專利名稱：癌癥病變前期CD151的mRNA水平原位雜交檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及與癌癥病理演變mRNA表達(dá)改變 (病理演變過(guò)程)的相關(guān)檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
根據(jù)國(guó)內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的資料，我國(guó)每年癌癥的新增人數(shù)260萬(wàn)，死亡人數(shù)近 210萬(wàn)，患者700多萬(wàn)，全球每年新增癌癥患者800萬(wàn)，死亡人數(shù)接近800萬(wàn)，患者約有8400 多萬(wàn)人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。癌癥診治成本越來(lái)越高，按癌癥患者的年治療費(fèi)用20萬(wàn)(貧窮地區(qū)可能偏高，發(fā)達(dá)地區(qū)可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出20萬(wàn))，700多萬(wàn)患者，每年的花費(fèi)是I. 4萬(wàn)億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有I萬(wàn)億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會(huì)在治療后不久死亡。因此，現(xiàn)有的臨床癌癥診治模式一定要改變，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)是提前做到預(yù)防性篩查，然后及時(shí)介入預(yù)防性調(diào)控和預(yù)防性治療，做到基因水平癌癥的治未病。2005年美國(guó)衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了一個(gè)年度報(bào)告，對(duì) 1972年發(fā)起的抗癌大戰(zhàn)進(jìn)行回顧，報(bào)告認(rèn)為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗，結(jié)論是癌癥死亡率沒(méi)有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個(gè)因素是1.腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性(多態(tài)性);2.腫瘤細(xì)胞耐藥性；3.抗癌藥物設(shè)計(jì)思路不完善(動(dòng)物模型設(shè)計(jì)不科學(xué))等。同時(shí)，該報(bào)告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學(xué)影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細(xì)胞膜因子、細(xì)胞核因子、細(xì)胞流式技術(shù))指標(biāo)來(lái)診斷癌癥，都是腫瘤形成后診斷，前者要有組織學(xué)變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋放、或腫瘤的標(biāo)記物。傳統(tǒng)臨床觀念認(rèn)為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這一概念值得認(rèn)真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模瑥募?xì)胞學(xué)角度來(lái)分析，I公分的腫塊約有一億個(gè)腫瘤細(xì)胞，2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn)不止 2億個(gè)腫瘤細(xì)胞，從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過(guò)程相當(dāng)長(zhǎng)，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實(shí)的是在這個(gè)病理演變過(guò)程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨(dú)的病灶，可能癌細(xì)胞早已遷移到其它組織或器官生長(zhǎng)。臨床研究早已證實(shí)，一旦形成腫塊的同時(shí)，其它癌細(xì)胞通過(guò)不同途徑遷移到其它部位克隆生長(zhǎng)，一旦切除原發(fā)灶后，其它器官?gòu)?fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以 2公分以下的癌腫塊大小來(lái)界定早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時(shí)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，其實(shí)這時(shí)已經(jīng)是晚期診斷和晚期治療，這是導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預(yù)防癌癥，已取得長(zhǎng)足進(jìn)步。至今，我們已有可能在基因的一級(jí)轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預(yù)測(cè)和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)，選擇多組臨床標(biāo)本(癌癥病人、高危人群、正常對(duì)照)，對(duì)CD151基因與肝癌轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警進(jìn)行檢測(cè)分析。研究證明CD151基因與在肝癌細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境和肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)有密切關(guān)系， 人體內(nèi)一種微小蛋白質(zhì)——四跨膜蛋白CD151是肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。四跨膜蛋白 ^151與整合素α 6β I高表達(dá)的肝癌細(xì)胞亞群在與腫瘤微環(huán)境的相互作用過(guò)程中可獲得高侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。因此，探索肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制對(duì)于改善肝癌患者的生存具有重要意義。近年來(lái)，腫瘤微環(huán)境即“土壤”在腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的作用受到腫瘤學(xué)家們高度關(guān)注。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CD151過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白酶9(ΜΜΡ9)的分泌和表達(dá)， 參與肝癌新生血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移；首次闡述了 CD151過(guò)度表達(dá)在肝癌新生血管形成中的作用，揭示了血管形成和癌癥的新機(jī)制。有關(guān)人士指出，上述發(fā)現(xiàn)不僅闡述了“種子”~ 肝癌細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中的地位，還揭示了 “種子”與“土壤”一腫瘤微環(huán)境如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腫瘤血管及腫瘤基質(zhì)間有著“千絲萬(wàn)縷”的聯(lián)系，并在肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移中共同起著重要作用，這將推動(dòng)癌癥防治策略的調(diào)整，并為肝癌的治療提供潛在的靶標(biāo)。本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)研究中對(duì)CD151基因與癌癥轉(zhuǎn)移患者、高危人群、正常人群進(jìn)行了檢查分析，發(fā)現(xiàn) ⑶151基因的mRNA在不同例組中的表達(dá)量有明顯差異，將⑶151的mRNA作為早期篩查肝癌變前期及轉(zhuǎn)移早期的指標(biāo)有非常重要的臨床診斷意義。CD151的mRNA在肝癌轉(zhuǎn)移早期及肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中高表達(dá)。他作于肝癌轉(zhuǎn)移前期篩查、及肝癌治療后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移預(yù)警也有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長(zhǎng)期的研究中，得出了一種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病,只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會(huì)成本和醫(yī)療成本。因此,發(fā)明人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了創(chuàng)新。特別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤組織比較的一貫性研發(fā)思路，來(lái)尋找和開發(fā)癌前變的mRNA水平，與癌癥早期基因病理生理學(xué)演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標(biāo)，將臨床上腫瘤形成后診治模式變成腫瘤的預(yù)防性診治，爭(zhēng)取了腫瘤診治的時(shí)間和空間，達(dá)到預(yù)防癌癥。目前對(duì)CD151基因的研究都采用高通量基因芯片和蛋白譜分析技術(shù)，而這些方法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，而檢測(cè)mRNA比基因分析更科學(xué)(DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是功能性體現(xiàn))，比蛋白分析更可靠(mRNA與蛋白轉(zhuǎn)錄有時(shí)候不同步)。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料CD151基因mRNA水平的檢測(cè)技術(shù)及試劑盒未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明人在針對(duì)創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設(shè)計(jì)了(癌癥轉(zhuǎn)移患者、高危人群(乙肝肝硬化)、正常對(duì)照人群)不同數(shù)據(jù)例組，用原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明以上肝癌病人 ⑶151基因高表達(dá)，高危人群有不同程度表達(dá)15-25%，正常對(duì)照組都是低表達(dá)和零表達(dá)。表明CD151基因肝癌轉(zhuǎn)移前期篩查的重要標(biāo)志物。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對(duì)何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于以后的檢測(cè)。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來(lái)有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測(cè)這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過(guò)五大過(guò)程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(mRNA)和檢測(cè)的靶mRNA是采用堿基互補(bǔ)(雜交互補(bǔ))的原理，同時(shí)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間研究和觀察，啟動(dòng)和中止處得殘基對(duì)檢測(cè)的結(jié)果沒(méi)有影響(因?yàn)?，發(fā)明人采用的mRNA序列都超過(guò)600bp以上)。鑒于目前臨床上癌癥的診斷(影像醫(yī)學(xué)和生化指標(biāo)物都是腫瘤形成后的診斷)是晚期診斷，治療也是晚期治療，導(dǎo)致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治未病，達(dá)到預(yù)防性診治，將目前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標(biāo)記物無(wú)法檢測(cè)到癌前變mRNA水平量化改變技術(shù)，做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破，提供癌前變mRNA水平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項(xiàng)新的癌前變mRNA水平真正早期篩查的技術(shù)，為臨床癌癥的診治爭(zhēng)取時(shí)間和空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，其包含原位雜交檢測(cè)探針和標(biāo)記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與肝癌轉(zhuǎn)移前期篩查及治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移早期預(yù)警相關(guān)的原位雜交檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜父探針如SEQ ID NO. I所不序列，為⑶151基因序列中⑶S序列，⑶151基因的RNA序列號(hào)
D29963 JBSEQ ID NO. 2所示序列，核苷酸序列長(zhǎng)度是1486bp，CDS是85......846bp。(在探
針標(biāo)記過(guò)程中如果基因序列太長(zhǎng)，超過(guò)IOOObp以上，我們會(huì)用CDS的序列來(lái)設(shè)計(jì)探針，如果 CDS的序列也超過(guò)IOOObp以上，會(huì)采用基因的中間一段堿基序列來(lái)合成探針，堿基序列不少于500bp，探針合成后要做序列檢測(cè)，并對(duì)功能進(jìn)行臨床意義的分析)。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括顯色劑。
本發(fā)明的肝癌轉(zhuǎn)移病理演變前期CD151基因篩查試劑盒應(yīng)用價(jià)值在于，能在mRNA 水平，對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移前期篩查，及肝癌轉(zhuǎn)移治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散發(fā)生預(yù)警，進(jìn)一步配合臨床治療。本發(fā)明還提供一種⑶151基因的一級(jí)轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物mRNA原位雜交的檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè) RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和
(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本。更優(yōu)選地是，所述的血液標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本來(lái)自肝癌轉(zhuǎn)移患者、肝癌高危人群、健康對(duì)照人群。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以CD151基因的一級(jí)轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物mRNA為檢測(cè)對(duì)象，合成探針是CD151基因的RNA序列，檢測(cè)的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞或組織細(xì)胞的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供CD151 基因的半定量或定量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達(dá)量，正常對(duì)照⑶151基因低表達(dá)，即小量顯色，⑶151基因在肝癌轉(zhuǎn)移病人和正常對(duì)照組有顯著差異，該基因的表達(dá)量比正常對(duì)照組表達(dá)量都高。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；
3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；
4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C);
5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C);
7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的方案是以CD151基因的mRNA為目的基因合成的核酸探針用地高辛標(biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過(guò)程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)mRNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過(guò)檢測(cè)底物細(xì)胞中的 CD151基因表達(dá)量，用來(lái)確定肝癌轉(zhuǎn)移病理演變前期的mRNA變化量，預(yù)警肝癌轉(zhuǎn)移是否發(fā)
權(quán)利要求
1.一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所不的序列。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種CD151基因原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)在權(quán)利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的血液白細(xì)胞標(biāo)本選自癌癥、高危人群、正常人標(biāo)本。
10.CD151基因在制備檢測(cè)癌癥病變前期原位雜交試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測(cè)與癌癥早期病理演變有密切相關(guān)的四跨膜蛋白(CD151)基因與的mRNA方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法可在mRNA水平上檢測(cè)CD151基因的表達(dá)量，比影像醫(yī)學(xué)和現(xiàn)有的臨床生化檢測(cè)指標(biāo)更早期，能實(shí)現(xiàn)真正的癌變前期mRNA水平篩查，同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單方便，成本低,便于縣區(qū)級(jí)醫(yī)院推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605057SQ20121004742
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者張?jiān)聘? 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司