專利名稱：一種海洋石油降解菌劑及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋環(huán)境治理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海洋石油降解菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著世界對石油及其制品需求的日益增長，在海上開采、運輸、裝卸以及利用石油過程中的溢油事故也日漸增多。溢油不僅造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，并且由于石油烴類污染物的潛在毒性和生物累積效應(yīng)會導(dǎo)致近岸海域環(huán)境質(zhì)量和生物種類多樣性指數(shù)嚴(yán)重下降，破壞生態(tài)系統(tǒng)的功能，對水產(chǎn)業(yè)和旅游業(yè)也會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。另外，石油烴中的多環(huán)芳烴類化合物具有強(qiáng)烈的致畸、致癌和致突變效應(yīng)，可能通過食物鏈進(jìn)入人體，對人體健康具有很大的潛在危害。因此，研究近岸海洋環(huán)境中石油烴污染物的控制與修復(fù)問題對于保持海洋生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)，保障人民的身體健康以及促進(jìn)經(jīng)濟(jì)和社會的可持續(xù)發(fā)展無疑具有重要的現(xiàn)實意義。微生物降解是去除環(huán)境中石油污染物的主要途徑。生物修復(fù)是指利用生物特別是微生物來催化降解環(huán)境污染物，減小或最終消除環(huán)境污染的受控或自發(fā)過程，是在微生物降解基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新興的環(huán)保技術(shù)。微生物修復(fù)石油污染主要包括在污染區(qū)域接種微生物、添加營養(yǎng)物及提供電子受體等幾種方法。其中，在污染區(qū)域接種微生物進(jìn)行石油污染的治理被稱為生物強(qiáng)化技術(shù)。但石油烴降解菌往往無法在現(xiàn)場獲得直接應(yīng)用，原因可能是由于單位體積內(nèi)有效降解菌濃度低、反應(yīng)啟動慢、與土著菌競爭處于劣勢、抗毒性侵害能力差、對環(huán)境條件敏感等。固定化微生物技術(shù)是新興起的一種新型生物技術(shù)，它利用化學(xué)或物理的手段將酶或微生物細(xì)胞限制于某一特定空間范圍內(nèi)，并保持其生物活性。微生物固定化修復(fù)技術(shù)的主要特點是對完整的微生物細(xì)胞進(jìn)行固定，可避免人為破壞生物酶的活性和生化反應(yīng)的穩(wěn)定性，可提高單位體積水體內(nèi)微生物細(xì)胞密度，并可加快細(xì)胞的流動速率，在稀釋率高于微生物生長率的情況下，能有效地解決污染環(huán)境修復(fù)問題。固定化后的微生物能長期保持活性，固定化微生物載體的微環(huán)境有利于屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物質(zhì)對微生物體的惡性競爭、吞噬和毒害，減輕海浪的剪切力對微生物的損害， 使其在復(fù)雜環(huán)境中穩(wěn)定地發(fā)揮高效性能。對于污染物濃度較低，空間分布區(qū)域廣的海洋水體而言，微生物固定化無疑具有特殊的技術(shù)優(yōu)勢。固定化微生物方法多種多樣，主要有表面吸附固定化、交聯(lián)固定化、包埋固定化和自身固定化等幾種方法。由于海洋油污染是飄浮在海水表面上，為了使降解菌能充分與油污染物接觸，最大限度地對其進(jìn)行降解，應(yīng)選擇表面吸附固定化方法。載體是固定化的關(guān)鍵，國內(nèi)外采用的載體種類很多，主要有機(jī)高分子載體、無極分子載體和復(fù)合載體三種。如硬性填料、軟性填料、聚苯乙烯球、活性炭、焦炭末、細(xì)石英砂、煙道灰、爐渣等，但是都存在缺陷。海洋石油降解菌劑的固定載體需要滿足以下條件(I)可降解，避免造成海洋環(huán)境的二次污染；(2)可漂浮，由于油污染是漂浮在海水表面的，微生物只有固定在可漂浮的載體上才能與污染物充分接觸，進(jìn)行降解；(3)生物相容性好，能夠固定足夠數(shù)量的降解菌；(4)對景觀影響小，菌劑主要應(yīng)用在港口海域，不能對景觀造成破壞。殼聚糖是甲殼素的部分脫乙?；a(chǎn)物，是自然界中唯一的堿性多糖。它是葡糖胺和N-乙酰葡萄糖胺的復(fù)合物，由D-氨基葡萄糖和適量的N-乙酰-D-氨基葡萄糖以(I, 4)糖苷鍵連接而組成的。其化學(xué)名是(I，4)-2-氨基-2-脫氧-P-D-葡萄糖，結(jié)構(gòu)類似于纖維素，外觀呈半晶體狀態(tài)。作為氨基多糖，殼聚糖(PKa = 6. 5)溶解性與pH值緊密相關(guān)， 在酸性條件下，由于氨基質(zhì)子化而溶于水。在PH < 5時，殼聚糖完全溶于水形成十分粘稠的液體。殼聚糖是一種帶正電荷的陽離子聚合物，在酸性水溶液中可與聚陰離子化合物如 肝素、海藻酸鈉、羧甲基甲殼素等相互作用，形成聚電解質(zhì)配合物。海藻酸鈉是存在于褐藻類中的親水性膠態(tài)多聚糖，白色或淡黃色粉末狀，無臭無味，易溶于水。從分子角度來說，它是直鏈高分子，分子量在32kDa到200kDa之間，包括兩種單體B — 1，4結(jié)構(gòu)的D型甘露糖醛酸鈉鹽(M)和a— 1，4結(jié)構(gòu)的L型古羅糖醛酸鈉鹽 (G)。這兩種單體的比例是隨其來源而變化的，高聚物的羧基是交聯(lián)發(fā)生的位點，pK值約為
3.4 4. 4。海藻酸鈉與二價及二價以上的金屬離子如Ca2+、Ba2+、Cu2+、CO2+、Mn2+、Al3+等能發(fā)生置換反應(yīng)，生成可在高溫下使用的不可逆凝膠。對于二價陽離子與海藻酸鹽的凝膠反應(yīng)， Grantl等曾用一種叫“雞蛋盒模型”的合作式模型進(jìn)行了解釋。一般ca2+的反應(yīng)發(fā)生在古羅糖醛酸殘基的功能團(tuán)上，而Cu2+、CO2+和Mn2+會與兩種殘基的羧基反應(yīng)。復(fù)凝聚法是指利用兩種聚合物在不同的pH值下電荷的變化，即一種帶負(fù)電荷的膠體溶液與一種帶正電荷的膠體溶液相混，由于異種電荷之間的相互作用形成聚電解質(zhì)復(fù)合物。海藻酸鈉、聚丙基酸鈉等高分子材料均能與殼聚糖起復(fù)凝聚作用。海藻酸鈉與殼聚糖進(jìn)行復(fù)凝聚反應(yīng)，形成的復(fù)合膜具有原料來源廣泛，價格低廉， 固定化條件溫和，操作簡單，生物相容性好，基質(zhì)和產(chǎn)物擴(kuò)散阻力小等優(yōu)點，是制備微生物固定載體的理想材料。因此，將石油降解菌群附著在一種用海藻酸鈉與殼聚糖的復(fù)合膜制成的可漂浮可降解的生物固定載體上，從而制備出的石油降解菌劑有望用于海洋石油污染的治理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠降解海洋石油污染的菌劑，該菌劑能夠漂浮在水面上進(jìn)行石油污染的降解，且自身也能較快被降解，不造成二次污染。本發(fā)明主要通過以下技術(shù)手段來實現(xiàn)一方面通過富集培養(yǎng)的方法從被石油污染的海水中獲得石油降解菌群；另一方面是用膨化后的可降解材料作為核心，外層包被可降解的帶正電復(fù)合膜來制備生物固定載體。膨化可降解材料使生物固定載體具有漂浮性，可降解復(fù)合膜帶正電，能夠與帶負(fù)電的菌體互相吸引，使細(xì)菌牢固附著在載體上，而且復(fù)合膜呈多孔狀的疏松結(jié)構(gòu)，使降解菌群能夠附著在復(fù)合膜孔狀結(jié)構(gòu)的壁上。為此本發(fā)明公開了一種能夠降解海洋石油污染的菌劑，包括菌群和生物固定載體，其特征在于由海洋石油降解菌群附著可漂浮可降解的生物固定載體上制成。其中石油降解菌群從石油污染的海水中富集培養(yǎng)得到。選自食烷菌屬、無色桿菌屬、不動桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、棒桿菌屬、微桿菌屬、微球菌屬、假單孢菌屬、弧菌屬、氣單孢菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬、放線菌屬、諾卡氏菌屬中的一種或它們的任何組合。生物固定載體的核心可降解材料選自淀粉、木質(zhì)纖維、木屑、玉米粒、玉米芯、麥麩、甲殼素、大黃米、小黃米、大米、秸桿粉中之一或它們的任何組合。可降解復(fù)合膜的材料選自微晶纖維、羧甲淀粉鈉、羧甲基纖維素鈉、羧丙基纖維素、殼聚糖、明礬、海藻酸鈉、聚乙二醇、丙烯酰胺、瓊脂中之一或它們的任何組合制成。另一方面，本發(fā)明還公開了所述石油降解菌劑的制備方法，包括下列步驟(I)將高溫高壓膨化后的可降解材料作為核心，加入到帶電復(fù)合膜的可降解材料的溶液中，攪拌5-10min，撈起備用；(2)將浸泡過復(fù)合膜降解材料溶液的核心材料加入到成膜無機(jī)鹽溶液中，攪拌 5-10min,進(jìn)行成膜反應(yīng),反應(yīng)后撈起,作為濕生物載體；(3)將濕生物載體加入石油降解菌群的培養(yǎng)液中，100rpm，30°C搖床震蕩3小時， 進(jìn)行菌體附著，撈出，作為濕菌劑；(4)將濕菌劑在_70°C預(yù)凍4小時，凍干機(jī)-56°C真空凍干后，4°C保存。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有如下顯著特征(I)降解菌劑為完全可降解的材料組成。一般在制備菌劑時，所用的生物固定載體為三氧化二鋁、硅藻土、粘土、活性碳、多孔玻璃等，這些材料不能降解，在大量使用時會對海洋環(huán)境造成二次污染。本發(fā)明所用的生物固定載體完全是可降解材料，應(yīng)用到海洋環(huán)境治理中可以降解，不用回收，沒有二次污染。(2)降解菌劑具有漂浮性。海洋石油污染一般是漂浮在海面上，如果用三氧化二鋁、硅藻土、粘土、活性碳、多孔玻璃等作載體，菌劑會沉到海底，無法與石油污染接觸，不能起到降解作用。本發(fā)明所制備的菌劑可以漂浮在海水表面，使降解菌能與石油污染物充分接觸，進(jìn)行降解。


圖I :固定載體的形態(tài)A濕的固定生物載體；B冷凍干燥后的固定生物載體。圖2 :電子顯微鏡下帶電復(fù)合膜的多孔狀結(jié)構(gòu)。圖3 :干燥后的菌劑形狀。圖4 :菌劑在電子顯微鏡下的形態(tài)A空載體的形狀；B菌體在載體復(fù)合膜上的附著情況，紅圈內(nèi)表不一個附著菌。圖5 :菌劑降解石油效果圖菌劑加入含石油培養(yǎng)基中培養(yǎng)降解7天后，用石油醚將殘存的石油萃取出來。A未加入菌劑的含石油培養(yǎng)基經(jīng)石油醚萃取后；B加入菌劑的含石油培養(yǎng)基經(jīng)石油醚萃取后。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。
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實施例I.原油降解菌群的富集、培養(yǎng)從受原油污染的海水區(qū)域采集表層水樣，用滅菌后的4L棕色玻璃瓶取2L表層海水后密封保存，24h內(nèi)進(jìn)行微生物的富集培養(yǎng)工作。將采集的水樣取ImL接種于含0. 5% (v/v)原油的IOOmL滅菌的人工海水培養(yǎng)基 (MMC)中。MMC 的配方為(每升含量)=NaCl 24g ；MgS04 7H20 0. 7g ；NH4NO3 Ig ；KC1 0. 7g ； KH2PO4 2g ；Na2HPO4 12H20 3g ；pH7. 5，滅菌后補(bǔ)加適量微量元素混合。微量元素經(jīng)0. 22 u m 濾膜過濾除菌，其組成(每升含量)如下CaCl2 2mg ；FeCl3 6H20 50mg ；CuSO4 0. 5mg ； MnCl2 4H20 0. 5mg ；ZnSO4 7H20 10mg/L。在30°C，180rpm的搖床培養(yǎng)7天后，從培養(yǎng)液中取出ImL轉(zhuǎn)接入IOOmL新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的原油濃度提高至I % (v/v)，在相同的條件下培養(yǎng)7天，重新轉(zhuǎn)接。按上述方法重復(fù)5次，原油濃度按梯度(0.5^^1^^1.5^^2^^2.5% )提高，富集培養(yǎng)五個周期。 取富集后的石油降解菌群，20%甘油保存于-70°C，備用。實施例2.可漂浮、可降解生物固定載體的制備分別配制I %的CaCl2溶液，I %的海藻酸鈉溶液和I %的殼聚糖及I %的CaCl2混合溶液。稱取適量膨化小黃米，加入I %的CaCl2溶液中，攪拌浸潤5-10分鐘；從CaCl2溶液中取出浸潤后膨化小黃米，加入I %的海藻酸鈉溶液中，攪拌5-10分鐘，進(jìn)行成膜反應(yīng)； 從海藻酸鈉溶液中取出載體半成品，此時載體半成品由膨化小黃米外包一層海藻酸鈣膜構(gòu)成，將載體半成品加入I %的殼聚糖及I %的CaCl2混合溶液中，攪拌5-10分鐘，進(jìn)行復(fù)凝聚作用，使外層的海藻酸鈣膜與殼聚糖復(fù)凝集成復(fù)合膜；將載體從混合溶液中取出，備用， 如圖I所示。實施例3.石油降解菌群的活化、培養(yǎng)取_70°C保存的石油降解菌群，以1%的比例接種到5ml LB培養(yǎng)基中，180rpm， 30°C搖床培養(yǎng)8小時進(jìn)行活化。LB培養(yǎng)基組成如下(每升含量)NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g?；罨蟮呐囵B(yǎng)物再按照I %的比例接種到500ml LB培養(yǎng)基中。180rpm，30°C 搖床培養(yǎng)3-6小時，OD600值為0. 6 I. 0之間，作為制備菌劑的降解菌培養(yǎng)液。實施例4.石油降解菌劑的制備將實施例2所制備的載體與實施例3所制備的降解菌培養(yǎng)液按照I : 10 (w/v)混合，I IOrpm,30 V搖床培養(yǎng)3小時，使降解菌粘附、固定在生物固定載體上。3小時以后，取出制備好的菌劑，用LB培養(yǎng)基沖洗后，置于-70°C，預(yù)凍4小時。4小時后，取出預(yù)凍好的菌劑，在-56°C條件下，真空冷凍干燥后得菌劑終產(chǎn)物(圖3)，4°C保存。實施例5.固定載體及石油降解菌劑的掃描電鏡觀察將干燥的固定載體及石油降解菌劑碾碎后，進(jìn)行表面噴金，然后置于掃描電鏡下觀察。電壓設(shè)為20kv，在適宜的放大倍數(shù)下觀察載體及菌劑表面情況。固定載體的表層復(fù)合膜在電鏡下呈現(xiàn)多孔的疏松狀結(jié)構(gòu)，如圖2所示，而降解菌劑中，石油降解菌附著在載體表面的孔洞中，如圖4所示。實施例6.石油降解菌劑對石油的降解將石油降解菌劑按照I %的濃度接種到含原油0. 5 %的50ml MMC培養(yǎng)基中，30°C、 180rpm搖床培養(yǎng)7天，培養(yǎng)液用于降解率的測定。
實施例7.石油降解菌劑對石油降解率的測定將培養(yǎng)液倒入IOOmL的分液漏斗，取20mL石油醚沖洗三角瓶后一并倒入分液漏斗中，加蓋充分振搖2min，并注意放氣，靜置分層2min，將下層液體培養(yǎng)基放回?fù)u瓶中。用上面放有2g無水硫酸鈉的漏斗過濾上層石油醚萃取液，濾液置于IOOmL容量瓶中。再將液體培養(yǎng)基倒人分液漏斗，用20mL石油醚沖洗搖瓶，重復(fù)提取2次，合并2次提取液于IOOmL容量瓶中，用石油醚定容，在紫外分光光度計225nm處，以石油醚為參比測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出石油降解率。經(jīng)測定，菌劑對石油的7天降解效率為82. 3%，石油醚萃取后的殘余石油如圖5所示。本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只欲作為本發(fā)明各個方面的例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種海洋石油降解菌劑，包括生物固定載體和石油降解菌群，其特征是該菌劑由海洋石油降解菌群附著在可漂浮可降解的生物固定載體上制成。
2.按權(quán)利要求I所述的石油降解菌劑，其特征是生物固定載體用膨化后的可降解材料作為核心，外層包被可降解的帶正電復(fù)合膜。
3.按照權(quán)利要求I所述的石油降解菌劑，其特征是所說石油降解菌群是從石油污染的海水中富集培養(yǎng)得到。
4.按照權(quán)利要求2所述的石油降解菌劑，其特征是所說可降解材料選自淀粉、木質(zhì)纖維、木屑、玉米粒、玉米芯、麥麩、甲殼素、大黃米、小黃米、大米、秸桿粉中之一或它們的任何組合。
5.按照權(quán)利要求2所述的石油降解菌劑，其特征是所說的帶正電復(fù)合膜由選自微晶纖維、羧甲淀粉鈉、羧甲基纖維素鈉、羧丙基纖維素、殼聚糖、明礬、海藻酸鈉、聚乙二醇、丙烯酰胺、瓊脂中之一或它們的任何組合制成。
6.按照權(quán)利要求3所述的石油降解菌劑，其特征是所說的菌群選自食烷菌屬、無色桿菌屬、不動桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、棒桿菌屬、微桿菌屬、微球菌屬、假單孢菌屬、弧菌屬、氣單孢菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬、放線菌屬、諾卡氏菌屬中的一種或它們的任何組合。
7.按照權(quán)利要求5所述的石油降解菌劑，其特征是所說的的帶正電復(fù)合膜要在無機(jī)鹽溶液中進(jìn)行成膜反應(yīng)。
8.按照權(quán)利7所述的石油降解菌劑，其特征是所說的無機(jī)鹽溶液由選自氯化鈣、碳酸鈣、磷酸鈣、氫氧化鈣、硫酸鈣中的一種或它們的任何組合。
9.按照權(quán)利要求I所述的石油降解菌劑的制備方法，包括下列步驟(1)將高溫高壓膨化后的可降解材料作為核心，加入到帶電復(fù)合膜的可降解材料的水溶液中，攪拌5-10min，撈起備用；(2)將浸泡過復(fù)合膜降解材料水溶液的核心材料加入到成膜無機(jī)鹽溶液中，攪拌 5-10min,進(jìn)行成膜反應(yīng),反應(yīng)后撈起,作為濕生物載體；(3)將濕生物載體加入石油降解菌群的培養(yǎng)液中，100rpm，30°C搖床震蕩3小時，進(jìn)行菌體附著，撈出，作為濕菌劑；(4)將濕菌劑在_70°C預(yù)凍4小時，上凍干機(jī)，-56°C真空凍干后，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋環(huán)境治理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海洋石油降解菌劑及其制備方法。本發(fā)明公開了一種海洋石油降解菌劑，包括石油降解菌群和生物固定載體，其特征在于該菌劑由海洋石油降解菌群附著在一種可漂浮可降解的生物固定載體上制成。本發(fā)明所述生物固定載體用膨化可降解材料作為核心，外層包被可降解的帶正電復(fù)合膜；膨化可降解材料使生物固定載體具有漂浮性；可降解復(fù)合膜帶正電，能夠與帶負(fù)電的菌體互相吸引，使細(xì)菌牢固附著在載體上，而且復(fù)合膜呈多孔狀的疏松結(jié)構(gòu)，使降解菌群能夠附著在復(fù)合膜孔狀結(jié)構(gòu)的壁上；與單純的石油降解菌群相比，降解菌劑的降解效率提高顯著。本發(fā)明所涉及的海洋石油降解菌劑有望用于海洋石油污染的生物修復(fù)治理。
文檔編號C12N11/02GK102604924SQ20121005542
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者何穎, 侯登勇, 劉玉明, 劉瓊, 李珂嫻, 沈先榮, 王慶蓉, 莫琳芳, 蔣定文, 錢甜甜, 陳偉 申請人:中國人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所