專利名稱：一種γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物科學技術(shù)領域，具體涉及一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)的新方法。
背景技術(shù)：
Y -聚谷氨酸(Poly-Y-glutamatic acid, Y-PGA),是一種由多種微生物產(chǎn)生的水溶性和可生物降解的聚氨基酸。聚谷氨酸是一種對人體和環(huán)境無毒害的新型天然高分子，其獨特的結(jié)構(gòu)特性賦予高度吸水性、良好的滲透性、生物相容性和生物可降解性，廣泛應用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品等許多領域，是一種公認的極有發(fā)展?jié)摿Φ木G色化學產(chǎn)品。Y-聚谷氨酸的生產(chǎn)主要利用芽孢桿菌屬的一些菌株，直接發(fā)酵生產(chǎn)。相對以石油衍生品為基礎的聚合物，Y-聚谷氨酸合物能夠通過可再生原料合成，具有相當大的市場潛力。Y -PGA生產(chǎn)方法分為兩類一類是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加L-谷氨酸作為Y -PGA合成的前體，由微生物吸收培養(yǎng)基中的谷氨酸，并利用其合成酶系將單體谷氨酸聚合產(chǎn)生Y-PGA， 即谷氨酸依賴性合成方法，例如專利CN1644677A所述的Y-PGA生產(chǎn)方法；另外一類是在發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加L-谷氨酸，有微生物直接將培養(yǎng)基中的糖質(zhì)原料轉(zhuǎn)化為內(nèi)源性谷氨酸， 再由自身的合成酶系聚合產(chǎn)生Y-PGA，這稱為從頭合成，即谷氨酸非依賴性合成方法，也稱為從頭合成，例如專利CN 1932007A所述的Y-PGA生產(chǎn)方法。兩種生產(chǎn)方法中，Y -聚谷氨酸生產(chǎn)水平很大程度上受到培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的影響。許多研究已經(jīng)確定了生產(chǎn)Y-PGA的最佳培養(yǎng)基成分。通常使用的培養(yǎng)基包括碳源，氮源和無機鹽類，L-谷氨酸依賴性合成方法需要加入大量外源谷氨酸作為聚谷氨酸的前體。一般來說合適的碳源通常是葡萄糖，甘油，麥芽糖，檸檬酸，果糖，蔗糖，淀粉等，合適的氮源通常是氯化銨，硫酸銨，蛋白胨，酵母膏等。已有大量文獻報道了谷氨酸依賴性合成方法生產(chǎn)聚谷氨酸的方法，包括培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，間歇發(fā)酵和流加發(fā)酵方法，Y-PGA的提取分離方法等。流加發(fā)酵的方式包括流加糖類為細胞生長和聚合物合成提供能量(參見專利CN1556859A);流加L-谷氨酸前體增加聚谷氨酸產(chǎn)量。目前的發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的方法中，培養(yǎng)基中需要添加谷氨酸作為前體導致了高的原料成本，成為工業(yè)化生產(chǎn)和應用的主要瓶頸之一。而不添加谷氨酸的發(fā)酵過程，只能產(chǎn)生低濃度的聚谷氨酸，過低的生產(chǎn)效率不適合工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)。因此，通過開發(fā)新的發(fā)酵生產(chǎn)方法，以較為廉價的底物替代L-谷氨酸，生產(chǎn)高濃度的Y-聚谷氨酸，成為市場的新需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，能夠以較為廉價的成本，生產(chǎn)高濃度的Y -聚谷氨酸。本發(fā)明方法所采用的技術(shù)方案包括如下步驟將芽孢桿菌屬微生物接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中，在有氧條件下培養(yǎng)，發(fā)酵過程中持續(xù)攪拌，向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加有機酸，在補料分批發(fā)酵條件下培養(yǎng)芽孢桿菌屬微生物，使其產(chǎn)生Y-聚谷氨酸。其中有機酸濃度維持在5 20g/L之間,芽孢桿菌屬微生物選自枯草芽孢桿菌CIO (Bacillus subtilis CIO)(保藏號CGMCC No. 4924)或枯草芽孢桿菌ZJU7 (Bacillus subtilis zju_7)(保藏號CGMCC No. 1250)菌株。向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加的有機酸選自檸檬酸、異檸檬酸、琥珀酸、a-酮戊二酸、延胡索酸、蘋果酸或草酰乙酸中的任意一種，或上述任意一種有機酸的鹽；在補料分批發(fā)酵過程中機酸是以恒速流加或間歇流加的方式加入發(fā)酵培養(yǎng)基。向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加有機酸的同時也可以流加氮源、碳源和無機鹽，使氮源濃度維持在I 10g/L，其中氮源選自氯化銨、玉米粉、硫酸銨、蛋白胨牛肉膏或酵母膏中的任意一種本發(fā)明的方法中，有機酸添加到培養(yǎng)基中后，其作用是作為Y-PGA合成的間接前體，發(fā)酵過程中，被菌體吸收轉(zhuǎn)化成為內(nèi)源性谷氨酸，增加聚谷氨酸的產(chǎn)量。發(fā)酵培養(yǎng)基中除有機酸之外的其他成分包括現(xiàn)有用于生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的氮源、 碳源和無機鹽。如使用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、淀粉作為碳源；使用氯化銨、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米粉等作為氮源；也包括菌體生長所需的各種無機鹽如鐵鹽，鎂鹽， 鉀鹽，鈣鹽，磷酸鹽。本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果本發(fā)明方法使微生物持續(xù)產(chǎn)生高濃度Y-聚谷氨酸，而所使用的培養(yǎng)基中避免了添加昂貴的谷氨酸，合成所需要的底物為廉價糖質(zhì)原料和有機酸，具有成本優(yōu)勢。使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)聚谷氨酸，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加有機酸使其維持在一定的濃度范圍內(nèi)，一方面避免了有機酸對于菌體細胞的毒性和生長抑制作用，另一方面促使菌體持續(xù)不斷合成Y-PGA，顯著增加Y-PGA產(chǎn)量，其濃度最高可達到38g/以上。本發(fā)明的方法周期短，易于操作，可用于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。


圖I是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO在IOL發(fā)酵罐中添加檸檬酸分批發(fā)酵過程曲線圖。(圖中▲表示殘余葡萄糖濃度， 表示Y-PGA濃度，■表示菌體干重， 表示殘余檸檬酸濃度)圖2是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO在IOL發(fā)酵罐中分批補料發(fā)酵過程曲線圖(恒速流加檸檬酸溶液)。(圖中▲表示殘余葡萄糖濃度， 表示Y-PGA濃度，■ 表示菌體干重， 表示檸檬酸濃度，一表示恒速流加檸檬酸)圖3是是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ClO在IOL發(fā)酵罐中分批補料發(fā)酵過程曲線圖(間歇流加檸檬酸和氯化銨溶液)。(圖中▲表示殘余葡萄糖濃度，〇表示Y-PGA 濃度，□表示細胞干重， 表示檸檬酸濃度，丨表示流加檸檬酸和氯化銨混合溶液。)圖4是分批發(fā)酵和兩種補料分批發(fā)酵的結(jié)果比較圖。(補料分批發(fā)酵I表示恒速流加檸檬酸；補料分批發(fā)酵2表示間歇流加檸檬酸和氯化銨混合溶液。)
具體實施例方式以下結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范
實施例IY-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，包括以下步驟步驟I)菌株活化將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ClO在平板上劃線，37°C，培養(yǎng)12h。平板培養(yǎng)基組成為 蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L,氯化鈉5g/L，葡萄糖10g/L,瓊脂15g/L, pH 7。步驟2)種子的制備將活化的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO菌種挑取接入液體種子培養(yǎng)基，裝液量為250ml三角瓶20ml培養(yǎng)基，37°C，200rpm (轉(zhuǎn)/分鐘)，振蕩培養(yǎng)12h。上述的種子培養(yǎng)基組成蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖IOg/ L,pH 7。步驟3)將制備好的種子液按5%的比例接入IOL發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為 6L，發(fā)酵參數(shù)控制為發(fā)酵溫度37°C，攪拌400rpm，pH6. 5，通氣量0. 4L/h，發(fā)酵34h。上述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖80g/l，氯化銨10g/l，檸檬酸20g/l，KH2P04
0.5g/l,MgS04 *7H20 0. 5g/l,FeC13 0. 05g/l, MnS04 H200. lg/1, CaC12 0. llg/l,pH 6. 5 ； 當發(fā)酵培養(yǎng)基中檸檬酸濃度低于5g/L時，開始恒速流加濃度為250g/L的檸檬酸鈉溶液，維持培養(yǎng)基中檸檬酸濃度為5 10g/L左右。培養(yǎng)基中Y-PGA濃度不再增加時停止流加。步驟4)產(chǎn)物分離提取發(fā)酵結(jié)束后離心除去發(fā)酵液中的菌體，上清液中加入4倍體積甲醇，4°C放置lh，離心收集沉淀，冷凍干燥后得到白色y-PGA。發(fā)酵結(jié)果顯示，最終消耗葡萄糖46g/L，消耗檸檬酸31. lg/L，Y-PGA的產(chǎn)量為34. 5g/L，發(fā)酵過程曲線見圖2。實施例2步驟I)與實施例I中的步驟I)相同。步驟2)與實施例I中的步驟2)相同。步驟3)與實施例I中的步驟3)除了以下區(qū)別，其余技術(shù)特征相同，區(qū)別在于當發(fā)酵培養(yǎng)基中檸檬酸濃度低于5g/L時，開始間歇流加檸檬酸和氯化銨的混合溶液，濃度分別為250g/L和48g/l，維持培養(yǎng)基中檸檬酸濃度為5 20g/L左右，氯化銨濃度為l_10g/L。 培養(yǎng)基中Y-PGA濃度不再增加時停止流加。步驟4)與實施例I中的步驟4)相同。發(fā)酵結(jié)果顯示，最終消耗葡萄糖57g/L，消耗檸檬酸29. 8g/L，y -PGA的產(chǎn)量為 38. 2g/L，發(fā)酵過程曲線見圖3。對比例I步驟I)與實施例I的步驟I)相同。步驟2)種子的制備將活化的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO菌種挑取接入液體種子培養(yǎng)基，裝液量為IOOOml三角瓶250ml培養(yǎng)基，37°C，200rpm,振蕩培養(yǎng)12h。上述的種子培養(yǎng)基組成蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L,氯化鈉5g/L,葡萄糖10g/L, pH 7。步驟3)將制備好的種子液按5%的比例接入10L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為 6L，發(fā)酵參數(shù)控制為發(fā)酵溫度37°C，攪拌400rpm，pH6. 5，通氣量0. 4L/h，發(fā)酵34h。上述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖80g/l，氯化銨10g/l，檸檬酸20g/l，KH2P04
0.5g/l,MgS04 *7H20 0.5g/l，F(xiàn)eC13 0.05g/l,MnS04 *H200. lg/l,CaC12 0.llg/l，pH 6.5。步驟4)與實施例I的步驟4)相同。發(fā)酵結(jié)果顯示，最終消耗葡萄糖26g/L，消耗檸檬酸20g/L，Y-PGA的產(chǎn)量是27. 7g/L，發(fā)酵過程曲線見圖I。對比例I是在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO中一次性加入有機酸發(fā)酵 (分批發(fā)酵)的方式產(chǎn)生Y -PGA，實施例I是進行恒速流加有機酸(補料分批發(fā)酵I)的方式下產(chǎn)生Y-PGA，實施例2是進行間歇流加有機酸(補料分批發(fā)酵2)的方式下產(chǎn)生 Y-PGA，對比例I與實施例I和2的發(fā)酵結(jié)果進行比較，可以發(fā)現(xiàn)兩種流加發(fā)酵(補料分批發(fā)酵)的產(chǎn)量明顯高于分批發(fā)酵。(參見圖4)實施例3步驟I)與實施例I中的步驟I)相同。步驟2)與實施例I中的步驟2)相同。步驟3)將制備好的種子液按5%的比例接入IOL發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為 6L，發(fā)酵參數(shù)控制為發(fā)酵溫度37°C，攪拌400rpm，pH6. 5，通氣量0.4L/h。當發(fā)酵培養(yǎng)基中琥珀酸濃度低于5g/L時，開始間歇流加濃度為50g/L的琥珀酸鈉溶液，維持培養(yǎng)基中琥珀酸濃度為5 10g/L左右。培養(yǎng)基中Y -PGA濃度不再增加時停止流加。上述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖80g/l，氯化銨10g/l，琥珀酸20g/l，KH2P04 I.5g/l,MgS04 *7H20 0.5g/l，F(xiàn)eC13 0.05g/l,MnS04 *H200. lg/l,CaC12 0.llg/l，pH 6.5。步驟4)與實施例I中的步驟4)相同。發(fā)酵結(jié)果顯示，最終消耗葡萄糖28g/L，消耗琥珀酸25.4g/L，Y-PGA的產(chǎn)量是 24. lg/L.實施例3是在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO中間歇流加琥拍酸產(chǎn)生的 Y-PGA的方式。對比例2Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，包括以下步驟步驟I)菌株活化將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO在平板上劃線， 37°C，培養(yǎng)12h。平板培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖IOg/ L，瓊脂 15g/L，pH 7。步驟2)種子的制備將活化的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO菌種挑取接入液體種子培養(yǎng)基，裝液量為250ml三角瓶20ml培養(yǎng)基，37°C，200rpm (轉(zhuǎn)/分鐘)，振蕩培養(yǎng)12h。上述的種子培養(yǎng)基組成蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L,氯化鈉5g/L,葡萄糖10g/L, pH 7。步驟3)搖瓶發(fā)酵將制備好的種子液按5%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為 250ml三角瓶30ml培養(yǎng)基，37°C，200rpm,振蕩培養(yǎng)36h。上述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖120g/L，氯化銨18g/L，KH2P04 5g/L，MgS04 -7H20 0.5g/L，F(xiàn)eC13 0. 05g/L，MnS04 H20 0. lg/L, CaC120. I lg/L, pH 7。除上述組分外，該發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有機酸，如琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、草酰乙酸、異檸檬酸、a -酮戊二酸或延胡索酸中的任意一種，添加量為10g/L。步驟4)產(chǎn)物分離提取發(fā)酵結(jié)束后離心除去發(fā)酵液中的菌體，上清液中加入4倍體積甲醇，4°C放置lh，離心收集沉淀，冷凍干燥后得到白色y-PGA。不同種類有機酸對細胞生長和Y-PGA產(chǎn)量的影響見表I。
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實驗結(jié)果表明，添加10g/L 到 15. 4g/L。表I有機酸對細胞生長和Y -PGA產(chǎn)量的影響
權(quán)利要求
1.一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，其特征在于，其過程如下將芽孢桿菌屬微生物接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中，在有氧條件下培養(yǎng)，發(fā)酵過程中持續(xù)攪拌；向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加有機酸，在補料分批發(fā)酵條件下培養(yǎng)芽孢桿菌屬微生物，使其產(chǎn)生 Y-聚谷氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，其特征在于， 當有機酸濃度低于5g/L時，開始流加有機酸溶液，使其維持到5-20g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，其特征在于， 所述的向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加的有機酸選自檸檬酸、異檸檬酸、琥珀酸、α -酮戊二酸、延胡索酸、蘋果酸或草酰乙酸中的任意一種，或者上述任意一種有機酸的鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，其特征在于， 所述的芽孢桿菌屬微生物選自枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌選用枯草芽孢桿菌CIO (Bacillus subtilis CIO)(保藏號CGMCC No. 4924)或枯草芽孢桿菌 ZJU7 (Bacillus subtilis zju_7)(保藏號 CGMCC No. 1250) M株。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，其特征在于， 所述的有機酸是以恒速流加或間歇流加的方式加入發(fā)酵培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，其特征在于，向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加有機酸的同時也流加氮源、碳源和無機鹽，使氮源濃度維持在I IOg/ L0
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的氮源選自氯化銨、硫酸銨、玉米粉、牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了提供了一種γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產(chǎn)方法?，F(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的γ-聚谷氨酸濃度低的、成本高。本發(fā)明在培養(yǎng)需氧芽孢桿菌(Bacillus sp.)過程中，通過向培養(yǎng)基中流加有機酸或有機酸與氮源的混合物，促使菌體將糖質(zhì)原料和有機酸轉(zhuǎn)化為γ-聚谷氨酸，培養(yǎng)基中不需要另外添加前體物L-谷氨酸。本發(fā)明生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的發(fā)酵方法周期短，易于操作，可用于工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵，具有很好的應用價值。
文檔編號C12R1/07GK102586353SQ20121006196
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者張慧莉, 徐志南, 蔡謹, 黃磊 申請人:浙江德清匯寧生物科技有限公司