專(zhuān)利名稱(chēng)：耐鹽基因CcSOS1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程和轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域，涉及耐鹽基因CcSOSl及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
菊花(Chrysanthemum grandif lorum)，菊科多年生草本植物，其中切花菊是世界四大切花之一，菊花原產(chǎn)于我國(guó)，因?yàn)榇笞匀毁x予它豐富的花色、多變的花型以及易于栽培等特點(diǎn)，使其深受廣大人民的喜愛(ài)。近年來(lái)切花菊在切花消費(fèi)中占有很大的比重，其栽培面積已位居我國(guó)切花生產(chǎn)的首位。隨著全球土壤鹽漬化的不斷加重，菊花的生產(chǎn)面臨著嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法改造土壤不僅耗資巨大，而且隨著大量化學(xué)物質(zhì)的加入加重了土壤的次生鹽漬化。由于植物耐鹽性狀本身的復(fù)雜性，采用傳統(tǒng)的育種方法已經(jīng)很難獲得耐鹽優(yōu)良品種。生物技術(shù)不斷的發(fā)展，導(dǎo)入外源基因提高植物抗鹽性已成為現(xiàn)代植物育種的主要手段。SOSl基因是質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，除了負(fù)責(zé)將過(guò)多的Na+排出細(xì)胞之外，還控制Na+從根到莖的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，并且有數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)擬南芥AtSOSl基因可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性(任仲海，等2002 ；周曉馥，等2002 ；Shi,等2000)。鑒于質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽方面的作用，目前許多編碼該蛋白的基因已經(jīng)被克隆，既有從非鹽生植物中克隆出來(lái)的，如蘆葦WiaNHAl (Takahashi等，2006)、水稻 OsSOSl (Martinez-Atienza等，2007)、星星草PtSOSl (程玉祥，2008)，也有從耐鹽的植物中克隆得到的，如胡楊PeSOSl (Wu等，2007)、小鹽芥ThSOSl (Oh等，2007)等。在植物的遺傳轉(zhuǎn)化途徑中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達(dá)載體至關(guān)重要。將耐鹽基因CcSOSl構(gòu)建植物表達(dá)載體，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，可獲得具有耐鹽特性的新種質(zhì)。對(duì)于優(yōu)良作物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，具有重要意義。參考文獻(xiàn)[IjMukherjee K, Roy Choudhury A, Gupta B, Gupta S，SenguptaDN(2006)AnABRE-binding factor, 0SBZ8, is highly expressed in salt tolerant cultivars than in salt sensitive cultivars of indica rice.BMC Plant Biol 6:18[2]Martinez-Atienza J, Jiang X Y, Garciadeblas B, et al. Conservation of the salt overly sensitive pathway in Rice. Plant Physiol,2007,143 :1001-1012[3]Prior C, Potier S, Souociet J L, et al. Characterization of the NHAl gene encoding a Na+/H+ antiporter of the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett,1996,387(1) :89-93[4] Shi H Z, Ishitani M, Kim C, et al. The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOSl encodes a putative Na+/H+ antiporter. ProcNatlAcadSci USA, 2000,97 :6896-6901
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種新的耐鹽基因CcSOSl。本發(fā)明的另一目的是提供該基因的應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的是提供一種通過(guò)轉(zhuǎn)CcSOSl基因提高菊花抗鹽性的方法。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)耐鹽基因CcSOSl，其核苷酸序列為SEQ ID No. 1。所述的耐鹽基因CcSOSl編碼的蛋白質(zhì)。含有所述的耐鹽基因CcSOSl的植物表達(dá)載體。所述的耐鹽基因CcSOSl在提高菊花抗鹽性方面的應(yīng)用。所述的含耐鹽基因CcSOSl的植物表達(dá)載體在提高菊花抗鹽性方面的應(yīng)用。一種提高菊花抗鹽性的方法，該方法包括如下步驟(1)構(gòu)建CcSOSl基因的植物表達(dá)載體將所述的CcSOSl基因插入表達(dá)載體得到含耐鹽基因CcSOSl植物表達(dá)載體；(2)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含CcSOSl基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到切花菊中，進(jìn)行培養(yǎng)初步獲得抗性植株。步驟(1)的具體方法優(yōu)選以鹽生植物大島野路菊為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CcSOSl基因的上下游分別引入MlI和 KpnI 酶切位點(diǎn)，上游引物為=CcSOSl-Sal-F =SEQ ID N0. 2，下游引物為 CcSOSl-Kpn-R :SEQ ID NO. 3，將擴(kuò)增出來(lái)的含有CcSOSl完整開(kāi)放閱讀框的PCR產(chǎn)物片段與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，由Mil和KpnI雙酶切得到的CcSOSl基因片段，與 SalI和KpnI雙酶切的線性化的表達(dá)載體pCAMBIA1301連接，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，酶切電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-CcS0Sl構(gòu)建成功。步驟⑵的具體方法優(yōu)選制備感受態(tài)的農(nóng)桿菌，將步驟⑴中構(gòu)建的含有 CcSOSl基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-CcS0Sl轉(zhuǎn)入感受態(tài)的農(nóng)桿菌菌株中；取組培瓶中菊花苗頂端葉盤(pán)作為轉(zhuǎn)化受體，在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 3d，然后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染8min，含有CcSOSl基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液OD值為0. 5 0. 6，侵染后用濾紙吸干葉盤(pán)外表的菌液，然后將葉盤(pán)放到共生培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)3d，最后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng) 3 4代，等分化出的抗性芽長(zhǎng)至2 3厘米時(shí)，將抗性芽轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初步獲得抗性植株；其中所述的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；所述的篩選培養(yǎng)基MS+潮霉素10mg/L+ 羧芐青霉素500mg/L+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧芐青霉素350mg/L+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 3mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧芐青霉素300mg/ L+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. lmg/L ；所述的生根培養(yǎng)基1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸 0. lmg/L。所述的提高菊花抗鹽性的方法，還包括步驟C3)將轉(zhuǎn)CcSOSl基因初步獲得的抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和熒光定量PCR檢測(cè)，篩選陽(yáng)性植株，獲得轉(zhuǎn)基因菊花株系；其中，所述的PCR檢測(cè)方法為取生根篩選得到的抗性植株嫩葉及野生型植株嫩葉，采用CTAB法提取基因組 DNA，將hptll基因作為檢測(cè)目標(biāo)，根據(jù)hptll基因序列合成擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)為980bp， 引物序列為=HII-I =SEQ ID NO. 4，HII-2 =SEQ ID NO. 5 ；分別以潮霉素抗性植株、野生型植株DNA和陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，以HII-I和HII-2為引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析；所述的熒光定量PCR檢測(cè)方法為每個(gè)樣品重復(fù)3次，建立擴(kuò)增體系，根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到各個(gè)樣品的CT值，以未轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)為基準(zhǔn)值，計(jì)算各轉(zhuǎn)基因植株及野生型基因相對(duì)表達(dá)情況；特異引物片段長(zhǎng)為 295bp，引物序列為=SOS-JC-Fl :SEQ ID NO. 6，SOS-JC-Rl :SEQ ID NO. 7 ；以擴(kuò)增的GAPDH基因片段為內(nèi)標(biāo)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為260bp，引物序列為GAPDH-F =SEQ ID NO. 8，GAPDH-R =SEQ ID NO. 9，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。所述的農(nóng)桿菌菌株為EHA105。有益效果本發(fā)明從鹽生植物大島野路菊首次克隆了一個(gè)新的耐鹽基因CcSOSl，通過(guò)將 CcSOSl基因整合到菊花基因組中，通過(guò)高鹽試驗(yàn)分析獲得耐高鹽的轉(zhuǎn)基因菊花株系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型株系相比，轉(zhuǎn)CcSOSl的植株耐鹽能力得到很大提高，而野生型植株抗性很弱。利用本方法可以顯著提高菊花的耐鹽性，為利用基因工程技術(shù)選育菊花抗鹽性品種提供了新穎的方法，將有效推動(dòng)菊花生物技術(shù)育種進(jìn)程。。


圖1 植物重組表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1301_CcS0Sl片段圖譜圖2 植物表達(dá)載體構(gòu)建酶切驗(yàn)證3 轉(zhuǎn)基因切花菊的轉(zhuǎn)化和再生過(guò)程A，轉(zhuǎn)化葉盤(pán)分化出愈傷組織；B，轉(zhuǎn)化葉盤(pán)分化出抗性芽；C，生根篩選；D，抗性植株圖4 轉(zhuǎn)CcSOSl基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果M =Marker ；CK+ 陽(yáng)性質(zhì)粒；CK-野生型植株；1-14 轉(zhuǎn)基因植株
圖5 熒光定量PCR檢測(cè)CcSOSl基因在轉(zhuǎn)基因和野生型植株的表達(dá)WT 野生型植株；S1-S12 轉(zhuǎn)CcSOSl基因株系圖6 轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株鹽脅迫處理后恢復(fù)生長(zhǎng)存活率分析a 轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株鹽脅迫處理后恢復(fù)生長(zhǎng)；b 轉(zhuǎn)基因株系與野生型植株鹽處理后恢復(fù)生長(zhǎng)存活率統(tǒng)計(jì)圖7 轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株鹽水培脅迫處理后生長(zhǎng)狀態(tài)變化圖8 轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株鹽水培處理后生理指標(biāo)的檢測(cè)a 鹽脅迫下單株受害葉面積比率；b 鹽脅迫下葉片相對(duì)電導(dǎo)率變化；c 鹽脅迫下葉綠素(a+b)含量；d 鹽脅迫下脯氨酸含量變化；e 鹽脅迫下SOD活性變化；f 鹽脅迫下 POD活性變化圖9 轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株鹽水培處理后植物體內(nèi)Na+含量的變化圖10 轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株鹽水處理后植物體內(nèi)K+含量的變化
具體實(shí)施例方式下面對(duì)發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。實(shí)施例11、植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301_CcS0Sl的構(gòu)建以鹽生植物大島野路菊為材料，提取總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa) 取1 μ g總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CcSOS 1基因的上下游分別引入Ml I和KpnI酶切位點(diǎn)，上游引物為 CcSOSl-Sal-F :GGGTCGAC ATG GGA TCG GTG GCA AAC AAC GT (SEQ ID NO. 2)，下游引物為 CcSOSl-Kpn-R :GGGGTACC TTA GGG AGC TCG GGG GA (SEQ ID NO. 3)。50 μ L 反應(yīng)體系 10 X PCR Buffer 5. 0 μ L, CcSOSl-Sal-F, CcSOSl-Kpn-R 弓 | 物各 1· 0 μ L (20 μ mol · L-1)， dNTP mix 4. 0μ L(2. 5mmol · L-1)，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase?！?2 μ L, cDNA 模板 1 μ L，ddH20 37. 8 μ L ；反應(yīng)程序95°C預(yù)變性 ％iin，然后 94°C解鏈 30sec，55°C退火 30sec， 72°C延伸％iin，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ;PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收純化，用T4DNA連接酶(I1aKaRa)連接到T-載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)定序列為SEQ ID N0. 1。提取含有目的片段的T-載體及表達(dá)載體PCAMBIA1301質(zhì)粒DNA并雙酶切，酶切體系為10XBuffer T7. 5 μ L，BSA5 μ L, Sail 2. 0 μ L, KpnI 2.0yL，質(zhì)粒 DNA 10 μ L, ddH20 補(bǔ)齊至50μ L，37°C過(guò)夜充分酶切。將含有CcSOSl完整開(kāi)放閱讀框的片段和pCAMBIA1301 線性化質(zhì)粒片段分別回收，并將兩個(gè)片段連接。連接反應(yīng)體系為T(mén)4 Buffer 2.0yL，T4連接酶1. 0 μ L，載體回收液1. 0 μ L，目的基因回收液4. 0 μ L，dd H2O補(bǔ)齊至20 μ L，4°C過(guò)夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA 1301-CcS0Sl轉(zhuǎn)化T0P10細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，酶切電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證(圖1和圖2)。2、農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化菊花制備感受態(tài)的農(nóng)桿菌，將CcSOSl基因的植物表達(dá)載pCAMBIA1301_CcS0Sl轉(zhuǎn)入感受態(tài)的農(nóng)桿菌菌株中，詳細(xì)過(guò)程從YEB (50 μ g/mL利福平)平板上挑取EHA105單菌落，接種于50mL含50 μ g/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm, 培養(yǎng)至OD值0. 5，然后菌液冰浴30min，將菌液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，4000rpm離心，收集菌體，將菌體懸浮于2mL預(yù)冷的IOOmMCaCl2 QO%甘油)溶液中，200 μ L/管分裝，待用。取5yL pCAMBIA 1301_CcS0Sl載體質(zhì)粒，加入200 μ L ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞，攪拌混勻，冰浴30min，液氮冷凍5min，37°C 5min,加入800 μ L YEB液體培養(yǎng)基，28 0C 200rpm預(yù)培養(yǎng)4h，菌液涂板于YEB (50 μ g/mL利福平+50 μ g/mL卡那霉素) 固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測(cè)，選取陽(yáng)性克隆搖菌，用于轉(zhuǎn)化菊花。用YEB (50 μ g/mL利福平+50 μ g/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)包含CcSOSl基因的植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105 ；以切花菊‘神馬’葉片為外植體，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將大島野路菊中克隆得到的CcSOSl基因?qū)搿耨R’取組培瓶中‘神馬’苗頂端葉盤(pán) (0. 5cmX0. 5cm)作為轉(zhuǎn)化受體，在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3d，然后浸入備好的農(nóng)桿菌菌液 (0D為0. 5 0. 6)中感染8min，用濾紙吸干葉盤(pán)表面的菌液后再接種到共培養(yǎng)基上黑暗中培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4代，兩周繼代一次，逐漸降低篩選壓，等分化出的抗性芽長(zhǎng)至2 3cm時(shí)，將抗性芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，初步獲得抗性植株(圖 3)。菊花組織培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，pH5. 8，lOOKpa、121°C滅菌25分鐘。預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6_芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L。共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6_芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L。篩選培養(yǎng)基依次分別為MS+潮霉素10mg/L+羧芐青霉素500mg/L+6_芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧芐青霉素350mg/L+6_芐氨基嘌呤Img/ L+萘乙酸0. 3mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧芐青霉素300mg/L+6_芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸
0.lmg/L。生根培養(yǎng)基d/^MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0. lmg/L。3、轉(zhuǎn)CcSOSl基因抗性植株的分子檢測(cè)(PCR及熒光定量PCR)(I)PCR 檢測(cè)取生根篩選得到的潮霉素抗性植株嫩葉及野生型植株嫩葉，采取CTAB法提取基因組DNA。將hptll基因作為檢測(cè)目標(biāo)，根據(jù)hptll基因序列合成擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)為 980bp,引物序列為:HII-1 :CGTCTGTCGAGAAGTTTC(SEQ ID NO. 4)，HII-2 TACTTCTACACAGCCATC(SEQ ID NO. 5)；分別以潮霉素抗性植株、野生型植株DNA和陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，以HII-I和HII-2為引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。擴(kuò)增體系為:2. 5yL 10XPCR Buffer,
1.5μ L 2. 5mmol ‘ L-1 MgCl2, 2 μ LdNTP, ΗΙΙ—1 禾口 ΗΙΙ—2 各 1 μ L，1 μ L DNA 模板，0· 2μ L 5U · μ L-1Taq酶，去離子水補(bǔ)足25 μ L0擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，58°C 退火45s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析(如圖4)。圖中可以看到，轉(zhuǎn)CcSOSl基因的植株中有9個(gè)株系擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照相同的特異性條帶，野生型植株中沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。(2)熒光定量RT-PCR檢測(cè)采用TaKaRa公司生產(chǎn)的RNAiso Reagent試劑盒，提取抗潮霉素植株葉片及未轉(zhuǎn)化株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，用熒光定量qRT-PCR對(duì)CcSOSl基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。按照熒光定量試劑盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))說(shuō)明書(shū)建立25μ L擴(kuò)增體系；擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性-Imin ；95°C變性-1 ，60°C退火-1 ， 72°C延伸-45s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Roter Gene 6. O和Excel軟件分析，采用△ ACt法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)分析，以野生型植株的表達(dá)為基準(zhǔn)值，計(jì)算各轉(zhuǎn)基因植株及野生型基因相對(duì)表達(dá)情況。特異引物片段長(zhǎng)為^^bp，引物序列為=SOS-JC-Fl CATACCAAGTCTAGGCAGCATC(SEQ ID NO. 6)，SOS-JC-Rl GACTTTCACTTGCTATTTCTCCC(SEQ ID NO. 7)以擴(kuò)增的 GAPDH 基因片段為內(nèi)標(biāo)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 260bp,引物序列為GAPDH-F :CTGCTTCTTTCAACATCATTCC (SEQ ID NO. 8)， GAPDH-R :CTGCTCATAGGTAGCCTTCTTC (SEQ ID NO. 9)。根據(jù)熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果(圖 5)， 轉(zhuǎn)基因株系中CcSOSl基因的表達(dá)量顯著高于野生型植株，其中株系S11、S12表達(dá)量相對(duì)最高。證實(shí)CcSOSl基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到切花菊基因組DNA中并表達(dá)。4、轉(zhuǎn)基因植株后代的抗性分析(1)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株鹽脅迫處理后恢復(fù)生長(zhǎng)存活率分析為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系Sll、S12進(jìn)行了鹽脅迫處理。將生長(zhǎng)一致的轉(zhuǎn)基因植株及未轉(zhuǎn)基因植株各9株種植于塑料杯中，各株系重復(fù)3次，栽培基質(zhì)為按 1 1比例混合的營(yíng)養(yǎng)土 蛭石混合物，種植于溫室(23士2°C，12h光周期)中，待轉(zhuǎn)基因及未轉(zhuǎn)化植株展葉8 10片葉時(shí)控水處理7d，然后澆灌200mmol/L的NaCl溶液7d，然后將植株根系用去離子水沖洗3遍，并種植于新?tīng)I(yíng)養(yǎng)缽中澆足水恢復(fù)生長(zhǎng)一周，統(tǒng)計(jì)植株存活率， 存活率采用極限恢復(fù)法(張常青等，2005)。由圖6可以看出，鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系S11、S12的大部分植株頂端仍然保持綠色，只有基部葉片皺縮、萎蔫下垂，恢復(fù)生長(zhǎng)后，存活率為80% 90%;野生型植株只有少部分植株頂端保持綠色，葉片大部分皺縮、萎蔫下垂，恢復(fù)生長(zhǎng)后，存活率僅為50%。(2)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株鹽脅迫后各項(xiàng)生理指標(biāo)的檢測(cè)采集轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株生長(zhǎng)一致的扦插苗，當(dāng)葉片長(zhǎng)至8 10片葉時(shí)，用 200mmol/LNaCl進(jìn)行水培處理，放置于23士2°C，12h光周期環(huán)境中，然后分別在0d、2d、4d、 6d、8d進(jìn)行取樣(植物葉片)，測(cè)量鹽脅迫下單株受害葉面積比率、葉片相對(duì)電導(dǎo)率、葉片葉綠素(a+b)含量、脯氨酸含量以及SOD和POD活性變化。單株受害葉面積比率采用管志勇等的方法(2010)，葉片相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量的測(cè)定采用李合生等的方法(2000)，游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸方法測(cè)定(李合生等，2000)，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，SOD采用氮藍(lán)四唑(NBT)法，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法。數(shù)據(jù)分析采用SPSS(SPSSRelease10. 0. 1)軟件；作圖用EXCEL系統(tǒng)。由圖7可以看出，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系Sll、S12以及野生型植株進(jìn)行鹽脅迫處理。隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)，與WT植株相比，SlU S12轉(zhuǎn)基因株系萎蔫進(jìn)程較慢，WT植株只有少部分植株頂端保持綠色，葉片大部分皺縮、萎蔫下垂，而轉(zhuǎn)基因株系大部分仍保持綠色。由圖8中a可以看出，鹽脅迫下，S11、S12轉(zhuǎn)基因株系的單株受害葉面積比率明顯低于野生型植株，鹽處理第4d時(shí)，野生型植株的受害葉面積比率已經(jīng)達(dá)到了 50%，是轉(zhuǎn)基因植株的2. 5倍。當(dāng)鹽處理到第8d時(shí)，野生型植株受害葉面積比率已經(jīng)接近于100%。由圖8中b可以看出，鹽處理下轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相對(duì)電導(dǎo)率表現(xiàn)出顯著性差異，尤其在鹽處理第8d時(shí)，對(duì)照比轉(zhuǎn)基因株系高1.5倍。表明Sll、S12轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性明顯高于野生型植株。由圖8中c可以看出，所有植株的葉綠素含量都隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步下降，但是野生型植株葉綠素含量的下降幅度顯著大于Sll、S12轉(zhuǎn)基因株系，當(dāng)鹽處理進(jìn)行第8天時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量是對(duì)照的3倍，差異顯著。由圖8中d可以看出，Sll、S12轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株中脯氨酸含量水平隨時(shí)間呈緩慢升高狀態(tài)，鹽處理的前4天中，野生型植株中的脯氨酸含量水平略高于Sl 1、S12植株。4d后，S11、S12植株中脯氨酸含量繼續(xù)升高，而野生型植株的脯氨酸含量上升趨于緩慢，總體上含量低于轉(zhuǎn)基因株系。由圖8中e可以看出，轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株中SOD活性水平均呈現(xiàn)緩慢升高狀態(tài)，但Sll、S12轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性水平變化幅度較大，明顯高于野生型植株。由圖8中f可以看出，轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株中POD活性變化趨勢(shì)稍有不同，野生型植株中POD活性呈緩慢升高的狀態(tài)，而S11、S12轉(zhuǎn)基因株系在處理第二天時(shí)，POD活性水平迅速升高，第4d時(shí)達(dá)到最低水平，隨后繼續(xù)呈現(xiàn)較快的升高狀態(tài)，POD活性水平明顯高于野生型植株，轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株鹽脅迫后離子含量檢測(cè)。(3)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株鹽脅迫后離子含量檢測(cè)采集轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株生長(zhǎng)一致的扦插苗，用200mmOl/LNaCl進(jìn)行水培處理，分別在0d、2d、4d、6d、8d對(duì)植株4個(gè)部位進(jìn)行取樣，取樣部位分別為上位葉、中位葉、莖和根，然后檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)植株各部分Na+、K+含量變化。Na+、K+的提取參照王寶山和趙可夫(19卯)的方法略加改動(dòng)，Na+、K+含量用Optimal 2100DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 (Perkin Elmer)進(jìn)行測(cè)定。由圖9、10可以看出，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株體內(nèi)的Na+主要分布在中位葉中，其次是上位葉、莖和根中，而且隨著鹽處理時(shí)間的延續(xù)，不同部位的Na+含量呈逐步上升的趨勢(shì)，但是，相比較野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株各個(gè)部位的Na+含量均明顯低于野生型植株。鹽脅迫下，K+在植物體的分布主要集中在根、莖，然后是中位葉和上位葉，與Na+的分布正好相反，而且隨著鹽處理時(shí)間的延續(xù)，K+在不同部位的變化趨勢(shì)與Na+的變化趨勢(shì)也不同，隨著時(shí)間的變化，K+在轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株的上位葉上呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)，而在中位葉、莖和根中，K+都表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，但總體上，轉(zhuǎn)基因植株不同部位的K+含量明顯高于野生型植株。
權(quán)利要求
1.耐鹽基因CcSOSl，其特征在于核苷酸序列為SEQID No. 1。
2.權(quán)利要求1所述的耐鹽基因CcSOSl編碼的蛋白質(zhì)。
3.含有權(quán)利要求1所述的耐鹽基因CcSOSl的植物表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求1所述的耐鹽基因CcSOSl在提高菊花抗鹽性方面的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求3所述的含耐鹽基因CcSOSl的植物表達(dá)載體在提高菊花抗鹽性方面的應(yīng)用。
6.一種提高菊花抗鹽性的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)構(gòu)建CcSOSl基因的植物表達(dá)載體將所述的CcSOSl基因插入表達(dá)載體得到含耐鹽基因CcSOSl植物表達(dá)載體；(2)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含CcSOSl基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到切花菊中，進(jìn)行培養(yǎng)初步獲得抗性植株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的提高菊花抗鹽性的方法，其特征在于步驟(1)的具體方法為以鹽生植物大島野路菊為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CcSOSl基因的上下游分別引入MlI和KpnI酶切位點(diǎn)，上游引物為CcSOSl-Sal-F =SEQ ID NO. 2，下游引物為 CcSOSl-Kpn-R :SEQ ID NO. 3，將擴(kuò)增出來(lái)的含有CcSOSl完整開(kāi)放閱讀框的PCR產(chǎn)物片段與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，由Mil和KpnI雙酶切得到的CcSOSl基因片段，與Mil和KpnI雙酶切的線性化的表達(dá)載體PCAMBIA1301連接，轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，酶切電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-CcS0Sl構(gòu)建成功。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的提高菊花抗鹽性的方法，其特征在于步驟O)的具體方法為制備感受態(tài)的農(nóng)桿菌，將步驟(1)中構(gòu)建的含有CcSOSl基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-CcS0Sl轉(zhuǎn)入感受態(tài)的農(nóng)桿菌菌株中；取組培瓶中菊花苗頂端葉盤(pán)作為轉(zhuǎn)化受體，在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 3d，然后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染8min，含有CcSOSl基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液OD值為0. 5 0. 6，侵染后用濾紙吸干葉盤(pán)外表的菌液，然后將葉盤(pán)放到共生培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)3d，最后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4代，兩周繼代一次，繼代過(guò)程中逐漸降低篩選壓，等分化出的抗性芽長(zhǎng)至2 3厘米時(shí)，將抗性芽轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初步獲得抗性植株；其中所述的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；所述的篩選培養(yǎng)基依次為MS+潮霉素10mg/L+羧芐青霉素500mg/L+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧芐青霉素350mg/L+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 3mg/L ；MS+潮霉素8mg/L+羧芐青霉素300mg/L+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. lmg/L ；所述的生根培養(yǎng)基1/2MS+ 潮霉素 8mg/L+ 萘乙酸 0. lmg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 8中任一項(xiàng)所述的提高菊花抗鹽性的方法，其特征在于還包括步驟(3)將轉(zhuǎn)CcSOSl基因初步獲得的抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和熒光定量PCR檢測(cè)，篩選陽(yáng)性植株，獲得轉(zhuǎn)基因菊花株系；其中，所述的PCR檢測(cè)方法為取生根篩選得到的抗性植株嫩葉及野生型植株嫩葉，采用CTAB法提取基因組DNA，將hptll基因作為檢測(cè)目標(biāo)，根據(jù)hptll基因序列合成擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)為980bp，引物序列為=HII-I =SEQ ID NO. 4，HII-2 =SEQ ID NO. 5 ；分別以潮霉素抗性植株、野生型植株DNA和陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，以HII-I和HII-2為引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析；所述的熒光定量PCR檢測(cè)方法為每個(gè)樣品重復(fù)3次，建立擴(kuò)增體系，根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到各個(gè)樣品的Ct值，以未轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)為基準(zhǔn)值，計(jì)算各轉(zhuǎn)基因植株及野生型基因相對(duì)表達(dá)情況；特異引物片段長(zhǎng)為295bp，引物序列為=SOS-JC-Fl :SEQ ID NO. 6，SOS-JC-Rl :SEQ ID NO. 7 ；以擴(kuò)增的 GAPDH基因片段為內(nèi)標(biāo)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為260bp，引物序列為=GAPDH-F =SEQ ID NO. 8，GAPDH-R =SEQID NO. 9，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求6 8中任一項(xiàng)所述的提高菊花抗鹽性的方法，其特征在于所用的農(nóng)桿菌菌株為EHA105。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程和轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域，公開(kāi)了耐鹽基因CcSOS1及其應(yīng)用。耐鹽基因CcSOS1，其核苷酸序列為SEQ ID No.1。所述的耐鹽基因CcSOS1在提高菊花抗鹽性方面的應(yīng)用。一種提高菊花抗鹽性的方法，該方法包括如下步驟(1)構(gòu)建CcSOS1基因的植物表達(dá)載體；(2)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含CcSOS1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到切花菊中，進(jìn)行培養(yǎng)初步獲得抗性植株。本發(fā)明從鹽生植物大島野路菊首次克隆了一個(gè)新的耐鹽基因CcSOS1，通過(guò)將該基因整合到菊花基因組中，通過(guò)高鹽試驗(yàn)分析獲得耐高鹽的轉(zhuǎn)基因菊花株系。利用本方法可以顯著提高菊花的耐鹽性。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102559702SQ201210063040
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者劉兆磊, 盧軍剛, 安娟, 宋愛(ài)萍, 房偉民, 管志勇, 蔣甲福, 陳發(fā)棣, 陳素梅 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)