專利名稱：檢測樣品中的甲基化dna的方法
檢測樣品中的甲基化DNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含DNA的樣品檢測甲基化DNA的方法。
背景技木高等真核生物的染色體DNA中已知構(gòu)成DNA的堿基之中C(胞嘧啶)的5位被甲基化。這樣的DNA的甲基化作為基因表達(dá)的控制結(jié)構(gòu)發(fā)揮功能。例如，在某基因的啟動(dòng)子 區(qū)域存在的富含CpG序列的區(qū)域(也稱為“CpG島”或“ CG島”)被甲基化時(shí)，其基因的轉(zhuǎn)錄被抑制。此現(xiàn)象也稱為“基因的沉默”。對(duì)此，當(dāng)CpG島不被甲基化時(shí)，由于轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合到啟動(dòng)子，從而基因的轉(zhuǎn)錄變得可能。如上所述，DNA的甲基化是基因表達(dá)的控制結(jié)構(gòu)之一。即，DNA的甲基化在初期胚發(fā)生、組織特異性的基因的表達(dá)、作為哺乳動(dòng)物中特征性的現(xiàn)象的基因印跡及X染色體的失活、染色體的穩(wěn)定化、DNA復(fù)制之時(shí)機(jī)等各種各樣的生理的及病理性的現(xiàn)象中實(shí)現(xiàn)重要的作用。再者近年明白，DNA的甲基化的異常、即，由DNA的甲基化所致的基因的沉默，與癌等的疾病相關(guān)。因此，對(duì)于各種的基因檢測甲基化DNA的重要性近年越發(fā)增加。檢測甲基化DNA的方法在所述技術(shù)中已知各種方法,可例舉例如亞硫酸氫鹽測序法、使用甲基化感受性限制酶的方法、使用甲基化DNA免疫沉降的方法(MeDIP法)等。亞硫酸氫鹽測序法是通過亞硫酸氫鹽的作用將DNA中的非甲基化胞嘧啶變換為尿嘧啶，通過確定堿基序列，檢測DNA中的被甲基化的部位。使用甲基化感受性限制酶的方法是利用甲基化感受性限制酶不可切斷被甲基化的識(shí)別序列的特點(diǎn)，通過檢查其切斷結(jié)果來檢測甲基化DNA。MeDIP法是使用特異性地識(shí)別甲基化DNA的抗體或甲基化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)來進(jìn)行免疫沉降，通過將得到的甲基化DNA供于微陣列解析等來檢測甲基化DNA。再有，此方法也被稱為MeDIP-Chip法。在特開2008-263961號(hào)公報(bào)中公開了在使用甲基化感受性限制酶的檢測甲基化DNA的方法中，使用抗甲基化DNA抗體將樣品中的甲基化DNA固定到固相，用甲基化感受性限制酶進(jìn)行消化處理的方法。如此，甲基化DNA的檢測的重要性增加，期望新的檢測甲基化DNA的方法的開發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的范圍僅由隨附的權(quán)利要求定義，且不以任何程度受此發(fā)明內(nèi)容部分的影響。本發(fā)明旨在提供用于檢測樣品中的甲基化DNA的新的方法。本發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)，通過使可結(jié)合到甲基化DNA的蛋白質(zhì)和甲基化DNA結(jié)合，該甲基化DNA不被脫氧核糖核酸酶完全地分解而殘留，再者得到的脫氧核糖核酸酶分解產(chǎn)物不給檢測步驟帶來影響，從而完成本發(fā)明。S卩，本發(fā)明是(I)檢測樣品中的甲基化DNA的方法，其包括
使有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)接觸，從而使上述樣品中的甲基化DNA和上述蛋白質(zhì)結(jié)合；使通過上述結(jié)合步驟得到的樣品和至少I種脫氧核糖核酸酶接觸，而將上述樣品中的DNA分解 '及在通過上述分解步驟得到的樣品中，通過與上述蛋白質(zhì)的結(jié)合來檢測不被上述脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA ;其中上述脫氧核糖核酸酶的至少I種是與可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶不同的脫氧核糖核酸酶。(2)⑴所述的方法，其中上述可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)是抗甲基化DNA抗體或甲基化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。 (3)⑴所述的方法，其中上述可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)是抗甲基化DNA抗體。(4) (I)所述的方法，其中上述可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)是選自下列的至少I種甲基化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)MBD1、MBD2、MBD4 及 MeCP2。(5) (I) ⑷之任一項(xiàng)所述的方法，其中上述樣品是由培養(yǎng)細(xì)胞株或從活體采集的血液、體液、組織或細(xì)胞制備的樣品。(6) (I) ⑷之任一項(xiàng)所述的方法，其中上述脫氧核糖核酸酶是選自下列的至少I種脫氧核糖核酸酶I、外切核酸酶I、λ -外切核酸酶、Τ7外切核酸酶、外切核酸酶III、RecJ型外切核酸酶、外切核酸酶T、BAL31核酸酶、緑豆核酸酶、微球菌-核酸酶及T7內(nèi)切核酸酶。(7) (I) ⑷之任一項(xiàng)所述的方法，其中上述樣品是有含單鏈甲基化DNA的可能性的樣品，在檢測上述甲基化DNA的步驟中，檢測單鏈甲基化DNA。(8) (I) ⑷之任一項(xiàng)所述的方法，其中在檢測上述甲基化DNA的步驟中，使用核酸擴(kuò)增法、堿基測序法或微陣列法來檢測甲基化DNA。根據(jù)本發(fā)明可提供用于檢測樣品中的甲基化DNA的新的方法。根據(jù)本發(fā)明還可省略在以往的檢測甲基化DNA的方法中對(duì)于檢測精度的升高必要的清洗操作及純化操作。此時(shí)，可更簡便地檢測樣品中的甲基化DNA。

圖I是伴隨以作為合成寡核苷酸的6MeCG寡核苷酸的溶液作為樣品，作為脫氧核糖核酸酶使用DNaseI的本發(fā)明的檢測方法，通過PCR法檢測該寡核苷酸的電泳照片。圖2是伴隨以作為合成寡核苷酸的6MeCG寡核苷酸的溶液作為樣品，作為脫氧核糖核酸酶使用外切核酸酶I的本發(fā)明的檢測方法，通過PCR法檢測該寡核苷酸的電泳照片。圖3是伴隨以從乳癌細(xì)胞株MCF7得到的基因組DNA作為樣品，作為脫氧核糖核酸酶使用DNaseI的本發(fā)明的檢測方法，通過PCR法檢測甲基化DNA的電泳照片。
圖4是伴隨以從MCF7細(xì)胞得到的基因組DNA作為樣品，作為脫氧核糖核酸酶使用外切核酸酶I的本發(fā)明的檢測方法，通過PCR法檢測甲基化DNA的電泳照片。實(shí)施方式
以下參照

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本說明書中“CpG部位”是指在DNA的堿基序列中，胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)在從5’向3’的方向依此順序鄰接的部位。再有，CpG的“p”的文字表示胞嘧啶和鳥嘌呤之間的
憐Ife~■酷鍵。本說明書中“甲基化CpG部位”是指胞嘧啶的5位被甲基化修飾的CpG部位。即，在甲基化CpG部位，5-甲基胞嘧啶(甲基化胞嘧啶)和鳥嘌呤在從5’向3’的方向依此順序鄰接。本說明書中“甲基化DNA”是指含至少I個(gè)5-甲基胞嘧啶的DNA。在本發(fā)明的檢測樣品中的甲基化DNA的方法(以下也稱為“檢測方法”)中，首先，使有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)接觸。通過此接觸，在該樣品中存在甲基化DNA之時(shí),可使甲基化DNA和上述的蛋白質(zhì)結(jié)合(以下，將此步驟稱之為“結(jié)合步驟”)。在一方面，本發(fā)明的檢測方法是體外方法。在本發(fā)明的檢測方法中，與上述的蛋白質(zhì)結(jié)合的甲基化DNA不被以下的步驟中使用的脫氧核糖核酸酶完全地分解。即，通過與上述的蛋白質(zhì)的結(jié)合，甲基化DNA中的5-甲基胞嘧啶及其周邊區(qū)域免于被脫氧核糖核酸酶分解。提供于本發(fā)明的檢測方法的樣品只要是有含甲基化DNA的可能性的樣品，就不特別限定。那樣的樣品而言，可例舉例如，從活體樣品制備的含有DNA的樣品、含有含至少I個(gè)5-甲基胞嘧啶的合成多核苷酸的樣品等?；铙w樣品而言，可例舉例如培養(yǎng)細(xì)胞株、從活體采集的血液、體液、組織、細(xì)胞等。本說明書中“血液”是全血、以及從其得到的血清及血漿之任何也可。在本說明書中，“組織”及“細(xì)胞”包括從活體采集的組織及細(xì)胞的培養(yǎng)物。當(dāng)有含甲基化DNA的可能性的樣品是由從活體采集的血液、體液、組織或細(xì)胞制備的樣品時(shí)，本發(fā)明的檢測方法的結(jié)果可在與DNA的甲基化關(guān)聯(lián)的疾病的診斷或判斷中利用。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，從活體樣品的含有DNA的樣品的制備可根據(jù)所述技術(shù)中公知的方法來進(jìn)行。例如，可將含使細(xì)胞或組織可溶化的表面活性劑(膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉等)的可溶化液和活體樣品混合之后，實(shí)施物理處理(攪拌、均化、超聲波破碎等)來使活體樣品中含的DNA游離到可溶化液中，通過提取DNA來制備樣品。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，將提取的DNA通過所述技術(shù)中公知的方法純化也可。從活體樣品的DNA的提取及純化使用市售的試劑盒進(jìn)行也可。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，樣品中的DNA優(yōu)選是100 IOOObp左右的DNA片段。通過將樣品中含的DNA片段化成那樣的長度，可使甲基化DNA和可結(jié)合到甲基化DNA的蛋白質(zhì)有效結(jié)合。DNA的片段化可通過物理處理、化學(xué)處理、限制酶處理等的所述技術(shù)中公知的方法來進(jìn)行。物理處理而言，可例舉例如超聲波破碎。化學(xué)處理而言，可例舉例如使用氫氧化鈉的堿處理。限制酶處理中，可基于目的DNA的堿基序列適宜選擇限制酶，例如可使用MseI、BamHI等。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，優(yōu)選通過物理處理將樣品中的DNA片段化。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，有在樣品中含的可能性的甲基化DNA是單鏈甲基化DNA也可。即，上述的樣品是有含單鏈甲基化DNA的可能性的樣品，后述的檢測甲基化DNA的步驟是檢測單鏈甲基化DNA的步驟時(shí)，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，在上述的結(jié)合步驟之前，也可進(jìn)行將樣品中含的DNA變性為單鏈的操作。那樣的操作在所述技術(shù)中公知，例如，可通過將有含甲基化DNA的可能性的樣品加熱至95°C左右之后，快速冷卻至4°C，而將樣品中的DNA變成單鏈。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)只要是可識(shí)別并結(jié)合DNA中的5-甲基胞嘧啶或甲基化CpG部位的蛋白質(zhì)，就不特別限定。那樣的蛋白質(zhì)而言，可例舉例如抗甲基化DNA抗體、甲基化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)等。在它們之中，也優(yōu)選抗甲基化DNA抗體。特別是，在檢測單鏈的甲基化DNA之時(shí)，優(yōu)選使用抗甲基化DNA抗體。抗甲基化DNA抗體而言，可例舉抗甲基化胞嘧啶抗體及抗甲基化CpG抗體。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，抗甲基化胞苷抗體也可作為抗甲基化DNA抗體來使用。 在本發(fā)明的實(shí)施方式中，抗甲基化DNA抗體也可為多克隆抗體及單克隆抗體之任何。另外，作為抗甲基化DNA抗體而言，使用通過將抗甲基化DNA抗體片段化而得到的活性片段也可。那樣的活性片段只要是不失向甲基化DNA的特異性結(jié)合活性的片段，就不特別限定，可例舉例如Fab片段、F(ab' )2片段、sFv片段等。活性片段，例如，可通過將純化的抗甲基化DNA單克隆抗體用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切斷來制備。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，使用市售的抗甲基化DNA抗體也可。市售的抗甲基化DNA抗體而言，可例舉例如表I所示的抗體。表I
廠商抗體名克隆名免疫動(dòng)物
Calbiochem抗-5-甲基胞嘧啶小鼠mAb16233D3小鼠
abeam5-甲基胞苷33D3小鼠
Eurogentec5-甲基胞苷單克隆小鼠
Aviva System Biology5-甲基胞喃淀33D3小鼠
Novus Biologicals胞卩密淀(5-甲基)多克隆羊
Diagenode5-甲基胞苷單克隆小鼠在本發(fā)明的實(shí)施方式中，使用通過所述技術(shù)中公知的方法制備的抗甲基化DNA抗體也可?？辜谆疍NA抗體，例如，可通過以下的順序制備。首先，將5-甲基胞嘧啶等的甲基化DNA作為免疫原，根據(jù)需要與佐劑一同施用于適宜的哺乳動(dòng)物(例如大鼠、小鼠等)而免疫。接下來，從免疫的動(dòng)物的脾臟細(xì)胞等，篩選產(chǎn)生對(duì)免疫原的抗體的抗體產(chǎn)生細(xì)胞來選擇。將得到的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞融合而得到雜交瘤，通過將其篩選，可得產(chǎn)生有向甲基化DNA的特異性結(jié)合活性的抗體的雜交瘤。從將得到的雜交瘤的培養(yǎng)上清或該雜交瘤施用于小鼠的腹腔內(nèi)而得到的腹水，可得抗甲基化DNA抗體。
產(chǎn)生抗甲基化DNA抗體的雜交瘤而言，可例舉例如，在獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)(日本國千葉縣木更津市上總錸足2-5-8、郵政編碼292-0818)，于2009年8月25日以保藏號(hào)NITE BP-805保藏的雜交瘤SCR2、以及于2009年9月10日以保藏號(hào)NITEBP-810、保藏號(hào)NITE BP-811及保藏號(hào)NITE BP-812分別保藏的雜交瘤SCRl、SCR3及SCR6。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可使用由上述的雜交瘤SCR1、SCR2、SCR3及SCR6產(chǎn)生的抗甲基化DNA抗體。甲基化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)而言，可例舉例如MBD1(甲基胞嘧啶結(jié)合域蛋白I)、MBD2(甲基胞嘧啶結(jié)合域蛋白2)、MBD4(甲基胞嘧啶結(jié)合域蛋白4)、MeCP2 (甲基CpG結(jié)合蛋白2)等。這些的蛋白質(zhì)自體在所述技術(shù)中公知。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，甲基化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)只要是可特異性地識(shí)別并結(jié)合甲基化DNA，是野生型的氨基酸序列中含I個(gè)以上的氨基酸的缺失、取代或附加的變異型也可。再有，那樣的變異型的制備方法本身在所述技術(shù)中公知。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的接觸可通過向樣品中添加該蛋白質(zhì)來進(jìn)行。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的添加量不特別限定，只要是可確保此后的檢測步驟中可充分地檢測的甲基化DNA量的添加量即可。例如，樣品中的核酸含量是Ing 10 μ g時(shí)，抗甲基化DNA抗體的添加量是Ing 10 μ g左右即可。接觸條件(周圍溫度及時(shí)間)根據(jù)可結(jié)合到甲基化DNA的蛋白質(zhì)的種類而不同，但通常于4 42°C進(jìn)行10分鐘 24小時(shí)左右即可。在本發(fā)明的檢測方法中，使通過上述的結(jié)合步驟得到的樣品和至少I種脫氧核糖核酸酶接觸來分解該樣品中的DNA(以下，將此步驟稱之為“分解步驟”)。在此步驟中，未和可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA、S卩非甲基化DNA被脫氧核糖核酸酶分解，但與該蛋白質(zhì)結(jié)合的甲基化DNA通過其結(jié)合而5-甲基胞嘧啶及其周邊區(qū)域不分解。即，在本發(fā)明的檢測方法中，通過上述的結(jié)合步驟及分解步驟可除去非甲基化DNA。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，脫氧核糖核酸酶也可為內(nèi)切核酸酶及外切核酸酶之任何。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，作為脫氧核糖核酸酶也可使用限制酶。此時(shí)，DNA切斷部位限于該限制酶的識(shí)別區(qū)域。因此，將在分解步驟得到的樣品直接用于后述的檢測步驟時(shí)，要留意分解物不給之后的檢測步驟帶來影響。例如，通過使用多種限制酶，可充分地分解非甲基化 DNA。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，脫氧核糖核酸酶是選自下列的至少I種脫氧核糖核酸酶I (DNaseI)、外切核酸酶I、λ -外切核酸酶、Τ7外切核酸酶、外切核酸酶III、RecJ型外切核酸酶、外切核酸酶T、BAL31核酸酶、緑豆核酸酶、微球菌-核酸酶及Τ7內(nèi)切核酸酶。在本發(fā)明的檢測方法中，使用的脫氧核糖核酸酶的至少I種是與可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶不同的脫氧核糖核酸酶。其中“可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶”是指可不切斷單鏈DNA中的含被甲基化的胞嘧啶的識(shí)別序列，僅切斷含未甲基化的胞嘧啶的識(shí)別序列的限制酶。那樣的限制酶而言，可例舉例如Hhal。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，通過上述的結(jié)合步驟得到的樣品和脫氧核糖核酸酶的接觸可通過向樣品添加脫氧核糖核酸酶來進(jìn)行。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，脫氧核糖核酸酶的添加量不特別限定，只要是在之后的檢測步驟中可充分地分解非甲基化DNA的添加量即可。例如，在樣品中的核酸含量是Ing 10μ g時(shí)，DNaseI的添加量是O. I 120U左右即可。接觸條件(周圍溫度及時(shí)間)根據(jù)脫氧核糖核酸酶的種類而不同，通常是于4 42°C進(jìn)行10分鐘 24小時(shí)左右即可。在本發(fā)明的檢測方法中，通過上述的分解步驟得到的樣品直接在以下的檢測步驟中使用也可。因此，也可省略用于除去非甲基化DNA的清洗及甲基化DNA的純化。/在本發(fā)明的實(shí)施方式中，根據(jù)以下的檢測步驟中使用的檢測手段，實(shí)行以在上述的分解步驟得到的樣品中含的甲基化DNA作為模板的核酸擴(kuò)增法也可。擴(kuò)增DNA的方法本身只要是所述技術(shù)中公知的DNA擴(kuò)增法，就不特別限定?？衫e例如IVT(體外轉(zhuǎn)錄)擴(kuò)增法、SPIA(商標(biāo))擴(kuò)增法、GenomiPhi擴(kuò)增法等。在本發(fā)明的檢測方法中，通過與在上述的分解步驟得到的樣品中的，可結(jié)合甲基化DNA的蛋白質(zhì)的結(jié)合來檢測不被脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA(以下，將此步驟稱之為“檢測步驟”)。本說明書中“檢測甲基化DNA的”是指檢測甲基化DNA中的目的CpG部位的甲基化的有無，確定甲基化DNA的堿基序列，及解析甲基化DNA中的CpG部位的甲基化的頻度。其中“甲基化的頻度”是指甲基化DNA中的目的區(qū)域中存在的全部的CpG部位或任意的CpG部位之中，甲基化CpG部位的數(shù)或其比例。在本說明書中，甲基化DNA的檢測是目的DNA的甲基化的判斷、甲基化DNA的堿基序列的確定、及甲基化DNA的一井解析等，只要是在上述的分解步驟不被脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA的檢測，就不特別限制。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，檢測步驟中使用的方法只要是可檢測在上述的分解步驟不被脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA的方法，就不特別限定，可從所述技術(shù)中公知的方法適宜選擇。那樣的方法而言，可例舉核酸擴(kuò)增法、堿基測序法、微陣列法等。例如，將核酸擴(kuò)增法用于檢測步驟來判斷目的DNA的甲基化的有無之吋，使用設(shè)計(jì)成夾目的DNA中的CpG部位的引物組來實(shí)行PCR法，可判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中目的DNA的甲基化的有無。另外，通過定量PCR法，可定量樣品中的甲基化DNA含量。再者，將作為堿基測序法之一的高速測序法(第二代測序法)用于檢測步驟，則可一井解析甲基化DNA。那樣的高速測序法中使用的測序儀而言，可例舉例如ABI3730 X I (Life Technologies公司)、GSFLX Titanium (Roche 公司)、等。將微陣列法用于檢測步驟也可。此時(shí)，微陣列雖然不特別限定，但優(yōu)選是DNA微陣列或DNA芯片。另外,使用GeneChip (注冊(cè)■商標(biāo))(Affymetrix公司)等市售的微陣列也可，使用通過所述技術(shù)中公知的方法制備的微陣列也可。將作為有從全基因組區(qū)域或指定的區(qū)域等間隔提取的堿基序列的探針配置成瓦狀的微陣列的鋪瓦陣列用于檢測步驟，則可一井解析甲基化DNA。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，將微陣列法用于檢測步驟時(shí)，上述的樣品中的DNA優(yōu)選用所述技術(shù)中公知的標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記。從而，本發(fā)明的檢測方法再包括將樣品中的DNA標(biāo)記的步驟也可。標(biāo)記物質(zhì)而言，可例舉熒光物質(zhì)、生物素等的半抗原、放射性物質(zhì)等。熒光物質(zhì)而言，可例舉Cy3、Cy5、Alexa Fluor (商標(biāo))、FITC等。在微陣列法中，通過標(biāo)記DNA而信號(hào)測定變得容易。所述技術(shù)中公知將DNA用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的方法本身。上述的信號(hào)可根據(jù)微陣列的種類而為適宜的信號(hào)。例如，信號(hào)是在與微陣列的各探針雜交的DNA存在之時(shí)發(fā)生的電信號(hào)也可，如上所述樣品中的DNA被標(biāo)記時(shí)，是從標(biāo)記物質(zhì)發(fā)生的熒光、發(fā)光、放射線等的信號(hào)也可。信號(hào)的檢測可通過通常的微陣列測定裝置中具備的掃描儀來進(jìn)行。掃描儀而言，可例舉例如，GeneChip (注冊(cè)■商標(biāo))掃描儀30007G (Affymetrix公司)等。接下來根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例I作為檢測對(duì)象的甲基化DNA，使用作為含6個(gè)5-甲基胞嘧啶的寡核苷酸的6MeCG寡核苷酸。以下示6MeCG寡核苷酸的堿基序列。< 6MeCG 寡核苷酸 >5' -CGAGGTCGACGGTATTGATm5cGAGTATm5cGATAGTm5cGATATm5cGATATm5cGATATm5cGATATACAACGTCGTGACTGG-3' (SEQ ID NO 1)(堿基序列中的“m5c”示5_甲基胞嘧啶。)(I)樣品的制備將IOpM的6MeCG寡核苷酸的水溶液作為6MeCG寡核苷酸溶液來制備。將6MeCG寡核苷酸溶液于95°C加熱10分鐘而使變性之后，在冰上靜置I分鐘。從變性的6MeCG寡核苷酸的溶液取2μ 1，將其作為輸入樣品。將殘留的溶液作為提供于本發(fā)明的檢測方法的樣
品O(2)樣品和抗甲基化DNA抗體的接觸將上述的樣品分成兩份，向ー份添加抗甲基化DNA抗體(Iyg)而作為待測樣品(100μ I),向另ー份不添加抗甲基化DNA抗體而作為對(duì)照樣品(ΙΟΟμΙ)。將各樣品于25 °C溫育2小吋。本實(shí)施例中使用的抗甲基化DNA抗體是從在獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)(日本國千葉縣木更津市上總錸足2-5-8、郵政編碼292-0818)于2009年8月25日以保藏號(hào)NITEBP-805保藏的雜交瘤SCR2得到的單克隆抗體。(3)由脫氧核糖核酸酶的DNA的分解向上述的待測樣品及對(duì)照樣品各添加1μ I作為脫氧核糖核酸酶的I種的DNaseI (2U/μ I :ΝΕΒ公司)，于37°C反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)后，通過將各樣品于75°C加熱10分鐘來使DNaseI失活。(4)甲基化DNA的檢測為了檢查樣品中是否殘留6MeCG寡核苷酸，進(jìn)行定量PCR法。(i) PCR反應(yīng)液的制備將下述的試劑混合而制備12 μ I的反應(yīng)液。
權(quán)利要求
1.檢測樣品中的甲基化DNA的方法，其包括 使有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)接觸，從而使上述樣品中的甲基化DNA和上述蛋白質(zhì)結(jié)合； 使通過上述結(jié)合步驟得到的樣品和至少I種脫氧核糖核酸酶接觸，而將上述樣品中的DNA分解 '及 在通過上述分解步驟得到的樣品中，通過與上述蛋白質(zhì)的結(jié)合來檢測不被上述脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA ;其中 上述脫氧核糖核酸酶的至少I種是與可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶不同的脫氧核糖核酸酶。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中 上述可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)是抗甲基化DNA抗體或甲基化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中 上述可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)是抗甲基化DNA抗體。
4.權(quán)利要求I所述的方法，其中 上述可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)是選自下列的至少I種甲基化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)MBDI、MBD2、MBD4 及 MeCP2。
5.權(quán)利要求I 4之任一項(xiàng)所述的方法，其中 上述樣品是由培養(yǎng)細(xì)胞株或從活體采集的血液、體液、組織或細(xì)胞制備的樣品。
6.權(quán)利要求I 4之任一項(xiàng)所述的方法，其中 上述脫氧核糖核酸酶是選自下列的至少I種脫氧核糖核酸酶I、外切核酸酶I、λ -外切核酸酶、Τ7外切核酸酶、外切核酸酶III、RecJ型外切核酸酶、外切核酸酶T、BAL31核酸酶、綠豆核酸酶、微球菌-核酸酶及Τ7內(nèi)切核酸酶。
7.權(quán)利要求I 4之任一項(xiàng)所述的方法，其中 上述樣品是有含單鏈甲基化DNA的可能性的樣品， 在檢測上述甲基化DNA的步驟中，檢測單鏈甲基化DNA。
8.權(quán)利要求I 4之任一項(xiàng)所述的方法，其中 在檢測上述甲基化DNA的步驟中，使用核酸擴(kuò)增法、堿基測序法或微陣列法來檢測甲基化DNA。
全文摘要
檢測樣品中的甲基化DNA的方法為了更簡便地得到甲基化DNA樣品，使用使有含甲基化DNA的可能性的樣品和可與甲基化DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)接觸，從而使樣品中的甲基化DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，使得到的樣品和至少1種脫氧核糖核酸酶接觸而將樣品中的DNA分解，在得到的樣品中，通過與蛋白質(zhì)的結(jié)合檢測不被脫氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA的方法。在此方法中，脫氧核糖核酸酶的至少1種是與可分解單鏈DNA的甲基化感受性限制酶不同的脫氧核糖核酸酶。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102653787SQ20121005573
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者梶田昌裕, 酒井綾子 申請(qǐng)人:希森美康株式會(huì)社