專利名稱：蛋白酶抑制劑BmSPI38及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蛋白酶抑制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
家蠶是一種具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)絲昆蟲。然而，家蠶易受各種病原微生物和其它外界因素影響，產(chǎn)生疾病。昆蟲致病性真菌，如綠僵菌、球孢白僵菌、黃曲霉菌和米曲霉菌，都可引發(fā)高傳染性蠶病。一旦這些致病性真菌在桑蠶區(qū)傳播開來，將對繭絲產(chǎn)量和質(zhì)量造成重大損失，甚至導(dǎo)致整個(gè)桑蠶行業(yè)的失敗。所以，采取有效措施控制家蠶真菌疾病非常重要。超微結(jié)構(gòu)和組織化學(xué)證據(jù)表明，昆蟲致病性真菌主要通過機(jī)械壓力和酶解雙重作用來穿透昆蟲體壁，進(jìn)而入侵昆蟲。其中，體壁降解蛋白酶在孢子萌發(fā)時(shí)分泌于昆蟲體壁， 參與宿主表皮穿透過程，是重要的毒力因子。例如，綠僵菌分泌的體壁降解蛋白酶Prl可以激活煙草天蛾的酚氧化酶系統(tǒng)，增加Prl基因拷貝數(shù)，從而顯著提高綠僵菌的毒力；球孢白僵菌分泌的體壁降解蛋白酶CDEP-I能夠加速孢子萌發(fā)和體壁穿透過程，從而顯著提高球孢白僵菌的毒力。蛋白酶抑制劑廣泛存在于各種生物中，它們通過結(jié)合蛋白酶或介導(dǎo)蛋白酶受體清除信號來消除不需要的蛋白水解過程。目前，在自然界中共發(fā)現(xiàn)了四種蛋白酶抑制劑抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑制木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等的巰基蛋白酶抑制劑，抑制膠原酶、氨肽酶等的金屬蛋白酶抑制劑和抑制胃蛋白酶、組織蛋白酶D等的羧基蛋白酶抑制劑。其中，絲氨酸蛋白酶抑制劑的種類最多。根據(jù)序列同源性、 半胱氨酸數(shù)目和分子中二硫鍵與作用位點(diǎn)之間的拓?fù)鋵W(xué)關(guān)系，絲氨酸蛋白酶抑制劑又分為 Kunitz、Kazal、Bowman-Birk、Serpin、TIL (trypsin inhibitor like cysteine rich domain)等幾個(gè)家族。目前，在家蠶的血液和絲腺等組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑主要以胰蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑為主。蛋白酶抑制劑在許多生理過程例如消化、凝血、纖溶、補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)、酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞遷移，激素或多肽釋放等過程中起著重要的調(diào)控作用，但其作用的具體機(jī)理目前尚不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，家蠶血液中的蛋白酶抑制劑在抵御微生物入侵過程中起著重要作用。例如，家蠶ClM品種的真菌蛋白酶抑制劑-F (FPI-F)可以抑制白僵菌孢子的萌發(fā)和萌芽管的生長，能夠強(qiáng)烈抑制枯草桿菌蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋白酶以及白僵菌分泌到培養(yǎng)基中的蛋白酶粗提物。因此，可以從家蠶蛋白酶抑制劑中尋找能夠有效對抗致病性真菌入侵的分子，以提高家蠶抗真菌能力。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于從家蠶蛋白酶抑制劑中尋找能夠?qū)怪虏⌒哉婢肭值姆肿?，闡明其對抗致病性真菌入侵的機(jī)理，并提供其制備方法以及在生物學(xué)方面的應(yīng)用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
1、蛋白酶抑制劑&I1SPI38，由SEQ ID No. 2中第23位至第80位氨基酸組成。進(jìn)一步，所述蛋白酶抑制劑&I1SPI38在N末端還有信號肽序列，所述信號肽序列由 SEQ ID No. 2中第1位至第22位氨基酸組成。2、編碼蛋白酶抑制劑&I1SPI38的基因。進(jìn)一步，由SEQ ID No. 1中第137位至第313位核苷酸組成。進(jìn)一步，所述基因在5’末端還有信號肽編碼序列，由SEQ ID No. 1中第71位至第 136位核苷酸組成。進(jìn)一步，所述基因cDNA全長序列由SEQ ID No. 1中第1位至第388位核苷酸組成。3、含有上述基因的重組表達(dá)載體。進(jìn)一步，所述重組表達(dá)載體以p^質(zhì)粒作為基礎(chǔ)載體，所述P^質(zhì)粒由pET28a質(zhì)粒刪減部分多克隆位點(diǎn)后獲得，刪減后的多克隆位點(diǎn)序列如SEQ ID No. 10所示。4、含有上述重組表達(dá)載體的工程菌。進(jìn)一步，所述工程菌以大腸桿菌Origami 2 (DE!3)菌株為宿主菌。5、蛋白酶抑制劑&I1SPI38的制備方法，包括以下步驟將由SEQ ID No. 1中第 137位至第313位核苷酸組成的基因克隆入P^質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)載體 BmSPI38-p^，再將重組表達(dá)載體BmSPI38-p^轉(zhuǎn)入大腸桿菌Origami 2 (DE3)菌株，獲得工程菌anSPI38-p^-0rigami 2 (DE3)，再用終濃度為0. 2mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷于16°C誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，超聲破碎，離心，收集上清，用Ni2+-NTA 親和層析純化，即制得蛋白酶抑制劑&I1SPI38 ；所述p^質(zhì)粒由pET28a質(zhì)粒刪減部分多克隆位點(diǎn)后獲得，刪減后的多克隆位點(diǎn)序列如SEQ ID No. 10所示。6、蛋白酶抑制劑&I1SPI38及其基因在制備枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶。7、蛋白酶抑制劑&I1SPI38及其基因在制備球孢白僵菌體壁降解蛋白酶⑶EP-I誘導(dǎo)的殺蟲性黑化反應(yīng)阻斷劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述⑶EP-I誘導(dǎo)的殺蟲性黑化反應(yīng)為⑶EP-I誘導(dǎo)的家蠶黑化反應(yīng)。8、編碼蛋白酶抑制劑&I1SPI38的基因在培育具有致病真菌抗性的家蠶品系中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明克隆和表達(dá)了一個(gè)家蠶的TIL類蛋白酶抑制劑 &I1SPI38，研究結(jié)果顯示，BmSPI38對溫度和pH非常穩(wěn)定，不僅能夠強(qiáng)烈抑制枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，而且能夠阻斷球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I誘導(dǎo)的家蠶的過度、有害黑化，可以用于制備枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶抑制劑，也可以用于制備球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I誘導(dǎo)的殺蟲性黑化反應(yīng)的阻斷劑，還可以用于具有致病真菌抗性的家蠶品系的培育，有助于提高家蠶抗致病性真菌入侵的能力。此外，本發(fā)明的&I1SPI38原核表達(dá)方法操作簡單，表達(dá)量高。


圖1為&I1SPI38 cDNA全長序列及其編碼的氨基酸序列，其中單下劃線部分為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)，雙下劃線部分為可能的多腺苷酸化信號(ATTAAA)，灰色背景部分為信號肽序列，斜體加粗部分為&I1SPI38反應(yīng)位點(diǎn)中推定的Pl - ΡΓ殘基。圖2為&I1SPI38與TIL家族其它成員的序列比對，其中保守和非保守的半胱氨酸殘基分別用大寫的“C”和小寫的“C”標(biāo)出，箭頭所示為Pl-ΡΓ反應(yīng)位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)。圖3為&I1SPI38的原核表達(dá)及1Tricine SDS - PAGE檢測，其中泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1和2分別為非誘導(dǎo)的anSPI38-p^-0rigami 2 (DE3)菌體沉淀和上清，泳道3和4分別為16°C誘導(dǎo)20小時(shí)后的anSPI38-p^-0rigami 2 (DE3)菌體沉淀和上清，泳道5和6分別為37°C誘導(dǎo)5小時(shí)后的anSPI38-p^-0rigami 2 (DE3)菌體沉淀和上清，箭頭所示為重組&I1SPI38的二聚體。圖4為重組&I1SPI38的二聚體和三聚體的純化。圖5為重組&I1SPI38的二聚體和三聚體對枯草桿菌蛋白酶的抑制劑活性染色。圖6為重組&I1SPI38對地衣芽孢桿菌分泌的枯草桿菌蛋白酶的抑制劑活性染色， 其中泳道1和2分別為非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的anSPI38-p^-0rigami 2 (DE3)上清。圖7為重組&I1SPI38對林伯氏白色念球菌分泌的蛋白酶K的抑制劑活性染色，其中泳道1為五齡幼蟲血液(陽性對照)，泳道2和泳道3分別為非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的 BmSPI38-p28-0rigami 2 (DE3)上清，泳道 4 為純化的重組 BmSPI38。圖8為重組&I1SPI38對不同蛋白酶的抑制活性比較，其中“ + ”或“一”表示加或不加重組BmSP138, “#”和“*，，表示與對照(不加重組BmSP138)相比ρ<0· 001和ρ<0· 01，誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3 )。圖9為重組&I1SPI38對枯草桿菌蛋白酶的抑制化學(xué)計(jì)量比，其中線性回歸外延的虛線部分與X-軸交于摩爾比7. 99處，誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(η=3)。圖10為溫度對重組&I1SPI38抑制活性的影響。圖11為ρΗ對重組&I1SPI38抑制活性的影響。圖12為重組&I1SPI38對球孢白僵菌體壁降解蛋白酶⑶EP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶的抑制活性，其中“ + ”或“一”表示加或不加重組&I1SPI38，“**”表示與對照(不加重組 BmSP138)相比ρ<0. 001，誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(η=3)。圖13為表面等離子共振(SPR)分析球孢白僵菌體壁降解蛋白酶⑶EP-I對重組 BmSP138的親和力。圖14為表面等離子共振數(shù)據(jù)的穩(wěn)態(tài)親和分析。圖15為球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CEDP-I誘導(dǎo)的家蠶黑化及重組&iiSPI38對黑化的阻斷。圖16為注射球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CEDP-I或CEDP-I與重組&iiSPI38的混合物后家蠶血液的變化。圖17為注射球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CEDP-I或CEDP-1與重組&iiSPI38的混合物后家蠶體壁的變化。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中使用的家蠶品種為大造，由中國西南大學(xué)家蠶基因資源庫提供。所述家蠶用桑葉或人工飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度25°C，相對濕度為75% 士 5%，光周期為12小時(shí)光照+12小時(shí)黑暗。收集五齡第三天中部絲腺和化蛹第7天的家蠶樣品，用液氮冷凍后， 置-80°C保存，用于提取RNA。-,BmSP138 cDNA的克隆和序列分析
用 TRIzol 試劑 anvitrogen)提取蛹第 7 天的總 RNA。用 GeneRacerTM Kit (Invitrogen)進(jìn)行3’ -和5’ -RACE PCR,按照試劑盒說明書操作。根據(jù)已知的&I1SPI38 EST序列，設(shè)計(jì)并合成3，-和5，-RACE的基因特異性引物(GSPs)如下反向 GSP :5，-gacgcaagcggtgttagtcaggtac-3，(SEQ ID No. 4)；反向巢式 GSP 5‘-gggcattttcagggcatccatattcg-3‘ (SEQ ID No. 5);正向 GSP 5‘-cactaccgaatatggatg-ccctgaa-3' (SEQ ID No. 6)；正向巢式 GSP -cgtacctgactaacaccgcttgcgt-3' (SEQ ID No. 7)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒(Watson)純化目的片段，再克隆入 pEASY-Tl Simple 質(zhì)粒(TransGen)，測序。克隆片段的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列見圖1，可見&I1SPI38 cDNA序列全長388nt (SEQ ID No. 1第廣388位核苷酸)，開放閱讀框(ORF)長M3nt (SEQ ID No. 1第 7廣313位核苷酸)，共編碼長80個(gè)氨基酸的BmSPI38 (SEQ ID No. 2第廣80位氨基酸)，其中包含一個(gè)由22個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽(SEQ ID No. 2第廣22位氨基酸)，預(yù)測編碼蛋白的分子量為8765. ODa，等電點(diǎn)為4. 37，含有8個(gè)半胱氨酸(Cys)，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑中的TIL家族。利用BLAST 程序?qū)?BmSPI38 與 TIL 家族的其它成員(BSTI、Prlnh6, Ixodidin、 AMCI、SI-7、VWF、AsC/E-l、ATI、FPI-F)進(jìn)行序列比對。結(jié)果見圖2，與TIL類蛋白酶抑制劑多含有10個(gè)半胱氨酸，共形成5對二硫鍵(1-7、2-6、3-5、4-10和8_9)不同，&iiSPI38有兩個(gè)Cys發(fā)生了替換；而且，基于以前對TIL類蛋白酶抑制劑反應(yīng)位點(diǎn)Pl殘基的研究(Bania et al. , 1999; Pham et al.，1996)，預(yù)測BmSPI38 反應(yīng)位點(diǎn)的 Pl - Pl，殘基為 Gly 和 Ala， 這也與TIL家族的其它成員不同。根據(jù)上述保守的半胱氨酸數(shù)目和獨(dú)特的反應(yīng)位點(diǎn)，推測本發(fā)明所得&I1SPI38為TIL家族的新成員。二、anSP138的原核表達(dá)和純化
對去除信號肽序列的&I1SPI38基因編碼區(qū)(SEQ ID No. 1中第137 313位核苷酸)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。引物序列如下正向引物5，-cgc￡^igaccgaatatggatgccctg-3，(SEQ ID No. 8)，下劃線部分為 Nde I 酶切位點(diǎn)；反向引物5，-attt￡cggccgctcagcaatcagaaatgg-3 ，(SEQ ID No. 9)，下劃線部分為Not I酶切位點(diǎn)。以家蠶品種大造五齡第三天中部絲腺的 cDNA為模板，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4分鐘；然后94°C變性40秒，62°C退火30秒，72°C 延伸45秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒(Watson)純化目的片段，用限制性內(nèi)切酶Nde I和Not I進(jìn)行雙酶切，再與經(jīng)同樣雙酶切的P^質(zhì)粒在jM DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒&iiSPI38-p^。 P28質(zhì)粒由中國科技大學(xué)的周叢照將pET28a質(zhì)粒刪減部分多克隆位點(diǎn)后獲得，刪減后的多克隆位點(diǎn)序列為5' -CatRRRacaccatcaccatcaccatatRRccaaaaaRRccRCRRCCRCRRCCtttttRR ccatatggtgatggtgatggtgtcc-3‘ (SEQ ID No. 10，下劃線部分分別為 Nde I 和 Not I 酶切位點(diǎn))。此外，？觀質(zhì)粒帶有N-6His標(biāo)簽，從而使表達(dá)的重組&I1SPI38 (氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示)在N末端帶有融合標(biāo)簽序列MGHHHHHHM。將重組質(zhì)粒&iiSPI38-p^轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Origami 2 (DE3)菌株 anvitrogen)，獲得工程菌 BmSPI38-p^_0rigami 2(DE3)，用終濃度為0. 2mM的異丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，用結(jié)合緩沖液(20mM Tris-Cl, 500mM NaCl, pH 8. 0)重懸，超聲破碎，離心，分別收集菌體沉淀和上清，用16. 5% Tricine-SDS-PAGE (Schagger, 2006)進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖 3，用IPTG于16°C誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)，BmSPI38-p28-0rigami 2 (DE3)菌株可以高量表達(dá)重組BmSPI38。
之后利用兩次梯度Ni2+-NTA親和層析(Merck)對重組&iiSPI38進(jìn)行純化，結(jié)果見圖4，純化獲得了重組&I1SPI38的二聚體和三聚體。后續(xù)活性試驗(yàn)中未特別指明是單體、二聚體或三聚體的重組&I1SPI38都指的是純化獲得的包括重組&I1SPI38單體、二聚體和三聚體的總蛋白。采用Bradford Assay試劑盒(Tiangen)進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。
三、BmSP138對不同蛋白酶的抑制劑活性1、抑制劑活性染色檢測&HSPI38對不同蛋白酶的抑制劑活性采用toiel and Berges報(bào)道的方法對重組&iiSPI38進(jìn)行抑制劑活性染色。染色原理為底物被蛋白酶水解后生成的產(chǎn)物能被染色液染成紅色，而蛋白酶被抑制劑抑制后不具有水解活性，則無抑制劑的區(qū)域被染成紅色，而有抑制劑的區(qū)域不會(huì)被染色而出現(xiàn)白色條帶。染色方法為樣品經(jīng)10%的堿性Native-PAGE分離后，將電泳完畢的凝膠置于0. 07% 的蛋白酶液(0. 1 M Tris-Cl, IOmM CaCl2, pH7. 5，0. 07% 的蛋白酶)中，37°C孵育 15 分鐘，之后除去蛋白酶液，用單蒸水洗膠兩次，室溫靜置15分鐘，再將凝膠置于底物(20mg N-乙酰-D，L-苯丙氨酸-β-萘酯溶于IOml N，N’ - 二甲基甲酰胺)和染色液(IOOmg固藍(lán)B鹽溶于100ml 0.1Μ磷酸鹽溶液，pH 8. 0)的混合液(體積比1 10)中，37 °C孵育20 分鐘，之后除去底物與染色液的混合液，用單蒸水洗膠，終止反應(yīng)。結(jié)果見圖5 7，誘導(dǎo)的 BmSP138-p28-0rigarni 2 (DE3)上清、重組BmSPI38以及重組BmSPI38的二聚體和三聚體對來自地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶以及來自林伯氏白色念球菌的蛋白酶K均有強(qiáng)烈的抑制活性。
,BmSP138對不同蛋白酶的抑制活性比較通過將蛋白酶與重組&I1SPI38孵育，再測定蛋白酶的剩余水解活性來評估重組 BmSPI38的抑制劑活性將IOOng蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K或木瓜蛋白酶)與500ng重組BmSPI38溶于100μ 1 Fluoro Assay緩沖液(IOOmM Tris-HCl, pH 8.0，20 mM CaCl2)中，37°C孵育 30 分鐘，再加入 100 μ 1 溶于Fluoro Assay 緩沖液的FITC標(biāo)記的酪蛋白，37°C避光孵育1小時(shí)，測定熒光強(qiáng)度(485nm激發(fā)，535nm發(fā)射)，計(jì)算剩余酶活。結(jié)果見圖8，重組&I1SPI38可以強(qiáng)烈地抑制枯草桿菌蛋白酶和蛋白酶K 的活性，但對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶無抑制活性，對木瓜蛋白酶有較弱的抑制活性。
、BmSPI38對枯草桿菌蛋白酶的抑制化學(xué)計(jì)量比測定將不同摩爾比的重組&HSPI38與枯草桿菌蛋白酶孵育后，測定剩余酶活。結(jié)果見圖9， 可見隨著重組&I1SPI38濃度的增加，枯草桿菌蛋白酶的活性線性降低；當(dāng)重組&I1SPI38與枯草桿菌蛋白酶的摩爾比為6. 4時(shí)，枯草桿菌蛋白酶約喪失80%的活性；重組&I1SPI38與枯草桿菌蛋白酶的化學(xué)計(jì)量比為7. 99，表明重組&I1SPI38與枯草桿菌蛋白酶結(jié)合時(shí)可能形成多聚體。
四、&I1SPI38的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性將重組&I1SPI38分別在溫度37、40、50、60、70、80、90、99°C處理15分鐘后，與枯草桿菌蛋白酶孵育，測定剩余酶活。結(jié)果見圖10，可見重組&I1SPI38對熱相當(dāng)穩(wěn)定，隨著處理溫度升高，其蛋白酶抑制劑活性緩慢增強(qiáng)。
將重組BmSPI38 分別用 pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、11. 8 的 Britton-Robinson 緩沖液于室溫下處理對小時(shí)后，與枯草桿菌蛋白酶孵育，測定剩余酶活。結(jié)果見圖11，可見重組&I1SPI38在pH 2 11. 8范圍內(nèi)均相當(dāng)穩(wěn)定，在pH 11. 8時(shí)仍能保持86%的抑制劑活性。
五、BmSPI38對真菌蛋白酶的抑制劑活性l>BmSPI38對球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶的抑制劑活性將重組&I1SPI38分別與球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶孵育后， 測定剩余酶活。結(jié)果見圖12，可見重組&I1SPI38能夠強(qiáng)烈抑制球孢白僵菌體壁降解蛋白酶 CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，說明&I1SPI38通過抑制病原真菌的體壁降解蛋白酶，從而抑制其穿透家蠶體壁和獲取營養(yǎng)物質(zhì)。
、BmSPI38與球孢白僵菌體壁降解蛋白酶⑶EP-I的相互作用分析采用Biacore 3000生物分子相互作用分析儀，基于SI3R技術(shù)研究^iiSP138與球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I的相互作用。SI3R中所有的溶液在使用前都用孔徑為0.22 μ m 的微孔濾膜過濾和除氣，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在溫度25°C條件下進(jìn)行。利用氨基偶聯(lián)試劑盒將重組 BmSPI38偶聯(lián)于CM5傳感芯片的Fc_4通道，偶聯(lián)量約為120RU，F(xiàn)c-3通道作為對照。將 90μ 1用HBS-EP緩沖液稀釋的不同濃度(0、2、4、8、16、32ηΜ)的CDEP-I溶液以流速30 μ 1/ min流經(jīng)串聯(lián)的Fc-3和Fc-4通道。每個(gè)循環(huán)后，用15 μ 1甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 2.5) 重生傳感芯片。利用BIAevaluation軟件對所有Fc_4減Fc_3后傳感信號進(jìn)行評估。通過穩(wěn)態(tài)親和模型(設(shè)置Req vs. Conc等于4)對傳感圖進(jìn)行擬合，獲得解離平衡常數(shù)KD。結(jié)果見圖13 14，與抑制劑活性測定結(jié)果一致，重組&I1SPI38能夠與球孢白僵菌體壁降解蛋白酶 CDEP-I結(jié)合；通過穩(wěn)態(tài)親和模式擬合，測得解離平衡常數(shù)KD=2. 01 X IOl說明重組&I1SPI38 和球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I之間存在高親和力。
六、&I1SPI38對球孢白僵菌體壁降解蛋白酶⑶EP-I誘導(dǎo)的黑化反應(yīng)的抑制黑化反應(yīng)是昆蟲用于抵御創(chuàng)傷和感染的重要的免疫反應(yīng)，其取決于氧化還原酶類和酚氧化酶的活性。但是，由于活性半醌類和其他有毒副產(chǎn)物的過量產(chǎn)生對昆蟲有害，所以酚氧化酶是受到嚴(yán)格控制的。給蠶蛹分別注射10 μ 1用0. 9% NaCl溶液溶解的2. 5 μ g⑶EP-I、 0. 5 μ g CDEP-1、0. 5 μ g BSA 以及 0. 5 μ g CDEP-1 與 2. 5 μ g 重組 BmSPI38 的混合物。注射后第20小時(shí)，從蛹腹部節(jié)間膜收集血液，并解剖蛹皮進(jìn)行觀察。結(jié)果見圖15 17，可見注射 2. 5 μ g和0. 5 μ g⑶EP-I的蠶蛹在20小時(shí)后發(fā)生黑化，其血液也發(fā)生黑化，黑化的蠶蛹表皮中出現(xiàn)黑色包囊，而注射0. 5 μ g⑶EP-I與2. 5 μ g重組&I1SPI38的混合物的蠶蛹在20 小時(shí)后未出現(xiàn)黑化，說明球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I可以激活家蠶的黑化反應(yīng)，而 BmSPI38能夠阻斷⑶EP-I誘導(dǎo)的過度的有害黑化。
綜合上述研究結(jié)果，(1)&IISPI38能夠強(qiáng)烈抑制枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，而枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶都屬于枯草桿菌蛋白酶家族(subtilase family),因此，推測BmSPI38可以用于制備枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶抑制劑；(2) &iiSPI38 能夠阻斷球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I誘導(dǎo)的家蠶的過度、有害黑化，而家蠶是鱗翅目昆蟲的典型代表和理想的生物學(xué)模型，因此，推測&I1SPI38可以用于制備球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I誘導(dǎo)的殺蟲性黑化反應(yīng)的阻斷劑；(3) BmSPI38不僅可以強(qiáng)烈抑制球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I的水解活性，而且可以阻斷CDEP-I誘導(dǎo)的家蠶過度、有害的黑化反應(yīng)，有助于提高家蠶抵抗致病性真菌入侵的能力，可以用于具有致病真菌抗性的家蠶品系的培育，例如，利用昆蟲轉(zhuǎn)基因載體如PiggyBac轉(zhuǎn)座子等，將&I1SPI38外源基因轉(zhuǎn)入家蠶中進(jìn)行超量表達(dá)，即可能獲得具有致病真菌抗性的家蠶品系。
此外，鑒于&I1SPI38對蛋白酶K、球孢白僵菌體壁降解蛋白酶⑶EP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶具有強(qiáng)烈的抑制劑活性，而類枯草桿菌蛋白酶之間具有較高的序列相似性，如球孢白僵菌體壁降解蛋白酶⑶EP-I (GenBank ID: AAK70804. 1)與食線蟲真菌刀孢輪枝菌的堿性絲氨酸蛋白酶verll2 (GenBank ID: Q68GV9)的序列一致性為79. 3%，與林伯氏白色念球菌的蛋白酶K(GenBank ID: P06873)的序列一致性為62. 4%，與綠僵菌的體壁降解蛋白酶I^rl (GenBank ID: P29138)的序列一致性為64. 9%，與球孢菌屬的類枯草桿菌蛋白酶(GenBank ID: C5PCX1)的序列一致性為45. 2%，與地衣芽孢桿菌的角蛋白溶解蛋白酶KerA (GenBank ID: AAG10033)的序列一致性為30. 3%,BmSPI38可能在生物防治中應(yīng)用于昆蟲病原微生物的改良，也有助于控制傳播人類和動(dòng)物疾病的媒介昆蟲。
粗球孢子菌是球孢子菌病的致病因子，可以感染人類和各種動(dòng)物，引起全身性真菌病。粗球孢子菌在菌絲形成過程中會(huì)分泌蛋白酶到胞外環(huán)境中，其中分泌的類枯草桿菌蛋白酶具有角蛋白水解活性，有助于增強(qiáng)球孢子菌屬的致病性。鑒于&I1SPI38對來自地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶和林伯氏白色念球菌的蛋白酶K具有強(qiáng)烈的抑制劑活性，而枯草桿菌蛋白酶類之間相似性很高，說明&I1SPI38也可能有助于人類真菌病的治療。
最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.蛋白酶抑制劑&I1SPI38，由SEQID No. 2中第23位至第80位氨基酸組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶抑制劑&I1SPI38，其特征在于，在N末端還有信號肽序列，所述信號肽序列由SEQ ID No. 2中第1位至第22位氨基酸組成。
3.編碼權(quán)利要求1所述的蛋白酶抑制劑&I1SPI38的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，由SEQID No. 1中第137位至第313位核苷酸組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于，在5’末端還有信號肽編碼序列，由SEQID No. 1中第71位至第136位核苷酸組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于，其cDNA全長序列由SEQID No. 1中第1 位至第388位核苷酸組成。
7.含有權(quán)利要求3至6任一項(xiàng)所述基因的重組表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，以P^質(zhì)粒作為基礎(chǔ)載體，所述 P^質(zhì)粒由pET28a質(zhì)粒刪減部分多克隆位點(diǎn)后獲得，刪減后的多克隆位點(diǎn)序列如SEQ ID No. 10所示。
9.含有權(quán)利要求7或8所述重組表達(dá)載體的工程菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的工程菌，其特征在于，以大腸桿菌Origami2(DE!3)菌株為宿主菌。
11.權(quán)利要求1所述蛋白酶抑制劑&I1SPI38的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 將由SEQ ID No. 1中第137位至第313位核苷酸組成的基因克隆入M8質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)， 獲得重組表達(dá)載體anSPI38-p^，再將重組表達(dá)載體anSPI38-p^轉(zhuǎn)入大腸桿菌Origami 2 (DE3)菌株，獲得工程菌BmSPI38-p^-0rigami 2 (DE3)，再用終濃度為0. 2mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于16°C誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，超聲破碎， 離心，收集上清，用Ni2+-NTA親和層析純化，即制得蛋白酶抑制劑&I1SPI38 ；所述口8質(zhì)粒由 pET28a質(zhì)粒刪減部分多克隆位點(diǎn)后獲得，刪減后的多克隆位點(diǎn)序列如SEQ ID No. 10所示。
12.權(quán)利要求1所述的蛋白酶抑制劑&I1SPI38和權(quán)利要求3所述的基因在制備枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I和蜂蜜曲霉蛋白酶。
14.權(quán)利要求1所述的蛋白酶抑制劑&I1SPI38和權(quán)利要求3所述的基因在制備球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-I誘導(dǎo)的殺蟲性黑化反應(yīng)阻斷劑中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于，所述CDEP-I誘導(dǎo)的殺蟲性黑化反應(yīng)為 ⑶EP-I誘導(dǎo)的家蠶黑化反應(yīng)。
16.權(quán)利要求3所述的基因在培育具有致病真菌抗性的家蠶品系中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)蛋白酶抑制劑BmSPI38，由SEQIDNo.2中第23位至第80位氨基酸組成，BmSPI38對溫度和pH非常穩(wěn)定，不僅能夠強(qiáng)烈抑制枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-1和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，并且能夠阻斷CDEP-1誘導(dǎo)的家蠶的過度、有害黑化，可用于制備枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶抑制劑，也可用于制備CDEP-1誘導(dǎo)的殺蟲性黑化反應(yīng)的阻斷劑，還可用于培育具有致病真菌抗性的家蠶品系，提高家蠶抵抗致病性真菌入侵的能力；此外，本發(fā)明的BmSPI38原核表達(dá)方法操作簡單，表達(dá)量高。
文檔編號C12N15/15GK102532305SQ20121006327
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者向仲懷, 夏慶友, 李游山, 趙萍 申請人:西南大學(xué)