專利名稱：一種高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體涉及一種高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌 {Bacillus subtil is、的方法。
背景技術(shù)：
抗生素作為飼料添加劑，在畜禽防疫方面雖起到積極的作用，但抗生素的廣泛使用帶來(lái)了環(huán)境污染、殘毒危害、病菌抗藥、人畜安全受到威脅等一系列問(wèn)題。另外，抗菌素會(huì)抑制和殺死腸道內(nèi)的有益菌群，造成腸道正常菌群微生態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致疫病的發(fā)生，出現(xiàn)二重感染，有害于人畜健康。1974年，Parker提出與“抗生素”相對(duì)的新概念——“益生菌”。 益生菌，源于希臘語(yǔ)“對(duì)生命有益”，是指能定植于宿主腸道內(nèi)，產(chǎn)生確切健康功效的活的有益微生物的總稱，是具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡，達(dá)到提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物。近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌對(duì)動(dòng)物和人的病原菌具有顯著的拮抗作用，引起廣大微生物和免疫學(xué)工作者的密切關(guān)注。芽孢桿菌的芽孢具有耐熱、抗干燥、便于運(yùn)輸和使用等優(yōu)點(diǎn)，在西方國(guó)家芽孢桿菌已被開(kāi)始應(yīng)用于人的功能性食品和動(dòng)物飼料添加劑?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌屬的一種，革蘭氏陽(yáng)性需氧菌，是我國(guó)農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，因其無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)污染，同時(shí)具有很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，對(duì)改善動(dòng)物消化道微環(huán)境、促進(jìn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的消化吸收、提高動(dòng)物飼料的轉(zhuǎn)化率和增強(qiáng)畜禽免疫力起到重要作用，已被越來(lái)越多地研制成飼用微生態(tài)制劑， 廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)、飼料等行業(yè)。目前對(duì)枯草芽孢桿菌的研究主要集中在抑菌作用、抑菌物質(zhì)的分離純化與表征、 以及枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性和在豆柏中的應(yīng)用效果研究等，而在提高枯草芽孢桿菌菌體產(chǎn)量的發(fā)酵技術(shù)方面則報(bào)道較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法，以提高枯草芽孢桿菌的菌體產(chǎn)量。本發(fā)明提供的高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法，具體如下以枯草芽孢桿菌 {Bacillus subtil is)為菌種,經(jīng)活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉12.5-17.5g/L、蛋白胨20-25 g/L、NaCl I. 5-2. 75 g/L、Na2HPO4 O. 25-0. 75g/L、MgSO4 O. 25-0. 75g/L，ρΗ6· 0-8. 0 ;培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度 35-45°C、轉(zhuǎn)速 150-200r/min、裝液量 60-100mL/250mL ;接種量為 5-10% (v/v)，培養(yǎng)時(shí)間 16-18h。更優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉15g/L、蛋白胨22. 5g/L、NaCl 2. 5g/L、 Na2HPO4 O. 5g/L、MgS04 O. 5g/L，pH7. 0 ;培養(yǎng)溫度 37°C、轉(zhuǎn)速 200r/min、裝液量 80mL/250mL ； 接種量為5% (v/v)，培養(yǎng)時(shí)間16h。
所述活化采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂 15g-20g，蒸餾水 IOOOmL, pH7. 0-7. 2，37°C活化 24h。
經(jīng)過(guò)以上條件優(yōu)化，枯草芽孢桿菌的細(xì)胞生物量可達(dá)4. 32X 109cfu/mL,比優(yōu)化前 (I. 33X 108cfu/mL)提高了 31. 48 倍。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)枯草芽孢桿菌是一種非常有應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景的微生態(tài)制劑，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中仍然存在一些問(wèn)題。在自然條件下的枯草芽孢桿菌，作用效果常常不理想，因此，要對(duì)其進(jìn)行改良，使其在加工工藝、劑型和貯藏技術(shù)等環(huán)節(jié)上有所突破。本發(fā)明通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的研究，為枯草芽孢桿菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。


圖I枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線；圖2不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響；圖3可溶性淀粉添加量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響圖4不同氮源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響；圖5蛋白胨添加量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響；圖6不同無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響；圖7培養(yǎng)基初始PH值對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響;圖8培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響；圖9轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響；圖10培養(yǎng)基裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響；圖11接種量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例采用的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌E菌株(參考文獻(xiàn)趙瑩等，枯草芽孢桿菌發(fā)酵蔗渣生產(chǎn)黃腐酸的工藝條件優(yōu)化.福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，38
(2):290-296)，進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。實(shí)施例I
1.枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
將枯草芽孢桿菌活化后，以5%(v/v)的接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化鈉 5g，蒸餾水 IOOOmL, ρΗ7· 0-7. 2)中，裝液量 100mL/250mL，在 30°C、 200r/min下培養(yǎng)，分別采用分光光度法和平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)的0D_值和菌落數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、分別以0D_值和菌落數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線圖(圖I)。 由生長(zhǎng)曲線確定枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)時(shí)間為16h。
2.枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方優(yōu)化
以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響。培養(yǎng)條件接種量5%(v/v)，裝液量100mL/250mL，在30°C、200r/min 下培養(yǎng)16h。
2.1碳源種類對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
分別以1% (表示g/100mL，以下類同)的蔗糖、環(huán)糊精、麥芽糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、葡萄糖為碳源，取代牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中的牛肉膏，考察它們對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響，以碳源種類為橫坐標(biāo)，0D_增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)作圖。圖2顯示，以可溶性淀粉為碳源時(shí)，枯草芽孢桿菌的OD6tltl增長(zhǎng)量最大，為O. 798 (菌懸液稀釋10倍測(cè)定)；而用乙酸鈉和葡萄糖作為碳源時(shí)，0D_增長(zhǎng)量較小。綜合細(xì)胞生物量和培養(yǎng)基成本進(jìn)行考慮，確定采用可溶性淀粉作為碳源。2.2碳源添加量對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
比較可溶性淀粉不同添加量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響，以碳源添加量為橫坐標(biāo)， 0D_增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)作圖，將菌懸液稀釋10倍后測(cè)定0D_ (圖3)。結(jié)果表明，隨著可溶性淀粉添加量的增加，0D_增長(zhǎng)量也不斷提高；當(dāng)碳源添加量為I. 5%時(shí)，枯草芽孢桿菌的 OD600增長(zhǎng)量達(dá)到最高，為O. 544 ;隨之繼續(xù)增加可溶性淀粉的添加量，OD600增長(zhǎng)量下降。因此，確定枯草芽孢桿菌可溶性淀粉的最適添加量為I. 5%。2.3氮源種類對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以1%的蛋白胨、磷酸二氫銨、氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鈉為氮源，考察它們對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響，以氮源種類為橫坐標(biāo)，OD600增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)作圖(圖4)。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌利用蛋白胨作為氮源時(shí)，OD6tltl增長(zhǎng)量最高， 為1.475 ;而采用無(wú)機(jī)氮源時(shí)，細(xì)胞生物量相對(duì)較低，因此選取蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源。2.4氮源添加量對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
以蛋白胨添加量為橫坐標(biāo)，以O(shè)D6tltl增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)，將菌懸液稀釋10倍后測(cè)定0D_ (圖5)。結(jié)果表明，隨著蛋白胨添加量的增加，OD6tltl增長(zhǎng)量也隨之提高；當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?br> 2.25%時(shí)，枯草芽孢桿菌的0D_增長(zhǎng)量達(dá)到最高，為O. 718 ;隨后繼續(xù)增加蛋白胨的添加量， OD600增長(zhǎng)量有所下降。因此，確定枯草芽孢桿菌的蛋白胨最適添加量為2. 25%。2.5無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
在碳源、氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以O(shè). 5%的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、鑰酸鈉、 硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵為無(wú)機(jī)鹽添加到培養(yǎng)基中，以無(wú)機(jī)鹽種類為橫坐標(biāo)，OD600 增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)，將菌懸液稀釋10倍后測(cè)定0D_ (圖6)，確定最佳無(wú)機(jī)鹽。結(jié)果表明，當(dāng)以NaCl、Na2HPO4, MgSO4作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，枯草芽孢桿菌的OD6tltl增長(zhǎng)量較大，分別為O. 751、
O.872,0. 758，因此選擇NaCl、Na2HP04、MgS04作為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的最佳無(wú)機(jī)鹽。在確定最佳無(wú)機(jī)鹽種類的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究無(wú)機(jī)鹽的最適添加量及其相互作用。2.6無(wú)機(jī)鹽添加量對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
不同的微生物生長(zhǎng)所需的無(wú)機(jī)鹽種類和濃度不同。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl, Na2HPO4 和MgSO4對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響較為明顯，因此以這三種鹽為考察因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn) L9(34)，對(duì)無(wú)機(jī)鹽配方進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)，初步確定上述無(wú)機(jī)鹽的較優(yōu)水平分別為 NaCl 0%-0. 25%、Na2HPO4 0%-0. 1%, MgSO4 0%-0. 1%。表I枯草芽孢桿菌無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化正交試驗(yàn)因素和水平表
權(quán)利要求
1.一種高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于以枯草芽孢桿菌OfeciJAz1S subti I is)為菌種，經(jīng)活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉12.5-17. 5g/L、蛋白胨 20-25 g/L、NaCl I. 5-2. 75 g/L、Na2HPO4 O. 25-0. 75g/L、MgSO4O.25-0. 75g/L，ρΗ6· 0-8.0 ;培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度 35-45 °C、轉(zhuǎn)速 150_200r/min、裝液量 60-100mL/250mL ;接種量為 5-10% (v/v)，培養(yǎng)時(shí)間 16_18h。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉 15g/L、蛋白胨 22. 5g/L、NaCl 2. 5g/L、Na2HPO4 O. 5g/L、MgSO4 O. 5g/ L, ρΗ7· O0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于所述培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37°C、轉(zhuǎn)速200r/min、裝液量80mL/250mL ;接種量為5% (v/v)，培養(yǎng)時(shí)間 16h0
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于所述活化采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g-20g，蒸餾水 IOOOmL, ρΗ7· 0-7. 2，37°C 活化 24h。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體涉及一種高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的方法，以提高枯草芽孢桿菌的菌體產(chǎn)量。本發(fā)明提供的高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法，該方法以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為菌種，經(jīng)活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，枯草芽孢桿菌的細(xì)胞生物量可達(dá)4.32×109cfu/mL，比優(yōu)化前(1.33×108cfu/mL)提高了31.48倍。本發(fā)明通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的研究，為枯草芽孢桿菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/125GK102586153SQ20121005629
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者嚴(yán)芬, 葉秀云, 李仁寬, 楊捷, 林娟, 陳江平 申請(qǐng)人:福州大學(xué)