專利名稱：一種從發(fā)酵蝦頭殼中提取物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用微生物發(fā)酵技術(shù)從蝦頭提取蝦青素、蛋白質(zhì)、乳酸鈣和甲殼素的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蝦青素，全稱為3，3’_ 二羥基_β胡蘿卜素-4，4’_酮，屬于酮式類胡蘿卜素，呈艷紅色，為脂溶性，具有高效抗氧化、抗癌變、增強(qiáng)免疫及著色等功能。由于兩端的羥基(-0Η) 旋光性原因，蝦青素具有3S-3' S、3R-3, S、3R-3, R(也稱為左旋、消旋、右旋)這3種異構(gòu)形態(tài)。最新的藥理學(xué)和生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蝦青素具有極強(qiáng)的生物抗氧化性，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和飼料等的行業(yè)。經(jīng)過多項(xiàng)人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，天然蝦青素對(duì)人體和動(dòng)物絕對(duì)安全。目前蝦青素的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成途徑、藻類、真菌和甲殼類動(dòng)物四種來源。(I)化學(xué)合成法蝦青素合成過程十分復(fù)雜，要經(jīng)由多步化學(xué)和生物催化反應(yīng)才能完成。人工合成蝦青素為3種結(jié)構(gòu)蝦青素的混合物，極少抗氧化活性，與生物體內(nèi)的蝦青素(以反式結(jié)構(gòu)3S-3S型為主)截然不同。美國食品與藥物管理局(FDA)僅批準(zhǔn)部分人工合成的蝦青素用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的添加劑，不允許任何化學(xué)合成產(chǎn)品進(jìn)入保健食品市場(chǎng)。因此， 化學(xué)合成的蝦青素在多種食品、飼料、醫(yī)藥品及化妝品上的應(yīng)用受到很大的限制。(2)真菌某些真菌如紅發(fā)夫酵母、深紅酵母等也可以合成蝦青素。但據(jù)報(bào)道酵母菌源的蝦青素是100%右旋(3R-3, R)，有部分抗氧化活性，酵母菌來源蝦青素主要用在非食用動(dòng)物和物資的著色上。此外，雖然酵母細(xì)胞繁殖速度快，生物量高，但細(xì)胞蝦青素含量低，為了提高蝦青素產(chǎn)量，需要大量提高碳源和氮源尤其是價(jià)格很高的有機(jī)氮源(酵母膏和蛋白胨等)的添加量，易造成浪費(fèi)，增加成本，不利于商業(yè)化生產(chǎn)。(3)藻類雖然藻類來源的蝦青素是100%左旋(3S-3, S)結(jié)構(gòu)，具有最強(qiáng)的生物學(xué)活性，但是目前已知的這些微藻通常生長(zhǎng)速度都比較慢，需要較長(zhǎng)的自養(yǎng)培養(yǎng)周期，生物量低，生長(zhǎng)條件苛刻，對(duì)水質(zhì)、環(huán)境及光的要求很高，大規(guī)模生產(chǎn)仍有難度。(4)甲殼類動(dòng)物在自然界中，蝦青素主要以酯的形式大量存在于水生動(dòng)物(如蝦及蟹)的殼內(nèi)，雖然含量低，甲殼中的灰分和蛋白質(zhì)也限制了蝦青素的提取，但由于目前還沒有找到更好的方法，且國內(nèi)外的水產(chǎn)加工業(yè)每年有1000萬噸的甲殼類廢棄物，資源豐富，因此國外從蝦殼中提取天然蝦青素的方式仍然存在。從甲殼類加工下腳料(蝦頭蝦殼)中提取回收蝦青素是蝦青素生產(chǎn)的主要途徑之一，關(guān)于這方面國內(nèi)外均有較長(zhǎng)的研究歷史。但是，甲殼類廢棄物中的石灰質(zhì)(碳酸鈣)會(huì)影響蝦青素的產(chǎn)量，因此在提取時(shí)應(yīng)盡量將其除去。而且蝦青素在這些物質(zhì)中或以游離的形式存在，或與蛋白質(zhì)、脂類等結(jié)合的形式存在。因此嚴(yán)重的影響了蝦青素的提取率。針對(duì)蝦青素與碳酸鈣的結(jié)合，目前常規(guī)的方法是使用酸化處理，破壞蝦殼上蝦青素與碳酸鈣的結(jié)合，對(duì)甲殼進(jìn)行去鈣化處理，才能提高蝦青素的提取率。在去鈣化的理論基礎(chǔ)上，挪威海洋漁業(yè)工業(yè)發(fā)展了“青貯法”處理廢棄物的技術(shù)。通過青貯過程中加入無機(jī)酸或有機(jī)酸，來破壞蝦青素與蛋白質(zhì)或骨骼部分的結(jié)合，從而增加蝦青素的釋放量。但是酸的使用一方面使得提取費(fèi)用較高，而且對(duì)環(huán)境造成了極大的污染。對(duì)于蝦蟹等下腳料中與蝦青素結(jié)合的蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)的方法是使用堿溶液來脫蛋白，但是使用化學(xué)法脫蛋白同樣也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。最近，國內(nèi)外有很多研究是利用蛋白酶來水解蝦蛋白從而斷裂色素與蛋白的結(jié)合，以提高色素回收率。酶解法雖然避免了大量堿試劑的使用，但是商品化的酶制劑成本很高，也限制了從蝦蟹下腳料中提取蝦青素的大規(guī)模應(yīng)用。專利利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)及甲殼素的方法中提出利用微生物處理蝦頭以提取蝦青素等營養(yǎng)物質(zhì)。但專利中所使用的方法存在不足(I)其所使用的發(fā)酵微生物為革蘭氏陰性桿菌鄰單胞桿菌，該菌為一種條件致病菌，會(huì)影響產(chǎn)品安全性。
(2)其發(fā)酵溫度為37°C，該溫度為大腸桿菌等致病菌的最適生長(zhǎng)溫度，極易染菌，污染發(fā)酵后產(chǎn)品。(3)該實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵前要求對(duì)蝦頭滅菌，這樣不僅增加成本，而且會(huì)使蝦頭中的內(nèi)源酶失活，影響水解效率。(4)其發(fā)酵過程需要通氧，增加了生產(chǎn)成本，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。(5) 鄰單胞桿菌發(fā)酵過程PH較高，甲殼中的鈣無法有效回收。因此，急需開發(fā)一種蝦青素提取率高、生產(chǎn)成本低、便于規(guī)?；a(chǎn)、綠色環(huán)保、符合國家可持續(xù)發(fā)展的政策的蝦青素提取工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從發(fā)酵蝦頭殼中提取物質(zhì)的方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的方法包括如下步驟(I)將奸頭,清洗干凈機(jī)械粉碎至2mm-10mm ;(2)將嗜熱鏈球菌菌種接入MRS培養(yǎng)基(蛋白胨l.Og、牛肉膏l(xiāng).Og、酵母膏 O. 5g、葡萄糖2. 0g、磷酸氫二鉀O. 2g、硫酸錳O. 025、檸檬酸二胺O. 2g、硫酸鎂O. 068g、吐溫 800. 1ml、蒸餾水 100ml)，在 37。。_45°C下，活化 15h_65h。(3)將活化好的菌懸液以1-20 %的接種量，接入未滅菌的蝦頭料中，加入 O. 1-20%葡萄糖和固液比I O. 1-20的蒸餾水。(4)發(fā)酵降解過程中不需要通氧或攪拌，在30_45°C下發(fā)酵12_72h。(5)發(fā)酵結(jié)束后將(4)中的發(fā)酵液經(jīng)2000-10000r/min離心和/或過濾分離成發(fā)酵上清液和沉淀固體。(6)蝦頭發(fā)酵液上清液部分進(jìn)行噴霧干燥得蛋白鈣粉。(7)蝦頭發(fā)酵后固體部分用乙醇以固液比I : 3-7在10_60°C下浸泡蝦頭O. 5-10
小時(shí)，離心分離。重復(fù)上述步驟2-6次，合并液體部分得蝦青素提取液。蝦青素提取液可經(jīng)噴霧干燥得蝦青素粉末得蝦青素粉末。用乙醇提取后剩下的固體部分可烘干得甲殼素粗品O本發(fā)明采用嗜熱鏈球菌發(fā)酵蝦頭，嗜熱鏈球菌是一種益生菌，有助于維持人體腸道菌群的平衡。發(fā)酵溫度可控制在40°C到45°C，高溫下能夠控制雜菌存活率。發(fā)酵前不需要對(duì)蝦頭原樣滅菌，這樣既節(jié)省了生產(chǎn)成本，又可以保留蝦頭中的內(nèi)源酶，實(shí)驗(yàn)表明嗜熱鏈球菌發(fā)酵過程產(chǎn)生的各種蛋白酶以及蝦頭內(nèi)的自溶酶共同作用促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水解，從而
4提高了蝦青素的提取率；而且除蛋白酶外，嗜熱鏈球菌發(fā)酵過程可能分泌解脂酶(如脂肪酶和磷脂酶)和纖維素酶等可斷開甲殼素與蝦青素之間的結(jié)合，從而有利于蝦青素等脂溶性物質(zhì)的提取。各種酶之間往往會(huì)有協(xié)同作用，可在某種程度上達(dá)到增效的作用。該技術(shù)不需外加蛋白酶，發(fā)酵液蝦香濃郁，無腥臭味和苦澀味，可方便地用于生產(chǎn)含鈣的調(diào)味品、 水解蛋白制品、保健品等各個(gè)領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I 將IOg原料蝦頭粗粉碎至2-lOcm，以I : 9固液比加入水，并加入IOg葡萄糖。將在脫脂奶粉培養(yǎng)液中活化24h的液態(tài)菌種以1%的比例接種，38°C下降解72h。將發(fā)酵液抽濾。液體部分用噴霧干燥得蛋白鈣粉。固體部分使用乙醇以固液比I : 6在45°C提取蝦青素45min，之后于8000r/min離心20分鐘。保留液態(tài)部分將固體部分重復(fù)上述操作2 次。合并液體部分。將剩余蝦頭殘?jiān)娓?，得甲殼素粗品。最終，獲得的蝦青素油含蝦青素 21. 6 μ g，有機(jī)溶劑回收；獲得富含乳酸鈣和氨基酸的復(fù)合蛋白肽粉得O. 52g ;獲得甲殼素粗品I. 70g。實(shí)例2 將20g原料蝦頭粗粉碎至2-lOcm，以2 : 8固液比加入水，并加入15g葡萄糖。其他操作同實(shí)例I。最終，獲得的蝦青素油含蝦青素15. 7μ g，有機(jī)溶劑回收；獲得富含乳酸鈣和氣基酸的復(fù)合蛋白妝粉得O. 59g ;獲得甲殼素粗品I. 78g。實(shí)例3 原料、加水比例及葡萄糖量同實(shí)例I。菌種活化24h，5%接種。降解時(shí)間72h，其他操作同實(shí)例I。最終，獲得的蝦青素油含蝦青素18. 9μ g，有機(jī)溶劑回收；獲得富含乳酸鈣和氨基酸的復(fù)合蛋白肽粉得O. 64g ;獲得甲殼素粗品I. 97g。實(shí)例4 原料、加水比例及葡萄糖量同實(shí)例I。菌種活化24h，9%接種。降解時(shí)間48h，其他操作同實(shí)例I。最終，獲得的蝦青素油含蝦青素15. 39μ g，有機(jī)溶劑回收；獲得富含乳酸鈣和氨基酸的復(fù)合蛋白肽粉得O. 32g ;獲得甲殼素粗品I. 26g。實(shí)例5:將30g原料蝦頭粗粉碎至2-lOcm，以3 : 7固液比加入水，并加入IOg葡萄糖。其他操作同實(shí)例I。最終，獲得的蝦青素油含蝦青素16. 7μ g，有機(jī)溶劑回收；獲得富含乳酸鈣和氨基酸的復(fù)合蛋白肽粉得O. 55g ;獲得甲殼素粗品I. 48g。實(shí)例6 降解工藝同實(shí)例1，降解結(jié)束后將發(fā)酵后固體部分浸泡在乙醇以中提取蝦青素。固液比I : 3。在30°C下浸泡Ih.重復(fù)上述操作2次。其他操作同實(shí)例I。乙醇提得蝦青素 13. 70 μ g0蛋白鈣粉得O. 52g。甲殼素粗品得1.803g。實(shí)例7 降解工藝同實(shí)例1，降解結(jié)束后將發(fā)酵后固體部分浸泡在乙醇以中提取蝦青素。固液比I : 9。在60°C下浸泡Ih.重復(fù)上述操作2次。其他操作同實(shí)例I。乙醇提得蝦青素 21. 70 Ug0富含乳酸鈣和氨基酸的復(fù)合蛋白肽粉得O. 52g。甲殼素粗品得1.63g。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物從蝦頭中提取蝦青素、蛋白質(zhì)、乳酸鈣和甲殼素的方法，其特征在于是利用嗜熱鏈球菌在合適的條件下進(jìn)行蝦頭殼發(fā)酵處理后，將發(fā)酵上清液和固體殘?jiān)珠_。固體殘?jiān)靡掖冀?，再?jīng)離心，液體部分蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑，得蝦青素；殘余固體部分經(jīng)干燥得甲殼素粗品；離心上清液經(jīng)噴霧干燥濃縮得富含乳酸鈣和氨基酸的復(fù)合蛋白肽粉。
2.如權(quán)利要求I所述的利用嗜熱鏈球菌在合適的條件下進(jìn)行蝦頭殼發(fā)酵處理，其特征在于將活化好的嗜熱鏈球菌懸液以1-20%的接種量，接入未滅菌的蝦頭殼中，加入O.1-20%葡萄糖和固液比I O. 1-20的蒸餾水。
3.如權(quán)利要求I所述的利用嗜熱鏈球菌在合適的條件下進(jìn)行蝦頭殼發(fā)酵處理，其特征在于發(fā)酵過程中不需要通氧或攪拌，在30-45°C下發(fā)酵12-72h。
4.如權(quán)利要求I所述的將發(fā)酵上清液和固體殘?jiān)珠_，其特征在于發(fā)酵液通過 2000-10000r/min離心和/或過濾的方式發(fā)酵上清液和固體殘?jiān)蛛x開。
5.如權(quán)利要求I所述的蝦青素，其特征在于蝦頭殼發(fā)酵后固體殘?jiān)糠钟靡掖家怨桃罕菼 : 3-7在10-60°C下浸泡蝦頭O. 5-10小時(shí)，離心分離。重復(fù)上述步驟2-6次，合并液體部分得蝦青素提取液。蝦青素提取液可經(jīng)噴霧干燥得蝦青素粉末。
6.如權(quán)利要求I所述的復(fù)合蛋白肽粉，其特征在于蝦頭發(fā)酵液上清液部分進(jìn)行噴霧干燥得富含乳酸鈣和氨基酸的復(fù)合蛋白肽粉。
7.如權(quán)利要求I所述的甲殼素，其特征在于用乙醇提取后剩下的固體部分可烘干得甲殼素粗品。
全文摘要
一種微生物從蝦頭中提取蝦青素、蛋白質(zhì)、乳酸鈣和甲殼素的方法，是利用嗜熱鏈球菌在合適的條件下進(jìn)行蝦頭殼發(fā)酵處理后，經(jīng)過離心分別收集上清液和固體沉淀。固體沉淀用乙醇浸泡，再經(jīng)離心，液體部分蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑，得蝦青素；殘余固體部分經(jīng)干燥得甲殼素粗品；離心上清液經(jīng)噴霧干燥濃縮得富含乳酸鈣和氨基酸的復(fù)合蛋白肽粉；此工藝具有過程合理、無污染、原料利用完全、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102586378SQ201210062258
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者張婧, 李鈺金, 林洪, 毛相朝, 胡增淼, 高原松 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué), 泰祥集團(tuán)技術(shù)開發(fā)有限公司