專利名稱：提供疾患特異性結(jié)合分子和靶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及識別蛋白的疾患相關(guān)表位(包括新表位)的新的特異性結(jié)合分子， 特別是人抗體及其片段、衍生物和變體，所述蛋白來自天然的內(nèi)源蛋白，并且在患者體內(nèi)以變體形式和/或脫離其正常生理環(huán)境普遍存在。另外，本發(fā)明涉及包含此類結(jié)合分子、抗體及其模擬物的藥物組合物和篩選治療各種疾病、特別是神經(jīng)疾病(諸如阿爾茨海默病、淀粉樣蛋白病和￠-淀粉樣蛋白病變)的新的結(jié)合分子(可以是或可以不是抗體)、靶和藥物的方法。
背景技術(shù)：
成功產(chǎn)生單克隆抗體依賴于抗原刺激的B細胞與鼠骨髓瘤細胞系的有效和選擇性融合，然后選擇產(chǎn)生雜交體的穩(wěn)定的抗體，最初描述于K 0 hler和Milstein，Nature 256 (1975)，495-497。然而，鑒于其非人來源，基于鼠的抗體在人中的治療效用受限于人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。通過遺傳工程可獲得用于制備人或類人單克隆抗體的方法。然而，迄今可用的方法具有以下缺點它們不適合用來產(chǎn)生具有在生理的人類免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的抗體的特征的抗體。此外，由于在具有正常生理功能的情況下與其他蛋白和/或靶蛋白的交叉反應(yīng)性，此類抗體可能不夠特異。例加，在阿爾茨海默病或帕金森病中，認為還以高親和力與淀粉樣前體蛋白(APP )或a突觸核蛋白的生理衍生物交叉反應(yīng)的抗體表現(xiàn)出與生理靶結(jié)構(gòu)的正常功能相關(guān)的副作用。在這方面，不希望的自身免疫病將完全被誘導(dǎo)一一種在采用生理上也存在變體形式的蛋白結(jié)構(gòu)的主動免疫實驗的方案設(shè)計中幾乎不可估算的危險。與靶結(jié)構(gòu)無關(guān)的副作用是例如過敏反應(yīng)，其被預(yù)期為系統(tǒng)性施用外源蛋白的不希望的和可怕的副作用。根據(jù)近來的發(fā)現(xiàn)，在最初來自非人生物(通常來自小鼠)的所謂人源化抗體中也能發(fā)生這種情況。另一方面，病理相關(guān)抗原的主動免疫具有相當(dāng)大的患者發(fā)展也識別此類蛋白的生理變體的抗體和T細胞應(yīng)答的危險，并且因此導(dǎo)致危險的和不可控制的自身免疫應(yīng)答。因此，需要提供特異于疾病涉及的靶并被人體耐受的物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個目的是一種用于鑒定、驗證和產(chǎn)生診斷上和治療上有用的結(jié)合分子，特別是針對內(nèi)源蛋白的病理變體的抗體的方法。更具體地，本發(fā)明涉及分離疾患相關(guān)蛋白特異性結(jié)合分子的方法，其包括(a)使獲自無癥狀，或臨床上異常穩(wěn)定，但患有疾病或處于發(fā)展疾病危險的患者的樣品經(jīng)受具有預(yù)定病理特征的病理改變的細胞或組織的試樣；和
(b)鑒定并任選地分離與所述試樣結(jié)合，但不與可來自健康對象的沒有此類病理特征的對應(yīng)細胞或組織結(jié)合的結(jié)合分子。已知的事實是，在自身免疫病中，抗體針對自體細胞和由所述細胞表達的蛋白或諸如糖脂的其他化合物，同時避開已知的耐受機制。同樣已知的事實是，在內(nèi)源贅生性發(fā)展中，贅生性細胞的細胞和體液免疫可發(fā)展，并且因此可影響針對贅生性組織變性的內(nèi)源免
疫保護機制。本發(fā)明利用抗體也可針對內(nèi)源蛋白的病理生理相關(guān)變體，特別是針對新表位的驚人發(fā)現(xiàn)，所述新表位是由于病理改變的轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄后或翻譯后修飾、或蛋白酶解加工、或聚集而形成的。此類抗體針對由于其偏離正常生理的新結(jié)構(gòu)通過發(fā)展病理效應(yīng)而變得與病理生理相關(guān)的內(nèi)源蛋白。然而，由于免疫耐受，在此類病理變體中與對新表位的對應(yīng)免疫應(yīng)答有關(guān)的抗體未正常表現(xiàn)出針對生理功能性蛋白的任何交叉反應(yīng)，這與自身免疫病中的情況相反。這是因為潛在交叉反應(yīng)性抗體的形成被已知的耐受機制特異地抑制， 而對病理新表位的免疫應(yīng)答的發(fā)展可逃避耐受。因此，本發(fā)明涉及通過與可識別病理結(jié)構(gòu)的相互作用而從臨床上預(yù)選的人類對象中鑒定診斷上、治療上和預(yù)防上有活性的結(jié)合分子，特別是抗體和抗體片段的新方法。因此，本發(fā)明涉及能識別疾患相關(guān)蛋白的表位(包括新表位)的抗體或抗原結(jié)合片段和相似的抗原結(jié)合分子，所述疾患相關(guān)蛋白來自天然的內(nèi)源蛋白，并且在患者體內(nèi)以變體形式(例如作為病理蛋白)和/或脫離其正常生理環(huán)境普遍存在。此外，本發(fā)明涉及包含所述抗體的組合物，以及使用該組合物的免疫治療和免疫診斷方法。此外，在抗體鑒定中，根據(jù)本發(fā)明的方法可無需事先假設(shè)其分子靶結(jié)構(gòu)的身份，而只是通過其與病理相關(guān)結(jié)構(gòu)的結(jié)合來執(zhí)行。除了因此可能鑒定迄今未知的、特定疾患的分子靶結(jié)構(gòu)外，專門針對病理結(jié)構(gòu)的抗體的進一步優(yōu)勢基于它們的藥物動力學(xué)有效性不受與非疾患組織結(jié)合以使抗體的濃度和吸收效應(yīng)被緩沖因此妨礙治療有效濃度的確定的方式負面影響的事實。此外，本發(fā)明的抗體和結(jié)合分子優(yōu)選特征在于它們分別在體內(nèi)與疾患相關(guān)蛋白的變體形式或與細胞或細胞膜反應(yīng)，并且在具有病理特征的疾患組織的切片上，但不與或顯著更少程度地與同族蛋白的生理變體反應(yīng)；還參見，例如，實施例2。由于本發(fā)明允許在疾患細胞和組織中鑒定和分離分子靶結(jié)構(gòu)，進一步的實施方案分別涉及由本發(fā)明的新表位特異抗體結(jié)合的抗原和病理蛋白(即疾患相關(guān)蛋白)。特別優(yōu)選的實施方案是證明特征為下文表2和3所述的可變區(qū)Vh和/或\ 的任一抗體的免疫結(jié)合特征的人抗體或其抗原結(jié)合片段?？蛇x地，抗體是人源化、異源、或嵌合人一鼠抗體，后者特別用于動物的診斷方法和研究。包括抗體或其活性片段、或激動劑和同族分子、或可選地(alternately)其拮抗劑的治療性組合物、此類組合物在使用這些組合物預(yù)防、診斷或治療疾患中的用途方法也包括在本發(fā)明中，其中將有效量的組合物施用于需要此類治療的患者。抗體的抗原結(jié)合片段可以是單鏈Fv片段、F(ab’)片段、F(ab)片段和F(ab’)2 片段、或任何其他抗原結(jié)合片段。在下文特定的實施方案中，抗體或其片段是人IgG同種型抗體。自然地，本發(fā)明分別擴展至產(chǎn)生具有下文限定的特殊和獨特特征的抗體的永生化人類B記憶淋巴細胞和B細胞。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的抗體的免疫球蛋白鏈的至少可變區(qū)的多核苷酸。 優(yōu)選地，所述可變區(qū)包括下文表2和3所述的Vh和/或\可變區(qū)的至少一個互補決定區(qū) (OTR)。⑶R的對應(yīng)組在下文表4中給出。相應(yīng)地，本發(fā)明還包括包含所述多核苷酸的載體和用其轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及它們用于產(chǎn)生特異于指示和/或引起疾病(特別是腦疾病，諸如阿爾茨海默病和帕金森病)的新表位的抗體和等效結(jié)合分子的用途?？贵w、免疫球蛋白鏈、其結(jié)合片段和與所述抗體結(jié)合的抗原可分別用在藥物組合物和診斷組合物中用于免疫治療和診斷。然而前述組合物在制備藥劑中的用途是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明的特定目的是提供用于治療或預(yù)防特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中蛋白的異常積累和/或沉積并且不干擾相應(yīng)蛋白的天然功能的神經(jīng)疾病的方法。該方法包括將有效濃度的抗體或抗體衍生物施用于對象，其中抗體與蛋白的病理形式或蛋白沉積物的結(jié)合親和力顯著高于與蛋白的正常生理形式的結(jié)合親和力。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防或減緩對象中與淀粉樣蛋白P肽的積累和沉積相關(guān)疾患的發(fā)病的方法，所述疾患諸如阿爾茨海默病、唐氏綜合征、輕度認知損害、腦淀粉樣蛋白血管病、血管性癡呆、多發(fā)性梗死性癡呆。該方法包括將有效濃度的抗體或抗體衍生物施用于對象，其中抗體與蛋白的病理形式或蛋白沉積物的結(jié)合親和力高于與蛋白的正常生理形式的結(jié)合親和力。相似的治療性方法預(yù)計用于治療帕金森病、亨廷頓病、克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、囊性纖維化、高雪病(Gaucher’s disease)和類似疾病。根據(jù)以下的說明書，本發(fā)明的其他實施方案將是明顯的。附圖簡述
圖I:針對￠-淀粉樣蛋白的抗體。A:人抗體。B :用針對人￠-淀粉樣蛋白的已知抗體的對照染色?；加邪柎暮Ｄ〉呐R床上異常穩(wěn)定的患者含有針對￠-淀粉樣蛋白斑塊的抗體。用來自臨床上異常穩(wěn)定的患者的抗體對獲自患有病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學(xué)染色揭示了與由針對人￠-淀粉樣蛋白的已知抗體確認的淀粉樣蛋白斑塊結(jié)合的抗體。圖2 :針對神經(jīng)原纖維纏結(jié)的抗體。A:人抗體。B:用針對人tau的已知抗體的對照染色。健康的人類對象含有針對神經(jīng)原纖維纏結(jié)的抗體。用來自健康對象的抗體對獲自患有病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學(xué)染色揭示了與由針對人tau的已知抗體確認的神經(jīng)原纖維纏結(jié)結(jié)合的抗體。圖3 :針對營養(yǎng)不良性軸突的抗體。A:人抗體。B:用針對人tau的已知抗體的對照染色。健康的人類對象含有針對營養(yǎng)不良性軸突的抗體。用來自健康對象的抗體對獲自患有病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學(xué)染色揭示了與營養(yǎng)不良性軸突結(jié)合的抗體。圖4 :針對0 -淀粉樣蛋白的抗體。該圖顯示從臨床上異常穩(wěn)定的阿爾茨海默病患者中分離的重組人NI-101.11抗體與腦￠-淀粉樣蛋白斑塊的特異性結(jié)合。獲自患有神經(jīng)病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片用指示濃度的重組人抗體染色。50 pM 濃度的抗體與P-淀粉樣蛋白斑塊的結(jié)合暗示了高親和力的結(jié)合。圖5 :線性的合成N-末端A ^多肽不競爭重組人NI-101. 11抗體與P -淀粉樣蛋白斑塊的結(jié)合。代表位置I至16的可達I PM濃度的N-末端A ￠-衍生多肽不能競爭針對腦￠-淀粉樣蛋白的重組抗體(0.5 nM)的結(jié)合。圖6 :重組人NI-101. 11抗體識別單體A P中不存在的構(gòu)象A P表位。A ^ 1-42原纖維而不是線性的合成A ^ 1-42單體可競爭腦切片上NI-101. 11與P -淀粉樣蛋白斑塊的結(jié)合。圖7 :蛋白質(zhì)印跡上重組人NI-101. 11抗體不與線性、單體的合成A @結(jié)合。 單體A ^制品通過非變性PAGE分離。印跡蛋白用針對￠-淀粉樣蛋白的人重組抗體和針對N-末端線性A ^序列的對照抗體(6E10)來探測。沒有檢測到NI-101. 11與單體A ^ 的結(jié)合。這一觀察暗示該抗體識別構(gòu)象A ^表位。圖8 :人NI-101. 11抗體結(jié)合從合成的A ^ 1-42肽制備的人工淀粉樣蛋白原纖維。以同樣包被密度包被于ELISA板上的合成的A ^原纖維或單體的合成A ^與指示濃度的針對腦￠-淀粉樣蛋白的重組人抗體一起孵育。針對腦￠-淀粉樣蛋白的人抗體與人工淀粉樣蛋白原纖維的結(jié)合活性(空心方塊)比單體A ^ (實心方塊)高100多倍。對照抗體22C4優(yōu)先與單體A ^ (實心圓圈)結(jié)合，而與原纖維(空心圓圈)結(jié)合得不太好。這暗示NI-101.11識別也存在于從合成的A ^肽制備的人工淀粉樣蛋白原纖維上的構(gòu)象表位。圖9 :重組人NI-101. 11抗體與細胞全長APP或者存在于培養(yǎng)細胞中的任何其生理衍生物沒有交叉反應(yīng)性。與結(jié)合細胞表面APP的對照抗體(6E10)相反，NI-101. 11 不與存在于細胞表面的全長APP結(jié)合。這些數(shù)據(jù)說明NI-101. 11與生理的細胞全長APP沒有交叉反應(yīng)性。

圖10A-C:通過大小排阻層析NI-101. 11不與單體A P結(jié)合。圖IOA和IOB 顯示NI-101. 11或不相關(guān)的對照抗體不與單體FITC-標(biāo)記的A ^ 1-42結(jié)合，而圖IOC顯示識別存在于A P的C-末端的線性表位的抗體22C4的顯著結(jié)合。圖11:競爭性ELISA顯示與過量濃度的單體AP肽預(yù)孵育后，抗體6E10 (針對A P的N-末端的線性表位的抗體)的結(jié)合可被完全阻抑，而與過量濃度的這些單體A ^ 肽制品的預(yù)孵育沒有破壞NI-101. 11的結(jié)合。圖12 =NI-IOl. 13A和NI-101. 13B與獲自阿爾茨海默病的Tg2676轉(zhuǎn)基因小鼠模型的腦切片的結(jié)合。圖13: ELISA顯示與單體A P相比，NI-101. 13A和NI-101. 13B優(yōu)先結(jié)合人
工淀粉樣蛋白原纖維。圖14A-B:圖14A顯示ELISA中重組NI-101. 12與合成的A3 1_42肽的結(jié)合。 圖14B顯示過量的A P 1-42肽競爭NI-101. 12的結(jié)合。圖15:在阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，針對腦淀粉樣蛋白的重組人NI-101. 11抗體穿越血腦屏障,并在體內(nèi)與腦P -淀粉樣蛋白斑塊結(jié)合。圖16A-B :在阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，重組人NI-101. 11抗體改善了異常認知行為。24個月大的arcAP小鼠每周用3 mg/kg抗體i. p.治療2個月。在治療完成之前和之后進行Y-迷宮行為測試。
圖17:通過外周施用NI-101. 11的淀粉樣蛋白斑塊的血腦屏障穿透和修飾( decoration)。在NI-101. 11治療小鼠中(左圖)，NI-101. 11可穿越血腦屏障，并與￠-淀粉樣蛋白沉積物結(jié)合，而在用人對照抗體治療的動物中(右圖)，沒有此類染色可見。在系統(tǒng)性治療兩個月之后，重組人NI-101. 11抗體減少了腦￠-淀粉樣蛋白斑塊的負載。圖18:用NI- 101. 11的被動免疫減少了 arcAP小鼠中P _淀粉樣蛋白的負載。(A，B)硫代黃素S和剛果紅斑塊負載分析揭示了與對照抗體治療的動物相比超過50%的顯著減少(曼-惠特尼U; ThioS:皮層p=0. 02，海馬p=0. 009，和剛果紅分析皮層p=0.009， 海馬p=0. 04)。比例尺200 u m。(C-E)硫代黃素S分析揭示了與對照治療的動物相比， NI-101. 11治療的arcAP小鼠中￠-淀粉樣蛋白負荷(C)、P -淀粉樣蛋白斑塊的數(shù)目⑶ 和平均斑塊大小(E)的顯著減少。曼-惠特尼U統(tǒng)計皮層斑塊面積p=0. 02;海馬斑塊面積p=0. 009;皮層斑塊數(shù)目p=0. 047 ;海馬斑塊數(shù)目p=0. 047 ;皮層斑塊大小p=0. 009;海馬斑塊數(shù)目P=O. 009。圖19:減少的P -淀粉樣蛋白負載伴隨著減少的星形膠質(zhì)細胞增生和小膠質(zhì)細胞增生。A)抗GFAP染色的定量揭示，當(dāng)與對照治療的轉(zhuǎn)基因動物相比時，NI-101. 11治療的arcAP小鼠皮層中反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞數(shù)目的顯著減少。B) Iba-I染色的定量顯示在 NI-101. 11治療的小鼠皮層和海馬中傾向于減少數(shù)目的活化小膠質(zhì)細胞。比例尺200 iim。圖20:用重組人NI-101. 11抗體治療兩個月后，腦微出血沒有增加?；加幸炎C實的塊狀嗜剛果紅淀粉樣蛋白血管病的24個月大的arcAP小鼠每周用3 mg/kg抗體i.p.治療2個月。arcAP小鼠腦微出血的代表圖片由Perl氏普魯士藍染色顯示(左側(cè))。定量分析說明與其野生型同窩小鼠相比，arcA^轉(zhuǎn)基因小鼠中顯著增加的微出血( micorhemorrhages)頻率。用NI-101. 11的慢性治療沒有導(dǎo)致微出血(micorhemorrhages) 頻率的增加。比例尺20iim。圖21:重組人NI-101. 11抗體在體外抑制合成的AP原纖維的形成。重組人 NI-101.11抗體對AP原纖維形成的影響通過熒光分析測量與聚集的AP結(jié)合的硫代黃素 S來測定。圖22 BV-2小膠質(zhì)細胞中抗體-介導(dǎo)的劑量依賴性的FITC-A ^ 1-42原纖維的吞噬作用在抑制了清除受體系統(tǒng)后測量。NI-101. 11觸發(fā)強有力的劑量依賴性的Fcy受體-介導(dǎo)的AP原纖維的吞噬作用。發(fā)明詳述
I.定義
應(yīng)注意，術(shù)語“一個(a) ”或“一個(an)"實體指一個或多個該實體；例如，“一個抗體(an antibody)”理解為代表一個或多個抗體。因此，術(shù)語“一個(a)”(或“一個 (an) ”)、“一個或多個”和“至少一個”在本文可互換使用。如本文所用，術(shù)語“多肽”預(yù)期包括單個“多肽(polyp印tide) ”以及兩個以上“多肽(polyp印tides)”，并且指主要由通過酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術(shù)語“多肽”指兩個或多個氨基酸的任一條或幾條鏈，并且不指特定長度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或用來指兩個或多個氨基酸的一條或幾條鏈的任何其他術(shù)語都包括在定義“多肽”內(nèi)，并且術(shù)語“多肽”可代替或與任何這些術(shù)語互換使用。
術(shù)語“多肽”也意指多肽的表達后修飾產(chǎn)物，包括但不限于已知保護/封閉基團的糖基化、乙?；⒘姿峄?、酰胺化、衍生化、蛋白酶剪切、或非天然存在的氨基酸的修飾。多肽可來自天然生物來源或通過重組技術(shù)產(chǎn)生，但不是必然地從指定的核酸序列翻譯而來。多肽可以任何方式產(chǎn)生，包括通過化學(xué)合成。本發(fā)明的多肽的大小可以是約3個或更多、5個或更多、I 0個或更多、20個或更多、25個或更多、50個或更多、75個或更多、100個或更多、200個或更多、500個或更多、 1000個或更多、2000個或更多個氨基酸。多肽可以具有確定的三維結(jié)構(gòu)，盡管它們不必然地具有這樣的結(jié)構(gòu)。具有確定三維結(jié)構(gòu)的多肽被稱為折疊的，而不具有確定三維結(jié)構(gòu)而是可采用多種不同構(gòu)象的多肽被稱為未折疊的。如本文所用，術(shù)語糖蛋白指與通過氨基酸殘基(例如，絲氨酸殘基或天冬酰胺殘基)的含氧或含氮側(cè)鏈與蛋白相連的至少一個碳水化合物部分偶聯(lián)的蛋白?！胺蛛x”多肽或其片段、變體或衍生物意指不處于其天然環(huán)境的多肽。不需要特定水平的純化。例如，分離多肽可從其天然或自然環(huán)境脫離。為了本發(fā)明的目的，在宿主細胞中表達的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白被認為是分離的，通過任何適合的技術(shù)而分離、分級分離、或部分或基本純化的天然或重組多肽也被認為是分離的。本發(fā)明的多肽還包括前述多肽的片段、衍生物、類似物或變體及其任何組合。 當(dāng)指本發(fā)明的抗體或抗體多肽時，術(shù)語“片段”、“變體”、“衍生物”和“類似物”包括保留對應(yīng)的天然結(jié)合分子、抗體或多肽的抗原結(jié)合特性的至少一些的任何多肽。本發(fā)明的多肽片段包括蛋白水解片段和缺失片段，以及在本文其他地方討論的特定抗體片段。本發(fā)明的抗體和抗體多肽的變體包括上述片段，還包括由于氨基酸置換、缺失或插入而具有改變的氨基酸序列的多肽。變體可以天然存在或者是非天然存在的。非天然存在的變體可使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。變體多肽可包含保守或非保守的氨基酸置換、缺失或添加。新表位特異性結(jié)合分子(例如本發(fā)明的抗體和抗體多肽)的衍生物是已被改變以便表現(xiàn)出未發(fā)現(xiàn)于天然多肽的其他特點的多肽。實例包括融合蛋白。變體多肽在本文也稱為“多肽類似物”。如本文所用，結(jié)合分子或其片段、抗體或抗體多肽的“衍生物”指具有通過功能性側(cè)基的反應(yīng)而化學(xué)衍生化的一個或多個殘基的主題多肽?！把苌铩边€包括含有20種標(biāo)準氨基酸的一種或多種天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羥脯氨酸可置換脯氨酸； 5-羥賴氨酸可置換賴氨酸；3_甲基組氨酸可置換組氨酸；同型絲氨酸可置換絲氨酸；鳥氨酸可置換賴氨酸。術(shù)語“多核苷酸”預(yù)期包括單個核酸以及兩個以上的核酸，并且指分離核酸分子或構(gòu)建體，例如，信使RNA (mRNA)或質(zhì)粒DNA ( pDNA)。多核苷酸可包含常規(guī)的磷酸二酯鍵或非常規(guī)的鍵(例如，酰胺鍵，諸如發(fā)現(xiàn)于肽核酸(PNA)中)。術(shù)語“核酸”指存在于多核苷酸的任一個或多個核酸區(qū)段，例如，DNA或RNA片段?！胺蛛x”核酸或多核苷酸意指從其天然環(huán)境脫離的核酸分子(DNA或RNA)。例如，為了本發(fā)明的目的，包含于載體中的編碼抗體的重組多核苷酸被認為是分離的。分離多核苷酸的其他實例包括保持于異源宿主細胞中的重組多核苷酸或溶液中的純化(部分或基本純化的)多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明的多核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的分離多核苷酸或核酸進一步包括合成產(chǎn)生的此類分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括調(diào)節(jié)元件，諸如啟動子、核糖體結(jié)合位點、或轉(zhuǎn)錄終止子。
如本文所用，“編碼區(qū)”是由翻譯成氨基酸的密碼子組成的核酸的一部分。盡管“終止密碼子”(TAG、TGA或TAA)不翻譯成氨基酸，其可被認為是編碼區(qū)的一部分，但是例如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子以及類似序列的任何側(cè)翼序列不是編碼區(qū)的一部分。本發(fā)明的兩個或多個編碼區(qū)可存在于單個多核苷酸構(gòu)建體中(例如，在單個載體上)，或在分開的多核苷酸構(gòu)建體中(例如，在分開的(不同的)載體上)。此外，任何載體可含有單個編碼區(qū)，或可包含兩個或多個編碼區(qū)，例如，單個載體可分別編碼免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)。另外，本發(fā)明的載體、多核苷酸、或核酸可編碼與編碼結(jié)合分子、抗體、或其片段、變體、或衍生物的核酸融合或不融合的異源編碼區(qū)。異源編碼區(qū)包括但不限于特定的元件或基序，諸如分泌信號肽或異源功能性結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情況中，包含編碼多肽的核酸的多核苷酸正?？砂▎幼雍?或可操作地與一個或多個編碼區(qū)相連的其他轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件?？刹僮鬟B接是基因產(chǎn)物(例如，多肽)的編碼區(qū)與一個或多個調(diào)節(jié)序列以使基因產(chǎn)物的表達置于調(diào)節(jié)序列的影響或控制下的方式相連。如果啟動子功能的誘導(dǎo)引起編碼需要的基因產(chǎn)物的mRNA的轉(zhuǎn)錄，以及如果兩個DNA片段之間的鍵合性質(zhì)不干擾表達調(diào)節(jié)序列指引基因產(chǎn)物表達或不干擾DNA模板被轉(zhuǎn)錄的能力，那么兩個DNA片段(諸如多肽編碼區(qū)和與其結(jié)合的啟動子)是“可操作連接”。因此，如果啟動子能影響該核酸的轉(zhuǎn)錄，那么啟動子區(qū)將與編碼多肽的核酸可操作連接。啟動子可以是指引DNA僅在預(yù)定細胞中基本轉(zhuǎn)錄的細胞特異性啟動子。除啟動子外，其他轉(zhuǎn)錄控制元件(例如增強子、操縱子、阻遏子和轉(zhuǎn)錄終止信號)可與多核苷酸可操作地連接以指引細胞特異性轉(zhuǎn)錄。適合的啟動子和其他轉(zhuǎn)錄控制區(qū)公開于本文。多種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。這些轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括但不限于在脊椎動物細胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，諸如但不限于，來自巨細胞病毒(即時早期啟動子，連同內(nèi)含子-A)、猿猴病毒40 (早期啟動子)、和反轉(zhuǎn)錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒)的啟動子和增強子區(qū)段。其他轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括來自脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱激蛋白、牛生長激素和兔￠-珠蛋白)的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，以及能在真核細胞中控制基因表達的其他序列。其他適合的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動子和增強子，以及淋巴因子誘導(dǎo)型啟動子(例如， 可由干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動子)。相似地，多種翻譯控制元件對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。這些翻譯控制元件包括但不限于核糖體結(jié)合位點、翻譯起始和終止密碼子和來自小RNA病毒的元件(特別是內(nèi)部核糖體進入位點或IRES，也稱為CITE序列)。在其他實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式。本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)可與編碼指引由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的分泌的分泌或信號肽的其他編碼區(qū)締合。根據(jù)信號假說，哺乳動物細胞分泌的蛋白具有信號肽或分泌前導(dǎo)序列，一旦正在生成的蛋白鏈起始了穿過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輸出，信號肽或分泌前導(dǎo)序列從成熟蛋白上切下。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解，脊椎動物細胞分泌的多肽一般具有與多肽的N-末端融合的信號肽，信號肽從完整或“全長”多肽上切下以產(chǎn)生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些實施方案中，使用天然信號肽(例如，免疫球蛋白重鏈或輕鏈的信號肽)，或者保留了指引與其可操作連接的多肽的分泌的能力的那些序列的功能性衍生物?？蛇x地，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能性衍生物。例如，可用人組織纖溶酶原激活物(TPA)或小鼠￠-葡糖醛酸酶的前導(dǎo)序列來置換野生型前導(dǎo)序列。除非另外指明，術(shù)語“疾病”和“疾患”在本文可互換使用。在本發(fā)明上下文使用的“結(jié)合分子”主要涉及抗體及其片段，但也可指與新表位結(jié)合的其他非抗體分子，包括但不限于激素、受體、配體、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子、諸如熱激蛋白(HSP)的分子伴侶，以及細胞-細胞粘著分子，諸如I丐粘著蛋白、整聯(lián)蛋白(intergrin)、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成員。因此，僅為清楚起見，并且不限制本發(fā)明的范圍，下述實施方案的大多數(shù)是就代表用于治療和診斷劑開發(fā)的優(yōu)選結(jié)合分子的抗體和類抗體分子而討論的。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文可互換使用?？贵w或免疫球蛋白是包含重鏈的至少可變結(jié)構(gòu)域、并且正常包含重鏈和輕鏈的至少可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子。脊椎動物系統(tǒng)的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)了解得相對清楚。參見,例如,Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual (抗體實驗指南)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版， 1988)。如下文將更詳細地討論，術(shù)語“免疫球蛋白”包含可生化地區(qū)別的多種類別的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，重鏈分為Y、U、a、6或e ( y , u , a , 6 , e )，其中有一些亞類(例如，Yl- Y 4)。鏈的性質(zhì)確定了抗體的“類別”分別為IgG、IgM、IgA IgG或 IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等，表征得很清楚，并且已知其賦予功能專門化。鑒于本公開內(nèi)容，這些類別和同種型的每一個的修飾形式對熟練的技術(shù)人員來說是容易辨別的，并且相應(yīng)地在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所有的免疫球蛋白類別都清楚地在本發(fā)明的范圍內(nèi)，下述討論一般將針對免疫球蛋白分子的IgG類。關(guān)于IgG，標(biāo)準的免疫球蛋白分子包含兩條相同的分子量大約23，000道爾頓的輕鏈多肽和兩條相同的分子量53，000-70, 000的重鏈多肽。四條鏈一般以“Y”構(gòu)型由二硫鍵相連，其中輕鏈支持重鏈，在“Y”的口處開始并延續(xù)經(jīng)可變區(qū)。輕鏈分為K或入(k, A)0每重鏈類別可與K或入輕鏈結(jié)合。一般而言，當(dāng)免疫球蛋白通過雜交瘤、B細胞或遺傳改造的宿主細胞產(chǎn)生時，輕鏈和重鏈彼此共價鍵合，并且兩條重鏈的“尾”部通過共價二硫鍵合或非共價鍵合彼此鍵合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構(gòu)型叉末端的N-末端延伸到每條鏈底部的C-末端。輕鏈和重鏈都分成結(jié)構(gòu)和功能同源區(qū)。術(shù)語“恒定”和“可變”功能地使用。 在這方面，應(yīng)理解，輕鏈(VL)和重鏈(VH)部分的可變結(jié)構(gòu)域決定抗原的識別和特異性。相反地，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定結(jié)構(gòu)域賦予重要的生物學(xué)特性，諸如分泌、 經(jīng)胎盤的遷移率、Fe受體結(jié)合、補體結(jié)合及類似特性。按照慣例，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編號隨著它們變得與抗體的抗原結(jié)合位點或氨基末端更遠而增加。N-末端部分是可變區(qū)，而C-末端部分是恒定區(qū)；CH3和CL結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包括重鏈和輕鏈的羧基末端。如上文所示，可變區(qū)允許抗體選擇性地識別和特異地結(jié)合抗原上的表位。也就是說，抗體的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域、或互補決定區(qū)(CDR)的亞型組合形成確定三維抗原結(jié)合位點的可變區(qū)。這種四級抗體結(jié)構(gòu)形成了存在于Y的每個臂末端的抗原結(jié)合位點。 更具體地，該抗原結(jié)合位點由每條VH和VL鏈上的三個CDR定義。含有足以特異結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)的任何抗體或免疫球蛋白片段在本文可交換表示為“抗原結(jié)合片段”或“免疫特異性片段”。在天然存在的抗體中，每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中存在的六個“互補決定區(qū)”或 “CDR”是特異地定位以便當(dāng)抗體在水環(huán)境中采取其三維構(gòu)型時形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的短的、不相鄰的氨基酸序列?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域中剩余的氨基酸(稱為“構(gòu)架”區(qū))顯示更低的分子間可變性。構(gòu)架區(qū)主要采取￠-折疊構(gòu)象，而⑶R形成連接的環(huán)，在一些情況中，⑶R形成￠-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。因此，構(gòu)架區(qū)的作用是形成提供CDR通過鏈間非共價相互作用以正確取向定位的支架結(jié)構(gòu)。定位的CDR形成的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域定義了與免疫反應(yīng)性抗原上的表位互補的表面。該互補表面促進抗體與其同族表位的非共價結(jié)合。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地鑒定任何特定重鏈或輕鏈可變區(qū)的分別包含CDR和構(gòu)架區(qū)的氨基酸，因為這些氨基酸已被精確定義(參見，“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” (具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列)Kabat，E.等，美國衛(wèi)生及公共服務(wù)部，(1983);和Chothia 和Lesk, JMol. Biol. ,196:901-917 (1987)，其通過引用整體并入本文)。在本領(lǐng)域使用和/或接受的術(shù)語有兩種或多種定義的情況中，本文所用的術(shù)語的定義預(yù)期包括所有這些含義，除非明確指明為相反的意思。具體實例是使用術(shù)語 “互補決定區(qū)”(“CDR”)來描述重鏈和輕鏈多肽可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的不相鄰的抗原組合位點。 這一特定區(qū)域已描述于Kabat等,美國衛(wèi)生及公共服務(wù)部,“Sequences of Proteins of Immunological Interest” (具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列)(1983)和Chothia等,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)，其通過引用并入本文，其中當(dāng)彼此比較時，定義包括重疊的氨基酸殘基或氨基酸殘基的亞型。然而，指抗體或其變體的CDR的任一定義的應(yīng)用預(yù)期在本文定義和使用的術(shù)語的范圍內(nèi)。由上文引用的每個參考文獻定義的包含CDR的適當(dāng)氨基酸殘基描述于下文的表I中作為比較。包含特定CDR的確切殘基數(shù)將根據(jù)CDR的序列和大小而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地可根據(jù)抗體的可變區(qū)氨基酸序列來確定哪些殘基包含特定的 CDR。表I :CDR 定義 權(quán)利要求
1.一種分離疾病相關(guān)蛋白特異性結(jié)合分子的方法，所述方法包括(a)使獲自無癥狀但患有疾病或處于發(fā)展疾病的危險的患者、或具有異常穩(wěn)定的疾病進程的患者的樣品經(jīng)受具有預(yù)定臨床特征的病理上改變的細胞或組織試樣；和(b)鑒定并任選地分離與所述試樣結(jié)合、但不與健康對象的對應(yīng)細胞或組織結(jié)合的結(jié)合分子。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述樣品包括體液或細胞樣品，最好其中(a)所述體液是腦脊液、血漿或尿液；并且/或者(b)所述樣品包括或來自B細胞或記憶B細胞。
3.如權(quán)利要求I或2中所述的方法，其中所述結(jié)合分子是抗體。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的方法，其中所述患者和對象分別為人。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項所述的方法，其中所述患者已通過有或沒有替代標(biāo)志物而被確定患有尚未表現(xiàn)的疾病或處于發(fā)展疾病的危險，最好其中所述替代標(biāo)志物選自老年、腦淀粉樣蛋白負載，ApoE基因型、APP基因型、PSl基因型、體液中AP肽的水平、異前列腺素、Tau和磷酸-Tau。
6.如權(quán)利要求I至5中任一項所述的方法，其中所述疾病選自神經(jīng)疾病、自身免疫病和腫瘤，最好其中所述疾病是阿爾茨海默病。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述樣品獲自滿足以下標(biāo)準的患者(i)年齡為65歲或更大；(ii)具有完全的認知能力和良好的健康；和(iii)沒有癡呆的臨床體征；或(iv)具有異常緩慢的疾患進展速度，盡管存在可能為阿爾茨海默病的確定的臨床診斷。
8.如權(quán)利要求I至7任一項所述的方法，其進一步包括以下步驟(i)從已鑒定含有與所述試樣結(jié)合但不與健康對象的對應(yīng)細胞或組織結(jié)合的例如抗體的結(jié)合分子的樣品中純化B細胞或B記憶細胞；(ii)從所述B細胞或B記憶細胞獲得所述抗體的免疫球蛋白基因譜系；和(iii)使用所述譜系表達所述抗體，最好其中步驟(ii)包括以下步驟(iv)從所述B細胞或記憶B細胞獲得mRNA；(V)從步驟(iv)的mRNA獲得cDNA ;和(vi)使用引物延伸反應(yīng)從所述cDNA擴增對應(yīng)于所述抗體的重鏈(HC)和K輕鏈(LC) 的片段。
9.一種結(jié)合分子，其可通過權(quán)利要求I至8任一項所述的方法獲得，所述結(jié)合分子能選擇性地識別疾病相關(guān)蛋白的新表位，最好其中所述的結(jié)合分子基本不識別以其非疾病相關(guān)形式存在的所述蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合分子，其為抗體或其抗原結(jié)合片段，最好其中的抗體為人抗體。
11 如權(quán)利要求9或10中所述的結(jié)合分子，其中所述疾病為神經(jīng)疾病，最好其中所述疾病是腦疾病。
12.如權(quán)利要求9至11任一項所述的結(jié)合分子，其選自單鏈Fv片段(scFv)、F (ab’)片段、F(ab)片段和F(ab’)2片段。
13.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求9至12任一項所述的結(jié)合分子。
14.一種載體，其包含權(quán)利要求13所述的多核苷酸，任選地與編碼所述抗體的其他免疫球蛋白鏈的可變區(qū)的權(quán)利要求13所述的多核苷酸組合。
15.一種宿主細胞，其包含權(quán)利要求13所述的多核苷酸或權(quán)利要求14所述的載體。
16.一種用于制備疾病相關(guān)蛋白特異性結(jié)合分子、抗體或其結(jié)合片段或免疫球蛋白鏈的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求15所述的細胞；和(b)從所述培養(yǎng)物中分離所述結(jié)合分子、抗體或其結(jié)合片段或免疫球蛋白鏈。
17.一種結(jié)合分子、抗體、或其免疫球蛋白鏈或結(jié)合片段，其由權(quán)利要求13所述的多核苷酸編碼，或者可通過權(quán)利要求16所述的方法獲得。
18.如權(quán)利要求9至12或17中任一項所述的結(jié)合分子、抗體或結(jié)合片段(a)其被可檢測地標(biāo)記，最好其中所述可檢測標(biāo)記選自酶、放射性同位素、熒光團和重金屬；并且/或者(b)其與藥物相連。
19.一種組合物，其包含權(quán)利要求9至12，17或18中任一項所述的結(jié)合分子、抗體或結(jié)合片段，權(quán)利要求13所述的多核苷酸，權(quán)利要求14所述的載體或權(quán)利要求15所述的細胞，其中(a)組合物為藥物組合物，并且進一步包含藥學(xué)可接受的載體，還可以進一步包括用于治療阿爾茨海默病的其他物質(zhì)，所述其他物質(zhì)選自小有機分子、抗Abeta抗體及其組合；或者(b)組合物為診斷組合物，并且進一步包含常規(guī)用在基于免疫或核酸的診斷方法中的試劑。
全文摘要
提供疾患特異性結(jié)合分子和靶的方法，本發(fā)明提供了識別疾患相關(guān)蛋白新表位的新的特異性結(jié)合分子、特別是人抗體及其片段、衍生物和變體，所述疾患相關(guān)蛋白來自天然的內(nèi)源蛋白，但在患者體內(nèi)以變體形式和／或脫離其正常生理環(huán)境普遍存在。另外，描述了包含此類結(jié)合分子、抗體及其模擬物的藥物組合物和篩選治療諸如阿爾茨海默病的神經(jīng)疾病的新的結(jié)合分子(可以是或可以不是抗體)和靶的方法。
文檔編號C12N15/13GK102603893SQ201210046808
公開日2012年7月25日 申請日期2008年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月5日
發(fā)明者克里斯托夫·愛瑟蘭格, 克里斯托夫·霍克, 凱瑟琳·蒂索, 簡·格林, 羅格·尼奇, 馬倫·科諾布洛赫 申請人:蘇黎世大學(xué)