專利名稱：一種高效shRNA分子在抗WSSV中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于RNAi抗病毒領(lǐng)域，特別涉及一種高效ShRNA分子在抗WSSV中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對(duì)蝦是熱帶亞熱帶淺海最占優(yōu)勢的甲殼動(dòng)物，具有種類多，種群數(shù)量大，繁殖力強(qiáng)，生長迅速，肉味鮮美等特點(diǎn)。自從上世紀(jì)70年代末開始，對(duì)蝦養(yǎng)殖迅速發(fā)展成為ー個(gè)支柱產(chǎn)業(yè)，不僅解決了成千上萬人的勞動(dòng)就業(yè)問題，而且給財(cái)政帶來了成百上千億美金的收入和給百姓帶來了高質(zhì)量的食品。但是，隨著集約化養(yǎng)殖技術(shù)的不斷提高和養(yǎng)殖面積的不斷擴(kuò)大，對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷上升，其病害問題也日益嚴(yán)重。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的養(yǎng)殖對(duì)蝦疾病有30多種，在過去幾年中，對(duì)蝦疾病造成的損失高達(dá)上億美元。弓I起對(duì)蝦疾病的病原主要有病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲，其中對(duì)蝦病毒性疾病是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)面臨的最嚴(yán)重的問 題。作為對(duì)蟲下白斑癥(white spot disease,WSD)的病原,對(duì)蟲下白斑綜合征病毒(white spotsyndrome virus,WSSV)以其對(duì)宿主的泛嗜性、高致病性以及高致死率而位居對(duì)蝦病毒病之首。對(duì)蝦一般在感染W(wǎng)SSV48h后即可出現(xiàn)典型癥狀——紅體和甲殼白斑，3 10 d內(nèi)死亡率可高達(dá)100%。因此，自從1993年該病首次暴發(fā)以來，幾乎毎年均給我國對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，塘ロ絕收現(xiàn)象常有發(fā)生。與其他無脊椎動(dòng)物一祥，對(duì)蝦特異性免疫機(jī)制的缺乏大大增加了對(duì)其病毒防治的難度。由于疾病頻發(fā)和專用防治藥物的匱乏，導(dǎo)致各種消毒、防治藥物的濫用；養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)遭到持續(xù)破壞，海洋生態(tài)平衡和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重威脅。可以說，在某種程度上對(duì)蝦病害的有效控制決定了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。到目前為止，雖然在研究人員的努力下蝦類免疫與防治已經(jīng)有了相當(dāng)大的進(jìn)展，但仍然停留在非特異增強(qiáng)機(jī)體抗病能力方面，因此在遇到WSSV這樣發(fā)病迅即、病死率高的病原感染時(shí)，往往難以勝任，因而，尋求高效特異的WSSV防治方法仍然是病毒研究的重中之重。RNA干擾(RNAinterference, RNAi)是在真核細(xì)胞中由雙鏈RNA (dsRNA)誘導(dǎo)的特異性RNA降解過程，在細(xì)胞水平和動(dòng)植物體內(nèi)均表現(xiàn)出高效特異的抗病毒能力。近幾年的相關(guān)研究證明，RNAi在水生無脊椎動(dòng)物體內(nèi)也能激發(fā)高效的抗病毒效應(yīng)。由于WSSV基因組序列已經(jīng)明確，因此，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抗WSSV、研究抗病毒專用制劑是完全可能的。我國的水產(chǎn)研究專家黃佳、何建國、章曉波等團(tuán)隊(duì)均實(shí)施了 RNAi技術(shù)抗WSSV的研究，并取得了很好的抗病毒效果。我們也在近幾年進(jìn)行了相關(guān)研究，并研究獲得自行設(shè)計(jì)的高效RNA干擾分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效shRNA分子在抗WSSV中的應(yīng)用，該shRNA分子可顯著抑制WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的増殖，大幅降低WSSV感染蝦的累積死亡率，有效降低WSSV對(duì)對(duì)蝦組織的損傷，抗WSSV效率高、副作用小。
本發(fā)明的一種高效shRNA分子在抗WSSV中的應(yīng)用，包括將體重7 9g、PCR檢測陰性的健康南美白對(duì)蝦在室內(nèi)池塘?xí)吼B(yǎng)I周后，用胰島素注射器于南美白對(duì)蝦第四腹節(jié)的ー側(cè)肌肉注射50 y L/只shRNA分子，4h后于第四腹節(jié)的對(duì)側(cè)肌肉注射50 u L/只WSSV感染液，在水溫27 28°C、每天換水l/2、24h持續(xù)充氣的條件下養(yǎng)殖，WSSV感染4天后檢測得南美白對(duì)蝦體內(nèi)WSSV的增殖被shRNA抑制。
所述shRNA分子shWR的序列為5，-GGACCAACAAACCCAAGAAUUGAAGAAGUUCUUGGGUUUGUUGGUCCUU-3，。所述shWR的制備方法包括(I)選取WSSV早期復(fù)制相關(guān)酶的編碼序列；(2)利用軟件生成抗WSSV的小RNA干擾分子；(3)按照已公布的小RNA序列設(shè)計(jì)規(guī)則，選擇一個(gè)理論上高效的小RNA分子(siRNA)；(3)把該siRNA構(gòu)建成shRNA分子，記為shWR。所述步驟(I)中的WSSV早期復(fù)制相關(guān)酶為核糖核酸還原酶。有益.效果本發(fā)明的shRNA分子可顯著抑制WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的増殖，大幅降低WSSV感染蝦的累積死亡率，有效降低WSSV對(duì)對(duì)蝦組織的損傷，抗WSSV效率高、副作用?。谎芯拷Y(jié)果表明，本發(fā)明的ShRNA分子具有高效性和病毒特異性，可有效彌補(bǔ)對(duì)蝦特異免疫機(jī)制的缺陷，因此，可作為抗WSSV藥物研制的新的候選制劑。


圖I是shRNA分子(shWR和HK)降低南美白對(duì)蝦死亡率的效果對(duì)比圖；圖示為WSSV感染7天后的各組對(duì)蝦累積死亡率；圖2是shRNA分子(shWI^PHK)抑制南美白對(duì)蝦體內(nèi)WSSV增殖的效果對(duì)比圖；圖中顯示的是WSSV感染4天后對(duì)蝦體內(nèi)的WSSV感染量(相對(duì)于同期陽性對(duì)照體內(nèi)病毒感染量的相對(duì)定量)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例IshRNA分子shWR抗WSSV試驗(yàn)(RNA干擾試驗(yàn))體重7 9g、PCR檢測陰性的健康凡納濱對(duì)蝦在室內(nèi)池塘?xí)吼B(yǎng)I周后，隨機(jī)分成2個(gè)shRNA干擾組(shWR和HK)、I個(gè)陽性對(duì)照組(WSSV)和I個(gè)陰性對(duì)照組(Negative)，每組15只對(duì)蝦，分別暫養(yǎng)于90L的白色玻纖桶中。用胰島素注射器分別于干擾組凡納濱對(duì)蝦第四腹節(jié)的ー側(cè)肌肉注射50 u L/只shRNA (25 ug),4h后于對(duì)側(cè)肌肉注射50 u L/只WSSV感染液；與此同時(shí)，陽性對(duì)照組分別注射50 u L/只0. 01mol/L PBS (pH 74)和50 u L/只WSSV感染液，而陰性對(duì)照組2次均注射50 u L/只0. 01mol/L PBS (pH 74)。對(duì)蝦養(yǎng)殖水溫控制在27 28 °C，每天換水1/2，24h持續(xù)充氣。實(shí)施例2shRNA分子(shWR)降低對(duì)蟲下死亡率實(shí)驗(yàn)按實(shí)施例I的方法實(shí)施RNAi實(shí)驗(yàn)。每天觀察4次，及時(shí)撿出死亡和瀕死對(duì)蝦，記錄死亡數(shù)，并且以WSSV特異PCR引物檢測死亡對(duì)蝦，持續(xù)觀察7d。實(shí)施例3shRNA分子(shWR)抑制南美白對(duì)蝦體內(nèi)WSSV增殖實(shí)驗(yàn)按實(shí)施例I的方法實(shí)施RNAi實(shí)驗(yàn)。WSSV感染4天后，所有對(duì)蝦均剪取背部肌 肉，用組織基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)抽提總DNA，然后根據(jù)寶生物SYBR PremixEx Taq (real time)試劑盒的說明定量上述目的基因和看家基因的特異片段。相對(duì)定量檢測條件為 95°C預(yù)變性 30s ;95°C 5s, 57°C 20s, 72°C 17s，循環(huán) 45 次(ABI StepOnePlusInstrument)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后檢測。用于定量PCR的引物分另Ij為PI、P2和P3、P4。 其中，Pl :5' -TGTGACCAAGACCATCGAA-3'和 P2 :5' -CCACACCTTGAATGTTCCC-3'特異基因片段；P3:5' -GATCGAGTGGAGGGCAAGT-3 '和 P4:5' -ACGACCATTCGGGCTGTA-3 '用于擴(kuò)增看家基因，作為上樣參照。實(shí)施例4shRNA分子(shWR)保護(hù)對(duì)蝦組織的實(shí)驗(yàn)WSSV感染4天后，隨機(jī)收集對(duì)照組、shWR干擾組對(duì)蝦，分別采集肝胰腺、肌肉和鰓組織，浸入10 %甲醛溶液保存。然后石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色，制作石蠟超薄切片，光鏡觀察shRNA分子抗WSSV的效果。
權(quán)利要求
1.一種高效shRNA分子在抗WSSV中的應(yīng)用，包括 將體重7 9g、PCR檢測陰性的健康南美白對(duì)蝦在室內(nèi)池塘?xí)吼B(yǎng)I周后，用胰島素注射器于南美白對(duì)蝦第四腹節(jié)的ー側(cè)肌肉注射50 u L/只shRNA分子，4h后于第四腹節(jié)的對(duì)側(cè)肌肉注射50 u L/只WSSV感染液，在水溫27 28°C、每天換水l/2、24h持續(xù)充氣的條件下養(yǎng)殖，WSSV感染4天后檢測顯示，南美白對(duì)蝦體內(nèi)WSSV的增殖被shRNA抑制。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效shRNA分子在抗WSSV中的應(yīng)用，其特征在于所述shRNA分子shWR的序列為5，-GGACCAACAAACCCAAGAAUUGAAGAA⑶UCUUGG⑶UU⑶UG⑶CCUU-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種高效shRNA分子在抗WSSV中的應(yīng)用，其特征在于所述shWR的制備方法包括 (1)選取WSSV早期復(fù)制相關(guān)酶的編碼序列； (2)利用軟件生成抗WSSV的小RNA干擾分子； (3)按照已公布的小RNA序列設(shè)計(jì)規(guī)則，選擇一個(gè)理論上高效的小RNA分子； (3)把該siRNA構(gòu)建成shRNA分子，記為shWR。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效shRNA分子在抗WSSV中的應(yīng)用，包括將體重7～9g、PCR檢測陰性的健康南美白對(duì)蝦在室內(nèi)池塘?xí)吼B(yǎng)1周后，用胰島素注射器于南美白對(duì)蝦第四腹節(jié)的一側(cè)肌肉注射50μL/只shRNA分子，4h后于第四腹節(jié)的對(duì)側(cè)肌肉注射50μL/只WSSV感染液，在水溫27～28℃、每天換水1/2、24h持續(xù)充氣的條件下養(yǎng)殖，WSSV感染4天后檢測顯示，南美白對(duì)蝦體內(nèi)WSSV的增殖被shRNA高效抑制。本發(fā)明shRNA分子可顯著抑制WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的增殖，大幅降低WSSV感染蝦的累積死亡率，有效降低WSSV對(duì)對(duì)蝦組織的損傷，抗WSSV效率高、副作用小。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102643861SQ20121006396
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者萬夕和, 周俊芳, 房文紅 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所