(huán)； 68°C,7min ；3、PCR產物電泳檢測取5 μ LPCR產物與3 μ L染料相混合，在室溫下進行I. 5%水平瓊脂糖恒壓凝膠電泳。電泳條件為初始電壓150V，5min ;后續(xù)電壓100V，30min。電泳完畢后EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀測電泳結果。4、電泳結果分析柑桔裳退病毒引物、柑桔裂皮病類病毒、柑桔碎葉病毒和黃龍病病菌分別擴增出 511bp、371bp、309bp和1160bp的片段，及內參基因194bp，與分別用單一的引物擴增的序列大小相符合，見附圖I。對PCR產物用PCR產物純化試劑盒分別切膠回收，純化產物經(jīng)過測序預處理后,送基因公司測序，使用NCBI的BLAST登錄序列進行同源性比對分析，均為特異基因片段。5、多重(RT)-PCR靈敏度的測試分別用超純水10倍梯度稀釋總核酸模板，各取I μ L作模板檢測(RT)-PCR的靈敏度，結果顯示可以從稀釋10倍的總核酸中擴增出CEV，可以從稀釋IO2倍的總核酸中擴增出CTV，多重PCR與單一 PCR具有相同的檢測靈敏度。測試模板為柑桔衰退病毒和柑桔裂皮病毒結果顯示模板稀釋10倍均可擴增出特異性片段，見附圖2。有益效果本發(fā)明能同時檢測柑桔4種重要嫁接傳播病原，快速準確，避免了常規(guī) PCR的重復檢測。檢測的穩(wěn)定性好，特異性強，一致性高，適用于大規(guī)模推廣，實現(xiàn)了柑桔多種病毒病和類病毒病的高效快速檢測，有利于摸清田間4種病害發(fā)生狀況，同時利于加快莖尖嫁接脫毒苗的評價，推進引進品種和推廣苗木的無毒化進程，確保柑桔安全生產。


圖I為一步法多重PCR電泳圖譜。M100bp DNA分子量標準；1 :4種病原核酸抽提混合液；2 :黃龍病病菌；3 :柑桔裳退病毒；4 :柑桔裂皮病類病毒；5 :柑桔碎葉病毒；6 :陰性對照。圖2為多重PCR靈敏度測試分析的電泳圖譜。M IOObp DNA分子量標準；1_4 10
倍梯度稀釋。圖3為隨機采取的田間樣品進行多重PCR電泳圖譜。M :IOObp DNA分子量標準； I :4種病原核酸抽提混合液；15 :陰性對照；16 :水對照，其余為隨機采取的田間樣品。
具體實施例方式本發(fā)明同時檢測柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR檢測方法如下I、核酸提取(I)從江西、云南、湖南、浙江、重慶、廣東、廣西等地方采摘的柑桔樣品，隨機選取了 13種樣品，每樣取10-15mg皮和葉脈于無菌eppendorf管,液氮研磨；(2)依次加入60 μ L TES緩沖液和60 μ L飽和酚氯仿異戊醇(25 : 24 : I)， 混勻，(3) 7CTC 水浴 8min, 12000rpm 離心 5min，(4)吸取40 μ L上清液由Sephadex G-50-80層析柱中，5000rpm離心4min,收集洗脫液，_20°C保存。上述層析柱制備為加少量TNE平衡的玻璃珠到O. 5mL的Eppendorf管底(先用燒紅的細針頭在最底部打孔)再將此管放入2mL離心管中，并向O. 5mL的Eppendorf管內加滿用 TNE 飽和的 Sephdex G-50, 5000rpm,離心 3min,取出 O. 5mL 的 Eppendorf 管置入 I. 5mL 的Eppendorf管中即可制成。2、(RT)-PCR 擴增將I μ L總核酸提取液在94°C變性，冰水浴2min后，加入RT-PCR擴增所需試劑，利用PCR儀進行擴增。(RT)-PCR擴增所需體系如下柑桔衰退病毒引物0. 13ymol/L，柑桔裂皮病類病毒引物0. 5ymol/L，柑桔碎葉病毒引物0. 16 μ mol/L，黃龍病病菌引物0. 4ymol/L，內參基因引物0. 24 μ mol/L, Mg2+ 為 2. 7mmol/L,dNTP 為 0. 5mmol/L,DTT 6mM,2XPCR buffer 5. 0 μ L, RT/Taq為0. 4 μ L,用滅菌去離子水補足體積至10 μ L。(RT)-PCR 擴增條件為55°C,30min ；94°C,5min ；94°C,30s ；68°C,80s ;35 個循環(huán)； 68°C,7min ；3、PCR產物電泳檢測取5μ L PCR產物與3 μ L染料相混合，在室溫下進行I. 5%水平瓊脂糖恒壓凝膠電泳。電泳條件為初始電壓150V，5min ;后續(xù)電壓100V，30min。電泳完畢后EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀測電泳結果，見附圖3。
權利要求
1.一種同時檢測柑桔4種重要病原的一步法多重PCR檢測方法，4種重要嫁接傳播病原包括柑桔裳退病毒，柑桔裂皮病類病毒，柑桔碎葉病毒，柑桔黃龍病菌，其特征在于提取柑桔樣品總核酸，選用4種病原的特異引物，對待測樣品進行(RT)-PCR擴增，同時設計了泛素基因引物序列，體系中設置了泛素基因作為內參基因，最后電泳鑒定1)根據(jù)泛素基因保守序列區(qū)域設計特異引物UBQ-F: GATCTTCGCCTTAACGTTGTCAAT， UBQ-R GTTGATTTTTGCTGGGAAGCA,作為內參基因，2)所述(RT)-PCR擴增所需試劑如下柑桔衰退病毒引物0.13μπι01/1，柑桔裂皮病類病毒引物0. 5ymol/L，柑桔碎葉病毒引物0. 16 μ mol/L，黃龍病病菌引物0. 4ymol/L， 內參泛素基因引物0. 24 μ mol/L, Mg2+為 2. 7mmol/L, dNTP 為 O. 5mmol/L,6mM DTT，RT/Taq 酶，2 X RT-PCR Buffer，滅菌去離子水。(RT) -PCR 擴增條件為55 °C，30min ；94 °C，5min ；94 °C，30s ；68 °C，80s ;35 個循環(huán)； 68°C,7min0
2.根據(jù)權利要求I所述的一種同時檢測柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR 檢測方法，其特征在與所述提取樣品總核酸，樣品不僅取柑桔植株近基部老葉中脈，同時還應取嫩葉的中脈或嫩皮，并且同一植株的不同方位取樣。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種同時檢測柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR 檢測方法，其特征在于所述柑桔衰退病毒引物為上游引物5’ -ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3’下游引物5’ -TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAA CA-3’所述柑桔裂皮病類病毒引物為上游引物5’ -GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3，下游引物5’ -CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3’所述柑桔碎葉病毒引物為上游引物5 ’ -TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3，下游引物5’ -TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’所述黃龍病病菌引物上游引物5 ’ -GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3，下游引物5’ -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’
4.根據(jù)權利要求I或3所述的一種同時檢測柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR檢測方法，其特征在于電泳得到的特異性片段大小為柑桔衰退病毒為511bp，柑桔裂皮病類病毒為371bp，柑桔碎葉病毒為309bp，柑桔黃龍病菌為1160bp，內參泛素基因為 194bp0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時檢測柑桔4種重要病原的一步法多重PCR檢測方法，通過對4種重要嫁接傳播病原柑桔衰退病毒，柑桔裂皮病類病毒，柑桔碎葉病毒，柑桔黃龍病菌的引物優(yōu)選，以及對引物濃度，PCR擴增條件等的優(yōu)化，實現(xiàn)了同時檢測柑桔4種重要嫁接傳播病原。本發(fā)明檢測方法快速準確，避免了常規(guī)PCR的重復檢測，檢測的穩(wěn)定性好，特異性強，一致性高，適用于大規(guī)模推廣，可以用于指導引進品種和推廣苗木的無毒化，確保柑桔安全生產。
文檔編號C12Q1/70GK102586481SQ20121004601
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權日2012年2月27日
發(fā)明者劉金香, 周常勇, 唐科志, 李中安, 王雪峰 申請人:中國農業(yè)科學院柑桔研究所