專利名稱：一種k562細(xì)胞擴(kuò)增激活nk細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體是指使用跨膜IL-21，⑶14，⑶19，⑶86和⑶137轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞和低濃度白介素2共同作用定向擴(kuò)增激活自然殺傷細(xì)胞(NK)的方法。
背景技術(shù)：
NK細(xì)胞治療對腎細(xì)胞癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和急性白血病等腫瘤治療有明顯療效。目前NK細(xì)胞治療在美國主要用來和手術(shù)、化療和放療聯(lián)合使用。NK細(xì)胞數(shù)量和殺傷功能與療效直接相關(guān)，治療中存在的問題在于獲得大量NK細(xì)胞非常困難。傳統(tǒng)使用的高劑量白介素2激活生長倍數(shù)有限，端粒酶活性降低，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞殺傷功能低下。本公司之前的發(fā)明采用K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染跨膜IL-21和CD137復(fù)合物解決了這一問題。用該方法擴(kuò)增的NK細(xì)胞純度和活性顯著增強(qiáng)，數(shù)量上可以達(dá)到臨床治療的需要。然而在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment)中存在有大量的TAMs (腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)和CD19+B細(xì)胞，這些細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞的生長提供營養(yǎng)因子。用僅轉(zhuǎn)染跨膜IL-21 和CD137復(fù)合物的K562細(xì)胞激活擴(kuò)增的NK細(xì)胞雖然對腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷能力，對腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的殺傷能力卻很弱。本發(fā)明在轉(zhuǎn)染跨膜IL-21和 ⑶137K562細(xì)胞的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染了⑶14、⑶19和⑶86。K562細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的⑶14有助于激活NK細(xì)胞識別并殺傷腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞；轉(zhuǎn)染CD19有助于激活NK細(xì)胞識別并殺傷B細(xì)胞；轉(zhuǎn)染CD86有助于提升NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞、微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和微環(huán)境中的 B細(xì)胞的殺傷作用。本發(fā)明提供體外擴(kuò)增和激活NK的方法比用僅轉(zhuǎn)染跨膜IL-21和⑶137的K562細(xì)胞激活擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，擴(kuò)增的效率高2. 4倍，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的殺傷能力提高了 2. 7倍。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與用僅轉(zhuǎn)染跨膜IL-21和CD137的K562細(xì)胞激活擴(kuò)增的NK細(xì)胞相比，采用本發(fā)明擴(kuò)增的NK細(xì)胞顯著提高了對小鼠體內(nèi)腫瘤的殺傷能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出一種更具有發(fā)展?jié)摿Φ姆椒?，?shí)現(xiàn)NK細(xì)胞的擴(kuò)增。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的一種K562細(xì)胞擴(kuò)增激活NK細(xì)胞的方法，其特征在于包括下述步驟(I)以K562細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定表達(dá)CD8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD 137的表達(dá)載體，⑶8 α為在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，⑶8 α基因連接白介素21基因后使得白介素 21表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白；而⑶14、⑶19、⑶86和⑶137為膜蛋白，載體中含有病毒啟動子和選擇標(biāo)記基因；(2)當(dāng)外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，激活啟動子，培養(yǎng)Κ562細(xì)胞一段時間，即可以得到在細(xì)胞膜上的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137多肽；
(3)經(jīng)培養(yǎng)后的K562細(xì)胞膜上具有表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137 的細(xì)胞，通過強(qiáng)酸，強(qiáng)堿、和/或輻照、及通過高速離心收集K562細(xì)胞；或?qū)562細(xì)胞的依次用硫酸銨或乙醇沉淀，強(qiáng)酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進(jìn)行純化收集；(4)將上述離心收集的K562細(xì)胞與NK細(xì)胞、或NK細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的組合、 或是NK細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的組合、或是外周血單核細(xì)胞和其它淋巴細(xì)胞的組合、或是白介素 2和/或白介素21和/或⑶14和/或⑶19和/或⑶86和/或⑶137與白細(xì)胞的組合進(jìn)行共同培養(yǎng)、或在純化分離K562細(xì)胞后與PBMC共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增NK細(xì)胞，直至NK細(xì)胞代表總數(shù)的50%以上。作為優(yōu)選，上述方法的步驟(4)中的培養(yǎng)液為Eagle' s培養(yǎng)液加入10%人血清或10%小牛血清，或RPMI 1640加入10%人血清或10%小牛血清，或F-IO (Ham' s) Nutrient mixtures加入10%人血清或10%小牛血清。作為優(yōu)選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的劑量在50pM InM;為了更好實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的劑量在 500pM 800pM。作為優(yōu)選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137是經(jīng)過純化處理的蛋白質(zhì)，純化的淋巴細(xì)胞至少代表總數(shù)的50%。作為優(yōu)選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137組成的淋巴細(xì)胞在K562細(xì)胞中的表達(dá)劑量比例是，K562細(xì)胞淋巴細(xì)胞=I 10 I。作為更佳選擇，上述方法的淋巴細(xì)胞中加入跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物，且K562細(xì)胞淋巴細(xì)胞=I I、 2 : 1、3 : I、或 4 I。作為優(yōu)選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137擴(kuò)增的NK細(xì)胞
過程是通過溶于生理鹽水溶液的方法進(jìn)行。本發(fā)明中跨膜IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞對外周血單核細(xì)胞(PBMC)和NK細(xì)胞擴(kuò)增和激活有重要的作用。擴(kuò)增和激活后產(chǎn)生的NK細(xì)胞有重要的醫(yī)療作用。本發(fā)明利用的方法可以得到的足夠數(shù)量和功能的NK細(xì)胞，是理想的識別和摧毀腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞，增強(qiáng)病人免疫反應(yīng)的方法。腫瘤的類型參考前專利(專利申請?zhí)朇N201110075736)。NK細(xì)胞還可以識別和殺傷病原體感染的細(xì)胞，其中包括但不限于乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒。本發(fā)明中的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶137、⑶8 α和白介素2是該蛋白質(zhì)的全部多肽，其中也包括這些蛋白質(zhì)中具備功能的多肽成分。本發(fā)明中的外周血單核細(xì)胞來自于外周血，臍帶血和骨髓，是脫離人體的組織。本發(fā)明中用于擴(kuò)增的細(xì)胞可以是NK細(xì)胞；也可以是NK細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的不同組合；也可以是NK細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞和別的淋巴細(xì)胞的不同組合；也可以是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19 和/或CD86和/或CD137混合物注射進(jìn)人體血管后所作用的血液中所有白細(xì)胞的總和。本發(fā)明中的白介素2、白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137來源于人，但不僅僅限于人，如注射或處理的對象是其它物種，如小鼠，大鼠，猴子等等，也可以是其它物種的白介素2、白介素 21、CD14、CD19、CD86 和 CD137。除非另有說明，本發(fā)明中所有的技術(shù)和科學(xué)詞匯的含義是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士通常理解的含義。常用術(shù)語的定義在所有分子生物學(xué)書中可以找到，例如， Benjamin Lewin, Genes VIII, Oxford University Press,2004(ISBN 0-13-145140-5)。為了確保長期，高收益的生產(chǎn)重組白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137，本發(fā)明采用了蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。構(gòu)建蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所通常采用的技術(shù)，具體方法可詳見(Imai等Leukemia，2004，18，676-684)。例如，K562細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄了穩(wěn)定表達(dá)⑶8α-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的表達(dá)載體，這個載體中含有病毒啟動子和選擇標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因。CDSa是一種在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，⑶8 α基因連接白介素21基因后使得白介素21表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白<D14、 ⑶19、⑶86和⑶137為膜蛋白。外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，用恰當(dāng)?shù)姆椒せ顔幼樱?培養(yǎng)細(xì)胞一段時間后即可以得到在細(xì)胞膜上高水平表達(dá)的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和 ⑶137多肽。這些方法是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士通常理解的方法。在K562細(xì)胞膜上高水平表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的細(xì)胞可以通過高速離心的方法收集，K562細(xì)胞可以通過這些技術(shù)包括但不限于下面所列的方法處理強(qiáng)酸，強(qiáng)堿和輻照。處理后的細(xì)胞可以直接與外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)或NK細(xì)胞共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增NK細(xì)胞，也可以純化分離后與PBMC共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增NK細(xì)胞。在細(xì)胞膜上高水平表達(dá)的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137可以通過本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所熟悉的技術(shù)來純化和分離。這些技術(shù)包括但不限于下面所列的方法硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素。如有必要，蛋白質(zhì)復(fù)性的方案可用來幫助純化表達(dá)的蛋白多肽。如果有必要，高效液相色譜法(HPLC)可作最后的純化步驟進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137會有一部分分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士都可以根據(jù)普通的生物化學(xué)技術(shù)來驗(yàn)證。分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137也可以通過上述方法純化和分離。細(xì)胞膜為跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137提供了固相支撐，這固相支撐包括但不僅僅限于金屬、玻璃、塑料、聚合物、顆粒、微小顆粒、磷脂、磷脂雙分子層、細(xì)胞膜和類似物。重要的是固相的表面能夠粘附上述蛋白質(zhì)?？缒ぐ捉樗?1、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137也可以通過標(biāo)準(zhǔn)的操縱核苷酸編碼序列的方法來生產(chǎn)。例如，用特定的，非特定的定點(diǎn)突變或其他分子生物學(xué)技術(shù)來生產(chǎn)功能等同的，但一級結(jié)構(gòu)不相同的多肽。簡單的一個或多個氨基酸修改如果不影響蛋白質(zhì)的生化特性，這些通過氨基酸保守替換產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞，可以用來進(jìn)行自體移植，也可以進(jìn)行異體移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原與捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和擴(kuò)增的細(xì)胞可以通過靜脈滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些應(yīng)用中，細(xì)胞系(例如，NK細(xì)胞系，NKT細(xì)胞系)也可以通過轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞進(jìn)行激活和擴(kuò)增。擴(kuò)增的細(xì)胞系用于制備治療疾病的藥物也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞可從來源于包含有大量淋巴細(xì)胞和前體細(xì)胞的任何組織。例如，外周血(包括臍帶血)，骨髓，脾臟和淋巴結(jié)。淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞通常取自于外周血或骨髓。在其他應(yīng)用中(例如，實(shí)驗(yàn)研究)，脾臟和/或淋巴結(jié)也是合適的來源。例如，淋巴細(xì)胞可以通過抽外周血和/或骨髓來獲得。淋巴細(xì)胞可以進(jìn)一步經(jīng)過純化得到NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞。純化NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞的步驟和工藝是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴細(xì)胞可以通過密度梯度離心的方式來分離血液或骨髓中的血紅細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞。NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞可以利用抗體介導(dǎo)的親和制備方法進(jìn)一步純化，例如抗體結(jié)合磁珠法。純化淋巴細(xì)胞并不要求純化的淋巴細(xì)胞絕對純,而是指純化的細(xì)胞比其在來源組織中所占的比例更高。通常情況下，純化的淋巴細(xì)胞至少代表總數(shù)的 50%，或者60%，或者更高。純化的NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞懸浮在一個合適的生理緩沖溶液中， 然后懸浮生長于但不局限于下列培養(yǎng)液中，Eagle' s培養(yǎng)液加入10%人血清，RPMI 1640 加入10%人血清，F(xiàn)-IO (Ham' s)Nutrient mixtures加入10%人血清。人血清也可以用 10%胎牛血清取代，但人血清對NK細(xì)胞的擴(kuò)增效果更好。淋巴細(xì)胞和/或純化的淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞懸浮生長于細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入輻照后轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素 2培養(yǎng)，每周加入新的轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞。通常情況下為了降低成本和避免感染，本發(fā)明采用最小的劑量來擴(kuò)增NK淋巴細(xì)胞。白介素2的劑量在50單位/毫升到1000單位/毫升之間。在某些情況下，白介素2復(fù)合物的劑量至少在500單位/毫升以上。在某些情況下，有必要進(jìn)行高劑量的處理，激活濃度約為500單位 /毫升或1000單位/毫升。另外，跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶137直接注射入人體，用來在體內(nèi)擴(kuò)增NK細(xì)胞時，所用劑量在O. 5皮摩到O. 5鈉摩之間。轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、 ⑶14、⑶19、CD86和CD 137的K562細(xì)胞的采用劑量按照跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、 ⑶137在K562中的表達(dá)劑量來確定。在某些情況下，按照K562 :外周血單核細(xì)胞=I 1， 2 1,3 1,4 1或以上加入轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、0)14、0)19、0)86和0)137的1(562細(xì)胞。在某些情況下，有必要進(jìn)行高劑量的處理，按照K562 :外周血單核細(xì)胞=10 I或以上加入轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞。在體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞可以移植給單核細(xì)胞的捐助人本身或者受捐助人，以加強(qiáng)天生或抗原特異性免疫反應(yīng)。通常情況下，擴(kuò)增的NK細(xì)胞通過溶于生理鹽水溶液的方法靜脈滴注。有益效果本發(fā)明通過轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2培養(yǎng)擴(kuò)增激活的NK提高病人的免疫力來幫助病人抵抗腫瘤，抵抗病毒和細(xì)菌。


圖INK細(xì)胞體外擴(kuò)增線性圖，顯示NK淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、 CD86和CD137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下線性增長，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和 ⑶137的K562細(xì)胞擴(kuò)增NK細(xì)胞作為對照；圖2PBMC細(xì)胞體外擴(kuò)增線性圖，顯示淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、 CD86和CD137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下線性增長，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和 ⑶137的K562細(xì)胞擴(kuò)增淋巴細(xì)胞作為對照；
圖3PBMC細(xì)胞體外擴(kuò)增前后流示儀數(shù)據(jù)圖，PBMC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、CD14、 ⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞(⑶56+， CD16+和CD56+/CD16+)的比例顯著增長，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和⑶137的K562細(xì)胞擴(kuò)增 PBMC細(xì)胞作為對照；圖4NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞圖，人PBMC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86 和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞對K562腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562細(xì)胞擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞作為對照；圖5NK細(xì)胞殺傷TAM細(xì)胞，人PBMC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和 CD 137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞對TAM細(xì)胞的殺傷作用，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562細(xì)胞擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞作為對照；圖6擴(kuò)增激活后人NK細(xì)胞對小鼠體內(nèi)PC3腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用圖，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD 137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞對小鼠體內(nèi)的PC3細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562 細(xì)胞擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞作為對照圖；圖7轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素 2共同作用下擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞圖，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞顯著提高腫瘤小鼠的存活率和延長小鼠平均壽命，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562細(xì)胞擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞作為對照圖。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施作具體說明以K562細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定表達(dá)CD8 α -白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD 137的表達(dá)載體，⑶8 α為在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，CD8a基因連接白介素21基因后使得白介素 21表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白；而⑶14、⑶19、⑶86和⑶137為膜蛋白，載體中含有病毒啟動子和選擇標(biāo)記基因；當(dāng)外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，激活啟動子，培養(yǎng)K562細(xì)胞一段時間，即可以得到在細(xì)胞膜上的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137多肽；經(jīng)培養(yǎng)后的K562細(xì)胞膜上具有表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的細(xì)胞，通過強(qiáng)酸，強(qiáng)堿、和/或輻照、及通過高速離心收集K562細(xì)胞；或?qū)562細(xì)胞的依次用硫酸銨或乙醇沉淀，強(qiáng)酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進(jìn)行純化收集；將上述離心收集的K562細(xì)胞與NK細(xì)胞、或NK細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的組合、或是NK細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的組合、或是外周血單核細(xì)胞和其它淋巴細(xì)胞的組合、或是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或CD86和/或CD137與白細(xì)胞的組合進(jìn)行共同培養(yǎng)、或在純化分離K562細(xì)胞后與PBMC共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增NK細(xì)胞，直至NK細(xì)胞代表總數(shù)的50%以上。實(shí)施例I擴(kuò)增NK細(xì)胞。取NK細(xì)胞(2xl07)培養(yǎng)在RPMI1640中，輔以10%的人血清。在培養(yǎng)液中加入轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD 137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞(輻照，IOOGy)和白介素2(50 單位/毫升)后培養(yǎng)7天。7天后離心，用等量的培養(yǎng)液重懸，加入經(jīng)過輻照的轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞，再培養(yǎng)7天，如圖I所示。高劑量白介素2(200單位/毫升)作為對照組。如圖I所示，NK細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、CD14、 ⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2的共同作用下，數(shù)量顯著增加。細(xì)胞數(shù)量的增加可以通過插入胸苷的方法來測定。胸苷插入之后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12小時，然后再開始測量細(xì)胞數(shù)量的變化。在K562 NK淋巴細(xì)胞=I I濃度的作用下NK細(xì)胞數(shù)量在7 天時進(jìn)入對數(shù)生長期，14天的時約增長了 2200倍。在加入滋養(yǎng)細(xì)胞后，NK細(xì)胞在50單位 /毫升的白介素2作用下即可開始增長。轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的 K562滋養(yǎng)細(xì)胞對于促進(jìn)NK細(xì)胞生長的作用明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染跨膜白介素2和CD137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞(14天時約強(qiáng)2. 4倍)。實(shí)施例2跨膜白介素21-⑶137復(fù)合物擴(kuò)增未經(jīng)純化的外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞不僅可以擴(kuò)增純化的NK細(xì)胞，還可以擴(kuò)增未經(jīng)過純化的淋巴細(xì)胞。健康捐獻(xiàn)人的PBMC培養(yǎng)在RPMI1640 中，輔以10%的人血清。在培養(yǎng)液中加入轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的 K562滋養(yǎng)細(xì)胞(輻照，IOOGy)和低劑量白介素2后共同培養(yǎng)7天。7天后離心，用等量的培養(yǎng)液重懸，加入經(jīng)過IOOGy輻照的滋養(yǎng)細(xì)胞，再培養(yǎng)7天，如圖2所示。轉(zhuǎn)染跨膜白介素21 和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞作為對照。NK細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和 ⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2的共同作用下，數(shù)量顯著增加。NK細(xì)胞數(shù)量在7 天時進(jìn)入對數(shù)生長期，14天的時約增長了 2100倍。轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86 和CD137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞對于促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞生長的作用明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染跨膜白介素2和CD137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞(14天時，2. I倍)。在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下，第14天時95%的淋巴細(xì)胞變成NK細(xì)胞(⑶56+，⑶16+，⑶56+/⑶16+)，如圖3所示。對照組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞作用下，外周血淋巴細(xì)胞有 91%細(xì)胞變成 NK 細(xì)胞(CD56+，CD16+，CD56+/CD16+)。實(shí)施例3擴(kuò)增后的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞和TAMs (腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)的裂解作用在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的裂解作用以前的研究表明給患腫瘤的小鼠注射白介素2能夠增強(qiáng)小鼠的抗腫瘤能力，延緩小鼠的壽命。本實(shí)施例采用轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法，來研究用擴(kuò)增的NK細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤的可行性。本實(shí)施例采用轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、 ⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的NK細(xì)胞注射小鼠體內(nèi)治療小鼠體內(nèi)腫瘤的方法，來研究擴(kuò)增的NK細(xì)胞抗腫瘤的效果。將健康捐獻(xiàn)者的淋巴細(xì)胞中分離出來后，加入轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、 ⑶86和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的NK細(xì)胞生長14天。 K562和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞被用來作為裂解的靶細(xì)胞。K562是B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系是血液腫瘤細(xì)胞系。IL-4，IL-10和IL-13處理后的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞被用來作為裂解的靶細(xì)胞。擴(kuò)增的NK細(xì)胞和靶細(xì)胞按照適當(dāng)?shù)谋壤餐囵B(yǎng)6小時后檢測存活的靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為對照組。轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞與對照組NK細(xì)胞對K562靶細(xì)胞的殺傷作用相當(dāng)，而對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的殺傷作用則顯著增強(qiáng)，P < O. 05，如圖5所示。體外用Lentivirus系統(tǒng)構(gòu)建Fluc報告基因穩(wěn)定表達(dá)的PC3細(xì)胞系。Fluc Lentivirus系統(tǒng)購自System Biosciences (美國，加州),具體構(gòu)建方法詳見產(chǎn)品介紹。 PC3-Fluc細(xì)胞靜脈注射進(jìn)嚴(yán)重免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)，21天后熒光檢測器檢測腫瘤的生長情況，隨機(jī)分組。擴(kuò)增后的NK細(xì)胞按照IxlO7細(xì)胞/每只小鼠自尾靜脈注射，一周兩次。連續(xù)治療四周后停止治療，觀察治療效果。圖6顯示治療14天后腫瘤報告基因的熒光信號。轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的生長有一定的抑制作用。轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞比對照組NK細(xì)胞PC3腫瘤細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)。圖7顯示，對照組的NK細(xì)胞對延長小鼠的存活率有一定的作用。而與對照組相比，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和 CD 137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞顯著提高了對腫瘤的治愈率，顯著延長了小鼠的存活率。這提示轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞可以用于臨床的腫瘤治療。在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一個可以用來制成藥物的方案，按照這個方案制成的藥物可以有下面所描述的多種用途。這個方案包括白介素2、白介素21、⑶14、⑶19、⑶86 和CD137。利用本方案擴(kuò)增的NK細(xì)胞適用于需要增強(qiáng)病人免疫力的各種情景。例如，擴(kuò)增 NK細(xì)胞對治療腫瘤特別有效，如急性髓細(xì)胞性白血病，慢性淋巴瘤白血病，前列腺腫瘤，惡性黑色素瘤和腎細(xì)胞惡性腫瘤，但不僅僅限于上述腫瘤。例如，擴(kuò)增NK細(xì)胞對治療細(xì)菌，真菌或寄生蟲內(nèi)感染特別有效。擴(kuò)增的NK細(xì)胞對治療病毒感染特別有效，如乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒但不僅僅限于上述病毒感染。擴(kuò)增的NK細(xì)胞可以顯著提高抗原的作用效果O本發(fā)明中轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、CD19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞可用來擴(kuò)增 NK細(xì)胞，也可以移植病人。體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞可移植病人。例如，跨膜白介素21、CD14、 ⑶19、⑶86、⑶137和低劑量白介素2擴(kuò)增激活NK細(xì)胞的方法比用僅轉(zhuǎn)染跨膜IL-21和 ⑶137的K562細(xì)胞激活擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，擴(kuò)增的效率高2. 4倍。兩個星期后，NK細(xì)胞的純度可以達(dá)到95%，細(xì)胞的數(shù)量可以達(dá)到I. OxIOici以上，滿足臨床治療的需求，如圖4所示。
權(quán)利要求
1.一種K562細(xì)胞擴(kuò)增激活NK細(xì)胞的方法，其特征在于包括下述步驟(1)以K562細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定表達(dá)CD8α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD 137的表達(dá)載體，⑶8 α為在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，⑶8 α基因連接白介素21基因后使得白介素21 表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白；而⑶14、⑶19、⑶86和⑶137為膜蛋白，載體中含有病毒啟動子和選擇標(biāo)記基因；(2)當(dāng)外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，激活啟動子，培養(yǎng)Κ562細(xì)胞一段時間，即可以得到在細(xì)胞膜上的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137多肽；(3)經(jīng)培養(yǎng)后的Κ562細(xì)胞膜上具有表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的細(xì)胞，通過強(qiáng)酸，強(qiáng)堿、和/或輻照、及通過高速離心收集Κ562細(xì)胞；或?qū)Ζ?62細(xì)胞的依次用硫酸銨或乙醇沉淀，強(qiáng)酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進(jìn)行純化收集；(4)將上述離心收集的Κ562細(xì)胞與NK細(xì)胞、或NK細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的組合、或是 NK細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的組合、或是外周血單核細(xì)胞和其它淋巴細(xì)胞的組合、或是白介素2和/ 或白介素21和/或⑶14和/或⑶19和/或⑶86和/或⑶137與白細(xì)胞的組合進(jìn)行共同培養(yǎng)、或在純化分離Κ562細(xì)胞后與PBMC共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增NK細(xì)胞，直至NK細(xì)胞代表總數(shù)的50%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(4)中的培養(yǎng)液為Eagle's培養(yǎng)液加入10%人血清或10%小牛血清，或RPMI 1640加入10%人血清或10%小牛血清，或 F-IO (Ham; s)Nutrient mixtures 加入 10%人血清或 10%小牛血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137 的劑量在50pM InM。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和 CD137 的劑量在 500pM 800pM。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和 ⑶137是經(jīng)過純化處理的蛋白質(zhì)，純化的淋巴細(xì)胞至少代表總數(shù)的50%。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86 和⑶137組成的淋巴細(xì)胞在K562細(xì)胞中的表達(dá)劑量比例是，K562細(xì)胞淋巴細(xì)胞=I 10 I。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的淋巴細(xì)胞中加入跨膜白介素 21-CD137復(fù)合物，且K562細(xì)胞淋巴細(xì)胞=I 1、2 1、3 I、或4 I。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和 ⑶137擴(kuò)增的NK細(xì)胞過程是通過溶于生理鹽水溶液的方法進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體是指使用跨膜IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞和低濃度白介素2共同作用定向擴(kuò)增激活自然殺傷細(xì)胞(NK)的方法。本發(fā)明是以K562細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定表達(dá)CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表達(dá)載體，CD8α為在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，CD8α基因連接白介素21基因后使得白介素21表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白；然后培養(yǎng)K562細(xì)胞一段時間，最后經(jīng)物理、化學(xué)方式得到純化的K562細(xì)胞，再對NK細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明擴(kuò)增激活的NK細(xì)胞可以提高病人的免疫力，抵抗病毒和細(xì)菌；而且效率高。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)上具有廣泛用途。
文檔編號C12N5/0783GK102586185SQ201210063090
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者吳忠福, 徐以兵, 董生聚 申請人:浙江中贏方舟生物工程股份有限公司