專利名稱：高耐受細(xì)胞株的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及生物工程技術(shù)，特別是適合于大規(guī)模生產(chǎn)用的高耐受細(xì)胞株的篩選和
培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
生物反應(yīng)器在動物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)中的應(yīng)用也是生物制藥領(lǐng)域的發(fā)展趨勢，很多生物制藥公司均致力于開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品的發(fā)酵工藝，以滿足公司產(chǎn)品能夠在低成本大規(guī)模情況下進行產(chǎn)品的制備。隨著全球?qū)ι镏破返男枨罅康脑龃螅锓磻?yīng)器的規(guī)模也不斷地提高。此時，動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)也就成了生物制藥領(lǐng)域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一。
但是，在發(fā)酵規(guī)模不斷放大的過程中，細(xì)胞生長的微環(huán)境發(fā)生了很大的變化，細(xì)胞 生長受到顯著影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)細(xì)胞高密度生長達(dá)到一定程度，由于其自身特性不同，其工藝參數(shù)耐受情況也不盡相同。隨著細(xì)胞密度的增長，主要底物氧化還原代謝加劇，傳質(zhì)及傳熱過程需要進行調(diào)整，加大攪拌及提高通氣量是最主要的手段，伴隨而來的是細(xì)胞不可避免的受到的一系列物理損傷。底物的大量消耗會導(dǎo)致副產(chǎn)物的大量產(chǎn)生，對各類細(xì)胞有較高的毒性，同時，底物耗竭會造成細(xì)胞生長代謝停滯進而導(dǎo)致大量細(xì)胞快速死亡。因此，工藝參數(shù)是限制發(fā)酵規(guī)模的重要問題，各種工藝的開發(fā)依賴于細(xì)胞株能夠耐受微環(huán)境各項參數(shù)指標(biāo)的變化，篩選獲得能夠在生物反應(yīng)器中的高耐受細(xì)胞株顯得尤為重要。采用高耐受細(xì)胞株，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞株在無血清、無蛋白或者化學(xué)成分限定培養(yǎng)基中的生長代謝和廣物表達(dá)，同時，還能大幅度的提聞細(xì)胞株的生長代謝機能，增強細(xì)胞株抵抗微環(huán)境的各種惡劣變化，以此實現(xiàn)控制細(xì)胞增殖水平、延長細(xì)胞培養(yǎng)周期，解決規(guī)?；糯髤?shù)的限制、降低成本等目標(biāo)，進而提高規(guī)模化培養(yǎng)的效能。

發(fā)明內(nèi)容
本申請涉及適合于大規(guī)模生產(chǎn)用的高耐受細(xì)胞株的制備和篩選方法。本申請的一方面提供了一種高耐受細(xì)胞株的篩選方法，包括選取可生長細(xì)胞株，將其進行體外培養(yǎng)，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件從而迫使細(xì)胞在不良生長環(huán)境中生長代謝，進而篩選獲得適應(yīng)于所述不良生長環(huán)境的高耐受細(xì)胞株，其特征在于，所述改變的細(xì)胞培養(yǎng)條件包括細(xì)胞培養(yǎng)液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、PH值、溶氧濃度或攪拌速度，或所述細(xì)胞培養(yǎng)條件的兩種或兩種以上的任意組合。在一些實施方式中，本申請的高耐受細(xì)胞株的篩選方法包括改變兩種或兩種以上選自以下組的細(xì)胞培養(yǎng)條件細(xì)胞培養(yǎng)液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、PH值、溶氧濃度以及攪拌速度。在一些實施方式中，可改變?nèi)N或三種以上所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件。在一些實施方式中，可改變四種或四種以上所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件。在一些實施方式中，可改變五種或五種以上所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件。在一些實施方式中，可改變六種或六種以上所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件。如果通過改變或調(diào)整多種細(xì)胞培養(yǎng)條件來篩選高耐受細(xì)胞株，所述細(xì)胞培養(yǎng)條件可同時改變或調(diào)整，也可分先后分別改變或調(diào)整，也可以有些培養(yǎng)條件同時改變，有些培養(yǎng)條件單獨改變。例如，在一些實施方式中，可同時改變細(xì)胞培養(yǎng)液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、PH值、溶氧濃度以及攪拌速度，將細(xì)胞進行培養(yǎng)，挑選出適應(yīng)于改變后的培養(yǎng)條件的高耐受細(xì)胞株。在一些實施方式中，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可以按預(yù)定的順序依次改變培養(yǎng)條件，比如先改變滲透壓，再改變?nèi)樗釢舛龋俑淖儼睗舛?，再改變PH值，再改變?nèi)苎鯘舛?，再改變攪拌速度等，又比如先改變滲透壓，再改變攪拌速度，再改變?nèi)樗釢舛群桶睗舛鹊龋直热缦雀淖儩B透壓和PH值，再改變攪拌速度，再改變?nèi)樗釢舛群桶睗舛鹊?。在一些實施方式中，在?xì)胞培養(yǎng)過程中改變的細(xì)胞培養(yǎng)條件中至少有兩種分別進行改變，即不是同時改變。例如，在一些實施方式中，先改變初始細(xì)胞密度、滲透壓、PH值和攪拌速度，然后再改變?nèi)樗釢舛群桶睗舛?。在一些實施方式中，改變?xì)胞培養(yǎng)條件可以是逐步提高滲透壓使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。在一些實施方式中，以預(yù)定的梯度，比如50mQ或IOOmQ，逐步提高滲透壓。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中初始的滲透壓為大約280mQ或320mQ。在一些實施方式中，培養(yǎng)條件中滲透壓改變的范圍為300 600m Q。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中滲透壓被一次性調(diào)整到預(yù)定的極限滲透壓值，例如400mQ、500mQ或600m Q，直接篩選出可在極限滲透壓值條件下存活的、生長代謝狀態(tài)良好的高耐受細(xì)胞株。在一些實施方式中，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件可以是逐步降低溶氧濃度使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。在一些實施方式中，以預(yù)定的梯度，比如5%或10%，逐步降低溶氧濃度。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中初始溶氧濃度為80%或70%。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中溶氧濃度的范圍在10% _80%、20% 80%、或者30% -80%。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中溶氧濃度被一次性調(diào)整到預(yù)定的極限溶氧濃度值，例如10%或15%，直接篩選出可在極限溶氧濃度條件下存活的、生長代謝狀態(tài)良好的高耐受細(xì)胞株。在一些實施方式中，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件可以是逐步提高乳酸濃度使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。在一些實施方式中，以預(yù)定的梯度，比如5mM、10mM、20mM、40mM或80mM，逐步提高乳酸濃度。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中初始乳酸濃度為OmM。在一些實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)條件中乳酸濃度的改變范圍為0 60mM，0 80mM，0 IOOmM或I 120mM等。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中乳酸濃度被一次性調(diào)整到預(yù)定的極限乳酸濃度值，例如IlOmM或120mM，直接篩選出可在極限乳酸濃度條件下存活的、生長代謝狀態(tài)良好的高耐受細(xì)胞株。在一些實施方式中，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件可以是逐步提高氨濃度使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。在一些實施方式中，以預(yù)定的梯度，比如2mM、4mM、6mM、8mM、10mM，逐步提高氨濃度。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中初始氨濃度為OmM。在一些實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)條件中氨濃度的改變范圍為0 10mM，0 15mM，或0 20mM等。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中氨濃度被一次性調(diào)整到預(yù)定的極限氨濃度值，例如IOmM或20mM，直接篩選出可在極限氨濃度條件下存活 的、生長代謝狀態(tài)良好的高耐受細(xì)胞株。在一些實施方式中，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件可以是同時逐步提高乳酸濃度和氨濃度使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。在一些實施方式中，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件可以是同時逐步提高乳酸濃度、氨濃度以及滲透壓使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。在一些實施方式中，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件可以是同時逐步提高乳酸濃度、氨濃度以及pH值使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。在一些實施方式中，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件可以是逐步提高pH值使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中初始pH值為6. 5。在一些實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)條件中PH值的變化范圍可以為6. 5 7. 8。在一些實施方式中，培養(yǎng)液中pH值被一次性調(diào)整到預(yù)定的極限pH值，例如7. 8，直接篩選出可在極限pH值條件下存活的、生長代謝狀態(tài)良好的高耐受細(xì)胞株。在一些實施方式中，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件可以是逐步提高攪拌速度使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。在一些實施方式中，以預(yù)定的梯度逐步提高攪拌速度，比如 40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、lOOrpm、llOrpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm。在一些實施方式中，培養(yǎng)液初始攪拌速度為40rpm、60rpm、80rpm或lOOrpm。在一些實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)條件中攪拌速度的變化范圍可以為40 150rpm，40 200rpm，40 250rpm,或40 300rpm等。在一些實施方式中，攪拌速度被一次性調(diào)整到預(yù)定的極限攪拌速度，例如200rpm或300rpm，直接篩選出可在極限攪拌速度條件下存活的、生長代謝狀態(tài)良好的高耐受細(xì)胞株。在一些實施方式中，可以在營養(yǎng)物低濃度條件下篩選高耐受細(xì)胞株。比如，營養(yǎng)物濃度低于該細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)條件下起始營養(yǎng)物濃度的50%、30%或者更低的濃度。常規(guī)起始營養(yǎng)物濃度例如可以是，新鮮的EX-CELL 302無血清培養(yǎng)基(JRH BI0SCIENCE公司，貨號24326C)所含的營養(yǎng)物濃度，新鮮的EX-CELL 620無血清培養(yǎng)基(JRH BI0SCIENCE公司，貨號14621C)所含的營養(yǎng)物濃度。在一些實施方式中，可以在高細(xì)胞密度條件下篩選高耐受細(xì)胞株。比如，細(xì)胞密度高于IO7細(xì)胞/mL、2X IO7細(xì)胞/mL或5X IO7細(xì)胞/mL。在一些實施方式中，細(xì)胞起始培養(yǎng)密度可以是0. 5 10 X IO5細(xì)胞/mL，或I 10 X IO5細(xì)胞/mL，或2 10 X IO5細(xì)胞/mL，或3 10X IO5 細(xì)胞/mL，或 4 10 X IO5 細(xì)胞/mL，或 5 10 X IO5 細(xì)胞/mL，或 9 IOXlO5
細(xì)胞/mL等。在一些實施方式中，預(yù)定的細(xì)胞生長代謝參數(shù)是指細(xì)胞活性，預(yù)定的極限值是指細(xì)胞活性低于大約60%、50%、40%或30%等。在一些實施方式中，預(yù)定的細(xì)胞生長代謝參數(shù)是指細(xì)胞倍增時間，預(yù)定的極限值是指細(xì)胞倍增期無法保持穩(wěn)定，例如群體細(xì)胞倍增時間縮短或延長40%以上、50%以上、或 者60%以上。在一些實施方式中，預(yù)定的細(xì)胞生長代謝參數(shù)是指細(xì)胞的產(chǎn)物表達(dá)量，預(yù)定的極限值是指細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)量低于常規(guī)培養(yǎng)條件下的表達(dá)量的90 %、80 %、70 %或60 %等。在一些實施方式中，用無血清克隆化方法進一步對改變培養(yǎng)條件后獲得的細(xì)胞進行篩選，獲得生長代謝穩(wěn)定的高耐受細(xì)胞株。在一些實施方式中，在改變一種或多種細(xì)胞培養(yǎng)條件后，進行無血清培養(yǎng)和篩選，然后再進一步改變細(xì)胞培養(yǎng)條件，再次進行無血清培養(yǎng)和篩選，這樣交替進行改變培養(yǎng)條件的培養(yǎng)和篩選。有關(guān)無血清克隆化的典型方法可以參見米力和屈穎等人的中國專利第CN200810150056. X號，其
公開日為2008年12月31日，該專利公開的全部內(nèi)容通過引用方式并入到本申請中。
在一些實施方式中，所述細(xì)胞株是動物細(xì)胞株。在一些實施方式中，所述細(xì)胞株是哺乳動物細(xì)胞株，例如中圍倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。在一些實施方式中，所述細(xì)胞株帶有可表達(dá)的重組外源基因。在一些實施方式中，所述重組外源基因編碼外源蛋白例如抗體蛋白。在一些實施方式中，高耐受細(xì)胞株可表達(dá)重組蛋白。在一些實施方式中，高耐受細(xì)胞株表達(dá)的重組蛋白的質(zhì)量與未進過篩選的細(xì)胞株表達(dá)的一致。在一些實施方式中，高耐受細(xì)胞株表達(dá)的重組蛋白的純度與未進過篩選的細(xì)胞株表達(dá)的一致或相差不超過5%、10%或20%。在一些實施方式中，所述篩選方法所采用的起始細(xì)胞株是生長狀態(tài)良好的細(xì)胞株。在一些實施方式中，所述篩選方法所采用的起始細(xì)胞株是處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。在一些實施方式中，所述篩選方法所采用的起始細(xì)胞可以是正常的未經(jīng)高耐受篩選的細(xì)胞，也可以是經(jīng)過一次或多次高耐受篩選的細(xì)胞株。 在一些實施方式中，篩選的周期可以是10 40天，20 40天，30 40天等。


圖I示出了實施例I篩選獲得的高耐受細(xì)胞株跟原始細(xì)胞株在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺濃度隨著時間的變化情況。圖2示出了實施例I篩選獲得的高耐受細(xì)胞株跟原始細(xì)胞株在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中葡萄糖濃度隨著時間的變化情況。圖3示出了實施例I篩選獲得的高耐受細(xì)胞株跟原始細(xì)胞株在相同培養(yǎng)條件下細(xì)胞密度隨著時間的變化情況。圖4示出了實施例I篩選獲得的高耐受細(xì)胞株跟原始細(xì)胞株在相同培養(yǎng)條件下細(xì)胞活性隨著時間的變化情況。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本申請作進一步的詳細(xì)說明。以下描述的實施方式僅為說明目的而并非旨在限定。在不偏離本申請的主題的精神或范圍的情況下，可以采用其他實施方式，并且可以做出其他變化，所有這些都在本申請范圍之內(nèi)，并構(gòu)成本申請內(nèi)容的一部分。實施例I :通過調(diào)整滲透壓、攪拌速度、pH、高細(xì)胞密度和營養(yǎng)物濃度等篩選高耐受細(xì)胞株的方法I)細(xì)胞株和培養(yǎng)基起始細(xì)胞株是帶有重組目標(biāo)基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞，該細(xì)胞株命名為CERC_10(中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程中心構(gòu)建)。本實施例中所用的新鮮的EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基購自JRH BI0SCIENCE公司(貨號24326C)。本實施例中所用的條件培養(yǎng)基為新鮮的EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基與細(xì)胞培養(yǎng)后離心所得培養(yǎng)基上清液以一定比例混合獲得。例如，條件培養(yǎng)基可通過以下步驟獲得將待培養(yǎng)細(xì)胞接種到新鮮的EX-CELL 302無血清培養(yǎng)基中，在5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至預(yù)期的時間或細(xì)胞密度，然后以1200rpm離心5分鐘除去細(xì)胞獲得培養(yǎng)上清液；將培養(yǎng)上清液按照一定比例跟新鮮的EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基混合形成條件培養(yǎng)基。
本實施例中無血清克隆化步驟所用的無血清低密度培養(yǎng)基通過以下步驟制得準(zhǔn)備EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；添加胰島素至15mg/L、添加轉(zhuǎn)鐵蛋白至5mg/L、添加胰島素樣生長因子-I至100ug/L、添加乙醇胺至10mol/L以及添加亞硒酸鈉至60nmol/L從而制備得到無血清低密度培養(yǎng)基(所述濃度都是這些添加物最終在培養(yǎng)基中的濃度)。2)檢測方法和儀器細(xì)胞密度和細(xì)胞活性采用臺盼藍(lán)拒染法進行檢測，其中，在不同時段從培養(yǎng)基中取出細(xì)胞，將等量的細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)染液均勻混合，I分鐘后，將已染色的細(xì)胞懸液加入血球計數(shù)板中，在光學(xué)顯微鏡下對活細(xì)胞和死細(xì)胞分別進行計數(shù)。細(xì)胞活性=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))。采用夾心酶標(biāo)記免疫吸附測定法(ELISA)檢測上清液中的表達(dá)產(chǎn)物，其中，采用Fab雙段(購自Corning公司，貨號XH329)包被96孔板，濃度為100 y g/mL ;二抗采用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗人二抗(購自PIERCE公司，貨號HC002)，濃度為I :8000。顯色液顯色后采用酶標(biāo)儀進行讀值。 葡萄糖濃度和L-谷氨酰胺濃度采用生化分析儀(YSI公司，YSI 2700型號)進行檢測。生物反應(yīng)器采用德圍貝朗公司(B. Braun Biotech)的B5L生物攪拌通氣式生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器中的表達(dá)產(chǎn)物采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)(GE Healthcare Life Sciences,AKTAexplorer型號)通過Protein A親和層析柱進行回收純化。表達(dá)產(chǎn)物的純度使用高效液相色譜儀HPLC(Waters 600)進行檢測，回收到的表達(dá)產(chǎn)物純度為約95%。3)采用如下步驟建立高耐受細(xì)胞株I.將20毫升CERC-10細(xì)胞接種于80毫升新鮮的EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞起始密度為5 X IO5細(xì)胞/毫升左右，用氯化鈉溶液將滲透壓調(diào)整至400m Q，調(diào)節(jié)pH至7. 0，置于5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，并將轉(zhuǎn)速設(shè)置為80rpm/min。2. 3天后，將上一步所得細(xì)胞離心，并收集細(xì)胞稀釋于條件培養(yǎng)基中(新鮮的EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基上一步所得的培養(yǎng)上清液=I I混合而得)，使得細(xì)胞密度調(diào)整至約2 X IO6細(xì)胞/毫升，采用氯化鈉將滲透壓調(diào)整到450m Q，采用5mM氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)為7. 5，置于5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，并將轉(zhuǎn)速設(shè)置為90rpm/min。3. 6天后，將上一步所得細(xì)胞離心，并收集細(xì)胞稀釋于條件培養(yǎng)基中(新鮮的EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基上一步所得的培養(yǎng)上清液=I 3混合而得)，使得細(xì)胞密度調(diào)整至約5 X IO6細(xì)胞/毫升，采用氯化鈉將滲透壓調(diào)整到500m Q，置于5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，并將轉(zhuǎn)速設(shè)置為100rpm/min。4. 9天后，將上一步所得細(xì)胞離心，并收集細(xì)胞稀釋于條件培養(yǎng)基中(新鮮的EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基上一步所得的培養(yǎng)上清液=I 5混合)，使得細(xì)胞密度調(diào)整至約10X IO6細(xì)胞/毫升，采用氯化鈉將滲透壓調(diào)整到550mQ，置于5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，并將轉(zhuǎn)速設(shè)置為110rpm/min。5. 12天后，將上一步所得細(xì)胞離心，并收集細(xì)胞稀釋于條件培養(yǎng)基中(新鮮的 EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基上一步所得的培養(yǎng)上清液=I 9混合)，使得細(xì)胞密度調(diào)整至約20X IO6細(xì)胞/毫升，采用氯化鈉將滲透壓調(diào)整到500mQ，用5mM鹽酸將pH調(diào)整為6. 8，置于5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱 中進行培養(yǎng)，并將轉(zhuǎn)速設(shè)置為120rpm/min。6. 18天后，采用有限稀釋法進行無血清克隆化，培養(yǎng)7-14天。該方法包括以下步驟使用無菌純水配制100mg/L的D-多聚賴氨酸,室溫包被96孔板2h,使用無菌水沖洗包被孔3次；將步驟5的細(xì)胞懸液與無血清低密度培養(yǎng)基按照I : 100的比例連續(xù)稀釋直至細(xì)胞密度為50細(xì)胞/毫升，以100 u L/孔的比例接種24個孔；繼續(xù)稀釋細(xì)胞懸液至細(xì)胞密度為20細(xì)胞/毫升，以100 u L/孔的比例接種24個孔；繼續(xù)稀釋細(xì)胞懸液至細(xì)胞密度為10細(xì)胞/毫升，以100 u L/孔的比例接種48個孔；最后經(jīng)過7-14天培養(yǎng)后，篩選出生長和產(chǎn)物表達(dá)均理想的克隆株。生長和產(chǎn)物表達(dá)均理想的克隆株應(yīng)滿足生長代謝穩(wěn)定，表達(dá)的目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量優(yōu)良的標(biāo)準(zhǔn)，并且與原始細(xì)胞株的生長代謝基本一致。7.在顯微鏡下觀察單克隆生長情況，同時用夾心ELISA方法檢測上清液中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)情況，綜合考慮生長和表達(dá)兩方面的結(jié)果，篩選生長和表達(dá)都較理想的耐受克隆株。8.準(zhǔn)備5L生物反應(yīng)器和新鮮的EX- CELL 302無血清培養(yǎng)基，將3L新鮮的培養(yǎng)基加入到反應(yīng)器中。9.以約5 X IO5細(xì)胞/毫升的初始細(xì)胞密度將步驟7篩選得到的耐受細(xì)胞接種于上述5L生物反應(yīng)器中，起步轉(zhuǎn)速為80rpm，pH為7. 5。10.將轉(zhuǎn)速按照80、90、100、110、120、130、140、150rpm的梯度不斷升高，以不同的
細(xì)胞密度來控制攪拌的速度。初始細(xì)胞密度在5 X IO5細(xì)胞/毫升至I X IO6細(xì)胞/毫升，攪拌以80rpm開始；細(xì)胞密度達(dá)到5 X IO6細(xì)胞/毫升時，攪拌可以調(diào)整至120rpm ;細(xì)胞密度達(dá)到I X IO7細(xì)胞/毫升以上時，攪拌速度可以調(diào)整至150rpm。在此范圍間的攪拌速度可以根據(jù)細(xì)胞的粘附情況(細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附，以及細(xì)胞跟生物反應(yīng)器內(nèi)壁之間的粘附)來進行調(diào)整，例如當(dāng)細(xì)胞粘附加劇(比如出現(xiàn)了結(jié)團、聚集或者粘附到生物反應(yīng)器內(nèi)壁)時，可以考慮調(diào)高攪拌速度。11.在細(xì)胞密度達(dá)到5X IO6細(xì)胞/毫升之后，每天逐步提高乳酸和氨的濃度，乳酸的濃度梯度為5，10，20，40，80mM，氨的濃度梯度為2，4，6，8，10mM。乳酸濃度可以通過200mM乳酸進行調(diào)整，氨的濃度可以通過200mM氯化銨進行調(diào)整。12.繼續(xù)培養(yǎng)使細(xì)胞密度不斷升高，直至細(xì)胞密度達(dá)到約2 X IO7細(xì)胞/毫升。13.不斷檢測5L生物反應(yīng)器中的細(xì)胞活性，當(dāng)細(xì)胞活性下降到50%左右時，無菌取樣。14.按照跟步驟6相同的方式采用有限稀釋法進行無血清克隆化篩選，從中篩選出生長和產(chǎn)物表達(dá)均理想的克隆株。4)結(jié)果采用無血清克隆化的方法進行高耐受細(xì)胞株亞克隆的篩選，其克隆率為33. 7%,且陽性率100%。由附圖I和附圖2可以看出，本實施例篩選獲得的高耐受亞克隆細(xì)胞株(簡稱“高耐受細(xì)胞株”)與原始細(xì)胞株在相同培養(yǎng)條件下在L-谷氨酰胺和葡萄糖的代謝速度和趨勢上基本一致。在整個生長過程中，底物L(fēng)-谷氨酰胺和葡萄糖基本維持在設(shè)定區(qū)間范圍內(nèi)，谷氨酰胺濃度維持在約l_4mM，葡萄糖維持在約2-6g/L。流加L-谷氨酰胺和葡萄糖24小時內(nèi)濃度均滿足設(shè)定的極限值，其中谷氨酰胺設(shè)置低限為ImM，葡萄糖設(shè)置低限為 lg/Lo
由附圖3可以看出，高耐受細(xì)胞株和原始細(xì)胞株的最高細(xì)胞密度分別為約9. 3 X IO6細(xì)胞/毫升和約8. 5 X IO6細(xì)胞/毫升(均在培養(yǎng)第5天左右達(dá)到最高細(xì)胞密度)，兩者無顯著差異。從附圖3還可以看出，在對數(shù)生長期(第1-4天左右)，高耐受細(xì)胞株和原始細(xì)胞株在細(xì)胞密度方面無顯著差異；高耐受細(xì)胞株的平臺期(第4-6天左右)比原始細(xì)胞株(第4-5天左右)延長了一天。由附圖4可以看出，在衰亡期(第5天或第6天起)，高耐受細(xì)胞株的細(xì)胞活性下降速度要比原始細(xì)胞株的細(xì)胞活性下降速度慢。另外，高耐受細(xì)胞株的培養(yǎng)周期要比原始細(xì)胞株的培養(yǎng)周期延長兩天，從8天延長至10天。根據(jù)ELISA檢測結(jié)果，高耐受細(xì)胞株在第10天表達(dá)產(chǎn)物濃度達(dá)到最高值，為約280.2mg/L。
權(quán)利要求
1.一種高耐受細(xì)胞株的篩選方法，包括選取可生長細(xì)胞株，將其進行體外培養(yǎng)，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件從而迫使細(xì)胞在不良生長環(huán)境中生長代謝，進而篩選獲得適應(yīng)于所述不良生長環(huán)境的高耐受細(xì)胞株，其特征在于，所述改變的細(xì)胞培養(yǎng)條件包括細(xì)胞培養(yǎng)液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、PH值、溶氧濃度或攪拌速度，或者所述細(xì)胞培養(yǎng)條件的兩種或兩種以上的任意組合。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，改變兩種或兩種以上所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的改變的細(xì)胞培養(yǎng)條件中至少有兩種分別進行改變。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件是逐步提高滲透壓使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件是逐步提高乳酸濃度使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件是逐步提高氨濃度使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件是同時逐步提高乳酸濃度和氨濃度使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件是逐步提高PH值使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件是逐步提高攪拌速度使得預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)達(dá)到預(yù)定的極限值。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，把所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件直接調(diào)整到預(yù)定的值。
11.如權(quán)利要求4至9的任意一個所述的方法，其特征在于，所述預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)為細(xì)胞活性，預(yù)定的極限值是指細(xì)胞活性低于50%。
12.如權(quán)利要求4至9的任意一個所述的方法，其特征在于，所述預(yù)定的細(xì)胞生長參數(shù)為細(xì)胞倍增期，預(yù)定的極限值是指細(xì)胞倍增期無法保持穩(wěn)定。
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞株是哺乳動物細(xì)胞株。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，進一步用無血清克隆化方法對獲得的細(xì)胞進行篩選，獲得生長代謝穩(wěn)定的高耐受細(xì)胞株。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述高耐受細(xì)胞株所表達(dá)的產(chǎn)物質(zhì)量合格。
16.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在低營養(yǎng)物濃度的條件下對所述細(xì)胞株進行篩選。
17.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在高細(xì)胞密度的條件下對所述細(xì)胞株進行篩選。
全文摘要
本申請涉及生物工程技術(shù)，尤其涉及篩選高耐受細(xì)胞株的方法。在本申請的一個方面，本申請?zhí)峁┝艘环N高耐受細(xì)胞株的篩選方法，該方法包括選取可生長細(xì)胞株，將其進行體外培養(yǎng)，改變細(xì)胞培養(yǎng)條件從而迫使細(xì)胞在不良生長環(huán)境中生長代謝，進而篩選獲得適應(yīng)于所述不良生長環(huán)境的高耐受細(xì)胞株，所述改變的細(xì)胞培養(yǎng)條件包括細(xì)胞培養(yǎng)液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、pH值、溶氧濃度或攪拌速度，或者所述細(xì)胞培養(yǎng)條件的兩種或兩種以上的任意組合。通過本申請篩選得到的高耐受細(xì)胞株特別適用于生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)。
文檔編號C12N5/00GK102634476SQ201210051119
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者屈穎, 陳小春 申請人:江蘇太平洋美諾克生物藥業(yè)有限公司