專利名稱：一種適于榆屬品種區(qū)分和鑒定的issr指紋圖譜構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
榆樹為榆科(Ulmaceae)榆族(Ulmeae)的榆屬(Ulmus)植物的總稱。全世界約 40余種，分布于北半球。我國榆屬資源非常豐富，遍及全國，共有25種。榆屬植物耐旱，耐鹽堿，適應(yīng)性強，木材堅韌，具有較高的生態(tài)適應(yīng)性和經(jīng)濟價值，多數(shù)榆屬品種可塑性強，即可作為孤植樹、行道樹，也可剪型成為綠籬、盆景，具有很高的觀賞價值和應(yīng)用價值，因此， 具有其他樹種不可替代的優(yōu)勢，一直是我國北方尤其是鹽堿地園林綠化中的主要樹種。因此對榆屬新品種的培育一直是育種人員的研究熱點。目前，中國分布的有代表性榆屬種、品種及類型，以及選出的優(yōu)良無性系品種大概在88份左右，但對于這些品種的鑒定仍只是基于傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定法依賴于品種表型差異，而形態(tài)的表現(xiàn)受環(huán)境影響較大，且形態(tài)鑒定法工作量大、鑒定周期長、成本高、受季節(jié)限制。而同工酶和種子貯藏蛋白多態(tài)性不夠豐富，且同工酶有組織和器官特異性、穩(wěn)定性差，這就給榆屬品種鑒定、榆屬種質(zhì)資源創(chuàng)新帶來了困難。分子標記技術(shù)具有多態(tài)性好、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，已開始廣泛應(yīng)用于作物品種鑒定與純度檢測中。目前，應(yīng)用較多的是ISSR、SSR、RAPD、RFLP和AFLP等分子標記。簡單重復(fù)序列多態(tài)性(Inter-simple sequence Repeat Polymorphism, ISSR)是由 Zietkiewicz于1994年提出的。ISSR通常為顯性標記,呈Mendel式遺傳,具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，因而是非常理想的分子標記，可用于構(gòu)建PCR為基礎(chǔ)的分子圖譜。ISSR分子標記已用于遺傳多樣性分析、繪制DNA指紋圖譜、品種鑒定等許多研究領(lǐng)域，潛力很大。ISSR 技術(shù)利用基因組中有關(guān)SSR序列的信息，結(jié)合RAPD技術(shù)優(yōu)點，克服了 SSR和RAPD標記技術(shù)的某些缺點；與RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本較低、DNA用量小、安全性較高。對榆屬植物的遺傳多樣性的研究、染色體的研究、ISSR、RAPD及AFLP等分子標記技術(shù)在榆樹中的應(yīng)用研究等尚處于起步甚至空白階段。除了白榆之外的其它榆屬樹種，則基本上沒有開展指紋圖譜等遺傳研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適于榆屬品種區(qū)分和鑒定的ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法。適于榆屬品種區(qū)分和鑒定的ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法按以下步驟進行一、DNA 提取以不同榆樹品種成年植株為材料，取新生葉片采用適合提取榆樹DNA的改良CTAB 法提取DNA，取部分DNA溶液測其濃度，稀釋至20ng/uL，于_20°C保存?zhèn)溆?；二、ISSR-PCR擴增及電泳檢測采用25μ L 反應(yīng)體系中，10XBuffer(Mg2+free)2. 5μ L，dNTPs O. 25mmol/L，引物800pmol/L, DNA 模板 30ng, Taq 酶 I. 5U, MgCl2 2. 5mmol/L ；PCR擴增程序條件為94°C預(yù)變性5min，35個循環(huán)，每個循環(huán)包括，94°C變性45s， 退火lmin,72°C延伸I. 5min,結(jié)束循環(huán)后72°C延伸6min,4°C保存；用含O. 5μ 1/mlEB的I. O %瓊脂糖凝膠，在IXTBE緩沖液中，以2. 5V/cm2的電場強度電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并照相、記錄；三、DNA指紋圖譜構(gòu)建根據(jù)每條引物呈現(xiàn)的條帶信息建立指紋圖譜以榆樹品種編號和擴增譜帶帶型為縱列，以每條譜帶的位點編號為橫行，在每一橫縱交結(jié)處，有擴增譜帶用“ I”表示，沒有擴增譜帶用“O”表示，分別制得每條引物對不同品種的DNA指紋圖譜表，以引物FI-55對35個
偷樹品種構(gòu)建的指紋圖譜為
權(quán)利要求
1.一種適于榆屬品種區(qū)分和鑒定的ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于適于榆屬品種區(qū)分和鑒定的ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法按以下步驟進行一、DNA提取以不同榆樹品種成年植株為材料，取新生葉片采用適合提取榆樹DNA的改良CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液測其濃度，稀釋至20ng/uL，于_20°C保存?zhèn)溆?；二、ISSR-PCR擴增及電泳檢測采用 25 yL 反應(yīng)體系中，10XBuffer(Mg2+free)2. 5μ L，dNTPsO. 25mmol/L,引物 800pmol/L, DNA 模板 30ng, Taq 酶 I. 5U, MgCl2 2. 5mmol/L ；PCR擴增程序條件為94°C預(yù)變性5min，35個循環(huán)，每個循環(huán)包括，94°C變性45s，退火 lmin，72°C延伸I. 5min，結(jié)束循環(huán)后72°C延伸6min，4°C保存；用含O. 5μ 1/mlEB的I. O %瓊脂糖凝膠，在IXTBE緩沖液中，以2. 5V/cm2的電場強度電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并照相、記錄；三、DNA指紋圖譜構(gòu)建根據(jù)每條引物呈現(xiàn)的條帶信息建立指紋圖譜以榆樹品種編號和擴增普帶帶型為縱列，以每條譜帶的位點編號為橫行，在每一橫縱交結(jié)處，有擴增譜帶用“ I ”表示，沒有擴增譜帶用“O”表示，分別制得每條引物對不同品種的DNA指紋圖譜表，以引物FI-55對35個榆樹品種構(gòu)建的指紋圖譜為
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種適于榆屬品種區(qū)分和鑒定的ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中所用榆屬的具體品種如下作圖品種其中作圖品種I 9采自黑龍江省帽兒山和黑龍江森林植物園；作圖品種10 18和鑒定品種I 17均采自山東省金鄉(xiāng)縣白洼林場。
全文摘要
一種適于榆屬品種區(qū)分和鑒定的ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法，它涉及一種ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法。方法一、DNA提?。欢?、ISSR-PCR擴增及電泳檢測；三、DNA指紋圖譜構(gòu)建；四、利用構(gòu)建的DNA指紋圖譜進行榆屬品種鑒定，即完成。本發(fā)明有利于對榆屬品種進行快速、準確的鑒定，與常規(guī)的種植檢驗和生化檢驗相比，不受作物生長環(huán)境和季節(jié)的影響，結(jié)果更穩(wěn)定、可靠，且省時省力；構(gòu)建DNA指紋圖譜和鑒定技術(shù)使ISSR分子標記技術(shù)在植物品種鑒定、親緣關(guān)系分析、植物種質(zhì)資源創(chuàng)新和分子標記輔助育種中的廣泛推廣應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)；操作簡單、直觀實用等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102605061SQ20121005836
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者關(guān)向軍, 唐煥偉, 孫力, 張興, 熊燕, 王云云, 肖宇, 高宇 申請人:黑龍江省科學院大慶分院