專利名稱：一種酵母培養(yǎng)物在促進(jìn)乳酸利用菌增殖中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酵母培養(yǎng)物在促進(jìn)乳酸利用菌增殖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
通過調(diào)控瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)來加強(qiáng)反芻動(dòng)物對粗飼料的利用近年來成為研究的熱點(diǎn)。目前存在許多方法用以調(diào)控瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)，如應(yīng)用離子載體和抗生素。但對于飼料工業(yè)中應(yīng)用抗生素所引起的問題和尋求安全飼料的廣泛關(guān)注，促使研究者致力于發(fā)展一種新型非抗生素或“天然”的飼料添加劑。微生物飼料添加劑，即直接飼喂微生物 (DFM)，完全滿足發(fā)展需求，因此被推到了歷史前臺。DFM包括細(xì)菌、酵母等，許多研究證明 DFM使用效果良好，尤其是酵母培養(yǎng)物。酵母培養(yǎng)物(Yeast culture, YC)是指由酵母菌在特定工藝條件下經(jīng)充分發(fā)酵后所形成的微生態(tài)制品，主要包括酵母細(xì)胞代謝產(chǎn)物、經(jīng)發(fā)酵后變異的培養(yǎng)基以及少量已無活性的酵母細(xì)胞。酵母培養(yǎng)物的復(fù)雜成分主要包括酵母細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)和酵母細(xì)胞的發(fā)酵代謝產(chǎn)物。作為集營養(yǎng)、保健于一體的新型飼料添加劑，酵母培養(yǎng)物通過調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系有效提高反芻動(dòng)物對飼料的利用率，這也是近年來反芻動(dòng)物學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。 酵母培養(yǎng)物中含有氨基酸、葡萄糖、維生素和有機(jī)酸(乳酸、蘋果酸、甲酸、琥珀酸等)等，而某些瘤胃微生物如乳酸利用菌的生長代謝也需要這些物質(zhì)。所以在一定程度上可以通過乳酸利用菌的生長情況判斷酵母培養(yǎng)物對反芻動(dòng)物的營養(yǎng)情況。酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量又受到菌種、發(fā)酵生產(chǎn)工藝以及檢測手段等因素的影響。酵母菌在不同的培養(yǎng)環(huán)境下，如不同的溫度、濕度或酸堿環(huán)境尤其是底物成分，會產(chǎn)生不同的發(fā)酵產(chǎn)物，而這其中又包含大量的未知生長因子。生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物時(shí)所使用的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝控制參數(shù)對其終端產(chǎn)品中代謝產(chǎn)物的組成、濃度及其生物利用率的穩(wěn)定性有著至關(guān)重要的影響。即便在使用相同酵母菌種的情況下，不同培養(yǎng)基組成或不同的發(fā)酵生產(chǎn)控制工藝會導(dǎo)致酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品中代謝產(chǎn)物組成和濃度出現(xiàn)明顯的差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酵母培養(yǎng)物在制備促乳酸利用菌增殖制劑中的用途。所述酵母培養(yǎng)物是按照包括如下步驟的方法制備得到的將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)進(jìn)行液體發(fā)酵后，收集發(fā)酵液,除去所述發(fā)酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)細(xì)胞得到的無菌液體即為所述酵母培養(yǎng)物。所述液體發(fā)酵在如下條件下進(jìn)行20-40°C、100-200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)10_30小時(shí)后再靜置培養(yǎng)10-60小時(shí)；該振蕩培養(yǎng)是在有氧條件下進(jìn)行的，該靜置培養(yǎng)是在厭氧條件下進(jìn)行的。所述液體發(fā)酵所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)由如下I)-3)的物質(zhì)組成I)碳源，所述碳源為如下A)_C)中的任一種所述碳源具體可由IOg/ 所述氮源具體可由IOg/A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任兩種；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一種；2)氮源，所述氮源為如下D)_F)中的任一種D)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨；E)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任兩種；F)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任一種；3)無機(jī)鹽，所述無機(jī)鹽為 KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, CuSO4, ZnSO4 和 FeSO4所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總濃度為30_300g/L L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 鹿糖和 10g/L-100g/L 糖蜜組成所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總濃度為25_640g/L L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L_40g/L硫酸銨組成；所述無機(jī)鹽中的各組分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為KH2PO4 0. Ig/ L-10. 0g/L、MgSO4 0.0488g/L-4. 88g/L、MnSO4 0.089g/L_3. 56g/L、FeSO4 0.068g/ L-2.714g/L、CaCl2 0. lg/L-4. Og/L, CuSO4 0.0639g/L_2. 556g/L、ZnSO4 0.0561g/ L-2. 244g/L ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為4· 0-6. 5。所述液體發(fā)酵按照包括如下步驟的方法進(jìn)行將所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接種于種子培養(yǎng)基中，20_40°C、100-200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)18-40小時(shí)，獲得種子液；再將所述種子液按照(1-30) 100的體積比接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行所述液體發(fā)酵；所述種子液中所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)的濃度為 106_108cfu/L。所述種子培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)為葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO4，在所述種子培養(yǎng)基中各溶質(zhì)的濃度分別為葡萄糖10g/L-40g/L、酵母粉5. 0g/L-40g/L、蛋白胨5. Og/ L-40g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L。本發(fā)明還提供一種乳酸利用菌的培養(yǎng)方法，該方法包括將所述乳酸利用菌接種于含有所述酵母培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。在上述應(yīng)用或方法中，所述乳酸利用菌為反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant)或埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa)。在上述應(yīng)用或方法中，所述反會獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant)具體可為反會獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant ATCC NO. 12561);所述埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al. )Rogosa)具體可為埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al. )Rogosa ATCC NO. 17752)。實(shí)驗(yàn)證明，使用上述工藝制備得到的酵母培養(yǎng)物分別培養(yǎng)乳酸利用菌反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant ATCC NO. 12561)和埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al. ) Rogosa ATCC NO. 17752)可使其生物量分別提高2. 6-3. 5倍和2. 4-3. 8倍。本發(fā)明為提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)力水平、優(yōu)化飼料組成提供了一個(gè)重要途徑。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例所用的培養(yǎng)基、菌株的詳細(xì)信息如下⑶C培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) :CGMCC 編號為 2. 1882。反會獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant) ATCC 編號為 12561。埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii (Gutierrez et al. ) Rogosa) :ATCC編號為 17752。實(shí)施例I、酵母培養(yǎng)物及其制備方法與應(yīng)用一、酵母培養(yǎng)物的制備I、培養(yǎng)基的配制液體種子培養(yǎng)基稱取IOg葡萄糖、5g酵母粉、5g蛋白胨和O. Ig MnSO4 ·Η20，用IL 蒸餾水加熱溶解后，121°C、0. IMpa高溫滅菌15min，備用。液體發(fā)酵培養(yǎng)基稱取IOg葡萄糖，IOg鹿糖，IOg糖蜜，IOg蛋白胨，IOg酵母膏， 5g 硫酸銨，O. Ig KH2PO4,0. Ig MgSO4 · 7H20，0. Ig MnSO4 · H2O, O. Ig CaCl2,0. IgCuSO4 · 5Η20, O. Ig ZnSO4 · 7Η20 和 O. Ig FeSO4 · 4Η20，蒸餾水溶解后，用 O. lmol/L HCl 溶液調(diào)節(jié) pH 值至
4.O,定容至1L, 121°C、0. IMpa高溫滅菌15min,備用。2、種子液的獲得將凍干保藏的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae CGMCC No. 2. 1882)活化三代后接入上述液體種子培養(yǎng)基中，200C、100轉(zhuǎn)/分鐘振搖培養(yǎng)18h，獲得種子液，經(jīng)檢測，該種子液經(jīng)15倍稀釋后的0D_值為0. 491，釀酒酵母的活細(xì)胞數(shù)為I. I X 109cfu/L。3、發(fā)酵液的獲得將步驟2獲得的種子液按I : 100的體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，20°C、100 轉(zhuǎn)/分鐘條件下發(fā)酵培養(yǎng)IOh后轉(zhuǎn)入20°C恒溫箱中靜置培養(yǎng)10h，獲得發(fā)酵液。4、酵母培養(yǎng)物的獲得將步驟3獲得的發(fā)酵液于4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5min除去菌體，將獲得的上清液用細(xì)菌過濾器(0. 22 μ m)過濾，經(jīng)平板檢驗(yàn)無菌長出，得到的無細(xì)胞濾液即為無菌酵母培養(yǎng)物。二、利用酵母培養(yǎng)物對乳酸利用菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)將凍干保藏的兩種乳酸利用菌反芻獸月形單胞菌和埃氏巨型球菌分別進(jìn)行如下步驟1-4的實(shí)驗(yàn)I、活化后分別接入⑶C培養(yǎng)基，20°C嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)20h，獲得菌懸液；2、制備如下培養(yǎng)基乳酸鈉 15ml、硫酸銨 0.6g、NaCl 0. 5g、KH2PO4 0. lg/L、 MgSO4 · 7H20 0. lg/L、MnSO4 · H2O 0. 2g/L、CaCl2 2g/L、CuSO4 · 5H20 2g/L、ZnSO4 · 7H201g/L、 FeSO4 · 4H20 0. 3g/L, pH 值為 4. 5。
3、設(shè)置如下兩組處理，每種處理3次重復(fù)處理I (實(shí)驗(yàn)組)取5ml步驟2制備的培養(yǎng)基、O. 025ml步驟一制備的酵母培養(yǎng)物和O. 005ml的乳酸利用菌菌懸液(約I X 107cfu/ml)在IOml無菌離心管中混合后密封， 37°C恒溫培養(yǎng)24h，得到乳酸利用菌培養(yǎng)液。處理2 (對照組)取5ml步驟2制備的培養(yǎng)基、O. 025ml無菌水和O. 005ml的乳酸利用菌菌懸液(約I X 107cfu/ml)在IOml無菌離心管中混合后密封，37°C恒溫培養(yǎng)24h，得到乳酸利用菌培養(yǎng)液。4、培養(yǎng)液中乳酸利用菌的生物量測定以乳酸利用菌培養(yǎng)基(即步驟2制備的培養(yǎng)基)為調(diào)零空白對照，將步驟3培養(yǎng)的乳酸利用菌培養(yǎng)液直接用TU-1901紫外可見分光光度計(jì)測定其在600nm波長條件下的吸光值即OD6tltl值，結(jié)果如表I所示。表I.培養(yǎng)液中乳酸利用菌生物量的測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種酵母培養(yǎng)物在制備促乳酸利用菌增殖制劑中的應(yīng)用；所述酵母培養(yǎng)物是按照包括如下步驟的方法制備得到的將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)進(jìn)行液體發(fā)酵后，收集發(fā)酵液，除去所述發(fā)酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)細(xì)胞得到的無菌液體即為所述酵母培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述液體發(fā)酵在如下條件下進(jìn)行 20-400C >100-200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)10-30小時(shí)后再靜置培養(yǎng)10-60小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述液體發(fā)酵所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)由如下I)-3)的物質(zhì)組成1)碳源，所述碳源為如下A)-C)中的任一種A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任兩種；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一種；2)氮源，所述氮源為如下D)-F)中的任一種D)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨；E)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任兩種；F)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任一種；3)無機(jī)鹽，所述無機(jī)鹽為KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, CuSO4, ZnSO4 和 FeSO4 ；所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總濃度為30-300g/L;所述碳源具體可由IOg/L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 鹿糖和 10g/L-100g/L 糖蜜組成；所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總濃度為25-640g/L;所述氮源具體可由IOg/ L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L_40g/L硫酸銨組成；所述無機(jī)鹽中的各組分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為=KH2PO4 0. lg/L-10. 0g/L、 MgSO4 0. 0488g/L-4. 88g/L、MnSO4 0. 089g/L_3. 56g/L、FeSO4 0. 068g/L_2. 714g/L、CaCl2 0. lg/L-4. 0g/L、CuSO4 0. 0639g/L_2. 556g/L、ZnSO4 0. 0561g/L_2. 244g/L ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為4. 0-6. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述液體發(fā)酵按照包括如下步驟的方法進(jìn)行將所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接種于種子培養(yǎng)基中，20-40°C、100-200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)18-40小時(shí)，獲得種子液；再將所述種子液按照(1-30) 100的體積比接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行所述液體發(fā)酵。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)為葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO4，在所述種子培養(yǎng)基中各溶質(zhì)的濃度分別為葡萄糖10g/L-40g/ L、酵母粉 5. 0g/L-40g/L、蛋白胨 5. 0g/L_40g/L、MnSO4 0. 089g/L_3. 56g/L。
6.一種乳酸利用菌的培養(yǎng)方法，包括將所述乳酸利用菌接種于含有所述酵母培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于所述乳酸利用菌為反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant)或埃氏巨型球菌 (Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al.)Rogosa)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用或方法，其特征在于所述反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant)為反會獸月形單胞菌 (Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant ATCC NO. 12561);所述埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al.)Rogosa)為埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii (Gutierrez et al.)Rogosa ATCC NO. 17752)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母培養(yǎng)物在促進(jìn)乳酸利用菌增殖中的應(yīng)用。所述酵母培養(yǎng)物是按照包括如下步驟的方法制備得到的將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)進(jìn)行液體發(fā)酵后，收集發(fā)酵液，除去所述發(fā)酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)細(xì)胞得到的無菌液體即為所述酵母培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)證明，使用所述酵母培養(yǎng)物分別培養(yǎng)乳酸利用菌反芻獸月形單胞菌(Selenomonas ruminantium subsp.ruminantium Bryant ATCC NO.12561)和埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa ATCC NO.17752)可使其生物量分別提高2.6-3.5倍和2.3-3.8倍。本發(fā)明為提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)力水平、優(yōu)化飼料組成提供了一個(gè)重要途徑。
文檔編號C12N1/18GK102604862SQ20121005202
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者劉萍, 徐樂, 解洛香 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)