專利名稱：一種氧化型輔酶i的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氧化型輔酶I的制備方法。
背景技術(shù)：
在目前所有發(fā)現(xiàn)的酶中，約有30-35%為氧化還原酶。在工業(yè)生物技術(shù)，特別是生物藥物和精細(xì)化工行業(yè)中，氧化還原酶是最重要的酶類。在氧化還原酶所催化的反應(yīng)中，生成產(chǎn)物的同時(shí)皆需要消耗一定的輔酶以進(jìn)行電子和質(zhì)子的轉(zhuǎn)移。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約80%的反應(yīng)需要以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即氧化型輔酶I (簡稱NAD+，結(jié)構(gòu)式參見式I)作為輔酶，約10% 的反應(yīng)需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸即氧化型輔酶II (簡稱NADP+)作為輔酶，只有少量反應(yīng)需要黃素(FAD、FMN)和輔酶Q(PQQ)作為輔酶。雖然添加復(fù)雜的輔酶再生體系使得煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即氧化型輔酶I (NAD+)的需求量降低，但是由于其體系中輔酶轉(zhuǎn)化數(shù)的限制，仍必須添加一定的輔酶才能保證氧化還原反應(yīng)的順利進(jìn)行。可見，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即氧化型輔酶I (NAD+)具有廣泛的用途和巨大的需求量，其重要性隨著綠色化學(xué)工業(yè)的發(fā)展將會不斷增加。目前工業(yè)中大量的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸產(chǎn)品主要為從酵母中提取分離獲得。該過程雖然工藝成熟，但是耗費(fèi)能源和材料巨大，產(chǎn)品昂貴，限制了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的生產(chǎn)和其后續(xù)應(yīng)用過程的開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的氧化型輔酶I 的制備方法。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案
一種氧化型輔酶I的制備方法，該方法使煙酰胺核苷(NR)和三磷酸腺苷二鈉鹽 (ATP-Na2)在pH為5. (Γ8. O的緩沖溶液中，在煙酰胺核苷激酶(NRK)的催化作用下以及二價(jià)金屬離子存在下，在溫度30°C 40°C下反應(yīng)得到氧化型輔酶I (NAD+)。根據(jù)本發(fā)明，所述的緩沖溶液可以為磷酸鹽緩沖溶液、Tri-HCl緩沖溶液或TEA緩沖溶液等。緩沖溶液的濃度一般為100 500 mM，優(yōu)選為100 200禮。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述反應(yīng)開始時(shí)，所述的煙酰胺核苷和三磷酸腺苷二鈉鹽的濃度分別為5 50 mg/ml和1(T50 mg/ml。所述的煙酰胺核苷激酶以凍干粉形式加入， 且加入量為5"10 mg酶粉/ml緩沖溶液。優(yōu)選地,加入量為5mg酶粉/ml緩沖溶液。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方面，所述制備方法的實(shí)施過程如下取一反應(yīng)容器，加入緩沖溶液后，依次加入煙酰胺核苷、三磷酸腺苷二鈉鹽以及煙酰胺核苷激酶以及所述二價(jià)金屬離子的鹽，控制溫度30°C 40°C，攪拌反應(yīng)，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，至檢測到三磷酸腺苷消耗完畢，停止反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，所述二價(jià)金屬離子優(yōu)選為鎂離子或錳離子。特別優(yōu)選地，所述二價(jià)金屬離子優(yōu)選為鎂離子，含有二價(jià)金屬離子的鹽為氯化鎂。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案停止反應(yīng)后，依次經(jīng)過濾，大孔樹脂例如HZ-818 型大孔吸附樹脂吸附，凍干處理獲得所述氧化型輔酶I。根據(jù)本發(fā)明，原料煙酰胺核苷和煙酰胺核苷激酶可根據(jù)已知文獻(xiàn)方法制備得到， 三磷酸腺苷二鈉鹽和其他原材料可商購獲得，來源廣泛。由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明是一種利用微生物酶在溫和條件下高效制備煙酰胺核糖二核苷酸即氧化型輔酶I的方法。與已存在的從酵母中分離提取的方法相比，本方法避免了傳統(tǒng)方法的高能耗， 高原材料消耗和產(chǎn)物價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，具備酶催化過程所特有的反應(yīng)條件溫和、立體專一性強(qiáng)、催化效率高等特點(diǎn)，尤其是針對該反應(yīng)的動力學(xué)特點(diǎn)，用一種酶一鍋法催化兩步偶聯(lián)反應(yīng)，簡單有效，獲得了較高的轉(zhuǎn)化率(反應(yīng)以底物ATP計(jì)算的轉(zhuǎn)化率為8(Γ100%)。此外，本發(fā)明方法使用煙酰胺核苷激酶為催化劑，廉價(jià)易得。綜合以上特點(diǎn)，本發(fā)明方法具備良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例I
在20 mL三口燒瓶中加入10 mL Tris-HCl緩沖溶液(100 mM,pH為I. 5)，依次加入煙酰胺核苷O； Med. Chem. 2007，見，份姑-6必7 ) 50 mg，三磷酸腺苷二鈉鹽55 mg，煙酰胺核苷激酶 iPLoS Biology, 2007, 5(10), 2220-2230) 10 mg,氯化鎂 20 mM，于 37°C下，200 rpm攪拌反應(yīng)，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，經(jīng)過6小時(shí)反應(yīng)后，檢測三磷酸腺苷已經(jīng)消耗完畢，停止反應(yīng)。通過進(jìn)一步的過濾，HZ-818型大孔樹脂吸附，凍干，乙醇和水重結(jié)晶即可獲得氧化型輔酶I產(chǎn)品，收率70%。實(shí)施例2
在20 mL三口燒瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液(100 mM, pH為5. 8)，依次加入煙酰胺核苷U Med. Chem. 2007，邠，份姑-6必7 ) 50 mg，三磷酸腺苷二鈉鹽55 mg，煙酰胺核苷激酶OdZo夕沿2007，5(10),之如)5 mg，氯化錳20 mM，于37°C下，200 rpm 攪拌反應(yīng)，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，經(jīng)過10小時(shí)反應(yīng)后，檢測三磷酸腺苷已經(jīng)消耗完畢，停止反應(yīng)。通過進(jìn)一步的過濾，AB-8型大孔樹脂吸附，凍干，乙醇和水重結(jié)晶即可獲得氧化型輔酶I產(chǎn)品，收率52%。上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于該方法使煙酰胺核苷和三磷酸腺苷二鈉鹽在PH為5. (Γ8. O的緩沖溶液中，在煙酰胺核苷激酶的催化作用下以及二價(jià)金屬離子存在下，在溫度30°C 40°C下反應(yīng)得到氧化型輔酶I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于所述的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液、Tri-HCl緩沖溶液或TEA緩沖溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于所述的緩沖溶液的濃度為100 500 mMo
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于所述反應(yīng)開始時(shí)，所述的煙酰胺核苷和三磷酸腺苷二鈉鹽的濃度分別為5 50 mg/ml和1(T50 mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于所述的煙酰胺核苷激酶以凍干粉形式加入，且加入量為5 10mg酶粉/ml緩沖溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于所述的煙酰胺核苷激酶以凍干粉形式加入，且加入量為5mg酶粉/ml緩沖溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于所述制備方法的實(shí)施過程如下取一反應(yīng)容器，加入緩沖溶液后，依次加入煙酰胺核苷、三磷酸腺苷二鈉鹽以及煙酰胺核苷激酶以及所述二價(jià)金屬離子的鹽，控制溫度30°C 40°C，攪拌反應(yīng)，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，至檢測到三磷酸腺苷消耗完畢，停止反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于所述二價(jià)金屬離子為鎂離子或錳離子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于所述含有二價(jià)金屬離子的鹽為氯化鎂或氯化錳。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的氧化型輔酶I的制備方法，其特征在于停止反應(yīng)后，依次經(jīng)過濾，大孔樹脂吸附，凍干處理獲得所述氧化型輔酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氧化型輔酶I的制備方法，該方法使煙酰胺核苷(NR)和三磷酸腺苷二鈉鹽(ATP-Na2)在pH為5.0~8.0的緩沖溶液中，在煙酰胺核苷激酶(NRK)的催化作用下以及二價(jià)金屬離子存在下，在溫度30℃~40℃下反應(yīng)得到氧化型輔酶I(NAD+)。本發(fā)明采用生物催化的方法，利用煙酰胺核苷激酶一鍋法制備氧化型輔酶，反應(yīng)體系簡單，條件溫和，具備良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號C12P19/32GK102605026SQ20121005623
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者莊季昌, 李斌, 梁曉亮, 陶軍華, 鞠鑫 申請人:蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司